Een High-gehalte In Vitro Eilandjes van Langerhans β-cel Replication Discovery Platform

Samenvatting

Cruciale uitdagingen voor het onderzoeksgebied diabetes zijn de moleculaire mechanismen die eilandje β-cellen replicatie en op werkwijzen voor het stimuleren van β-celregeneratie ontwikkelen begrijpen. Hierin een high-gehalte screening methode voor het identificeren en evalueren van de β-cel-replicatie bevorderende activiteit van kleine moleculen wordt gepresenteerd.

Samenvatting

Verlies van insulineproducerende β-cellen is een centraal kenmerk van diabetes. Hoewel er verschillende potentiële vervangende therapieën worden onderzocht, blijft de uitbreiding van endogene insulineproducerende pancreatische eilandjes β-cellen een aantrekkelijke strategie. β-cellen hebben een beperkte spontane regeneratieve activiteit; bijgevolg is een cruciale onderzoeksinspanning om een nauwkeurig begrip te ontwikkelen van de moleculaire paden die β-celgroei beperken en om geneesmiddelen te identificeren die in staat zijn deze beperkingen te overwinnen. Hier wordt een geautomatiseerde hoogwaardige beeldgebaseerde primaire celscreeningsmethode gepresenteerd om β-celreplicatie-bevorderende kleine moleculen te identificeren. Verschillende beperkingen van eerdere methodologieën worden overwonnen. Ten eerste, het gebruik van primaire eilandjescellen in plaats van een geïmmortaliseerde cellijn maximaliseert het behoud van in vivo groeirestricties. Ten tweede, het gebruik van gemengde samenstelling eilandje-celculturen in plaats van een β-cellijn maakt het mogelijk om zowel lijnbeperkte als algemene groei-stimulatoren te identificeren. Ten derde, maakt de techniek het praktisch om primaire eilandjes te gebruiken, een beperkte bron, door gebruik van een 384-well formaat. Ten vierde, wordt schadelijke experimentele variabiliteit geassocieerd met onregelmatige eilandje-cultuurkwaliteit overwonnen door optimalisatie van isolatie-, dispersi-, platerings- en cultuurparameters. Ten vijfde, de moeilijkheden om de lage basale replicatiesnelheid van eilandje-endocriene cellen nauwkeurig en consistent te meten, worden overwonnen met geoptimaliseerde immunokleuringparameters, geautomatiseerde data-acquisitie en data-analyse; automatisering verbetert tegelijkertijd de doorvoer en beperkt de experimentatorbias. Opmerkelijke beperkingen van deze assay zijn het gebruik van verspreide eilandje-culturen die de eilandje-architectuur verstoren, het gebruik van knaagdier- in plaats van humane eilandjes en de inherente beperkingen van doorvoer en kosten geassocieerd met het gebruik van primaire cellen. Belangrijk is dat de strategie gemakkelijk kan worden aangepast voor humane eilandje-replicatiestudies. Deze assay is goed geschikt voor het onderzoeken van het mitogene effect van stoffen op β-cellen en de moleculaire mechanismen die β-celgroei reguleren.

Inleiding

Diabetes omvat een verzameling van aandoeningen delen de gemeenschappelijke eindpunt van verstoorde glucose homeostase. Hoewel de pathogene mechanismen van diabetes subtypen worden onderscheiden, delen ze het gevolg van verminderde β-celmassa, bijvoorbeeld, verlies van insulineproductie capaciteit ^1,2. Momenteel diabetes behandelingsstrategieën vertrouwen op chronische toediening van exogeen insuline, farmacologische stimulering van insulineproductie of verbetering van de insulinegevoeligheid, en zelden, de transplantatie van pancreaseilandjes of hele alvleesklier ^3,4. Helaas, het succes van deze strategieën is van korte duur en / of niet voldoende herhalen de functie van endogene productie van insuline. Ondanks het nut van het ontwikkelen van een werkwijze voor β-celregeneratie te stimuleren, bestaat een dergelijke benadering. Bijgevolg is een belangrijk onderzoek naar diabetes doel is om methoden te ontwikkelen om nieuwe β-cellen te genereren of om endogene β-cell mass ⁵ uit te breiden . Hoewel β-celregeneratie uit hernieuwbare bronnen zoals embryonale stamcellen is het bevorderen, veiligheid en efficiëntie betreft maakt het nastreven van alternatieve strategieën, met inbegrip van de uitbreiding van rijpe β-cellen, een prioriteit ^6,7. Belangrijk is dat de belangrijkste bron van nieuwe β-cellen in vivo bestaande β-cellen in plaats van gespecialiseerde progenitorcellen ^8,9. Hoewel β-cellen blijken beperkte replicatie capaciteit, een kleine toename van β-celmassa hebben (~ 30%) kan voldoende zijn om glucose homeostase te herstellen in vele diabetici. Verder in situ farmacologische stimulering van β-celmassa is een potentieel goedkope en schaalbaar behandelingsstrategie. Hierin a high content werkwijze voor het identificeren en karakteriseren van kleine moleculen die de groei β-cellen stimuleren gepresenteerd.

Verscheidene in vitro experimentele werkwijzen kunnen worden gebruikt om genproducten en / of moleculen tha identificerent bevorderen primaire β-cel-replicatie. Vroege inspanningen voor het meten van β-cel-replicatie inductie gebruikt foetale knaagdier alvleesklieren cultuur of intacte geïsoleerde eilandje culturen te meten ^[3 H] thymidine, BrdU incorporatie of mitotische instanties binnen de aldehyde-thionine of insuline gebeitst bevolking in reactie op de specifieke behandeling voorwaarden ^{10, 11.} Deze in vitro benaderingen en dicht varianten daarvan hebben een aantal beperkingen. Prominente deficiënties omvatten (1) het gebruik van foetale cellen die in tegenstelling tot rijpe β-cellen vertonen een hoge basale β-cel replicatiesnelheid en zijn groei gereguleerd een onderscheidende wijze ^12; (2) de persoonlijke aard van de experimentator-afhankelijke berechting van β-cel-replicatie gebeurtenissen; (3) de arbeids- en tijdrovende karakter van de experimentator-afhankelijke tellen van β-cel-replicatie gebeurtenissen vertraagt ​​experimentele throughput; (4) het gebruik van nucleaire inbouw / vlek / verschijning aan replicatie zelfs te identificerents en een niet-overlappende cytoplasmatische vlek β-cellen te identificeren leidt tot onterechte opname van nabij non-β-cel replicatiegebeurtenissen aan P-cellen.

Recenter rijpe primaire β-cellen werden gebruikt om het effect van transgene overexpressie alsmede genproduct of samengestelde behandeling op β-celdeling ^13-16 beoordelen. Echter, deze studies ook ingeroepen subjectief tellen van replicatie gebeurtenissen, cytoplasma staining- of niet-specifieke methoden voor β-cell identificatie en / of arbeidsintensieve stappen die throughput te beperken, bijvoorbeeld afzonderlijke dia-en beplating van cellen of intacte eilandje paraffine inbedding en ¹⁷ verwerking. Met name, een beeld-gebaseerde humane β-celdeling screening methode, vergelijkbaar met de hierin gepresenteerde, is gepubliceerd ^18; echter succesvol gebruik van deze assay niet aangetoond en het gebruik van menselijke eilandjes voor primaire screening niet ruim worden fealijk.

Een alternatieve strategie voor het identificeren van replicatie-bevorderende stoffen naar groei inductie van β-cellijnen te beoordelen. Initiële inspanningen gebruikt getransformeerde β-cellijnen zoals MIN6 cellen of INS 832/13-cellen ^14,19-21. Echter, deze cellijnen demonstreren ongebreidelde groei en dragen weinig gelijkenis met goed gedifferentieerd β-cellen ^22. Bijgevolg groei-inductie capaciteit is minimaal, onduidelijke relevantie en soms moeilijk te recapituleren. Een verbeterde strategie cellijn screening maakt gebruik van "reversibel getransformeerde" cellen die groei aangehouden in de afwezigheid van tetracycline (doxycycline) -afhankelijke SV40 T antigen expressie ^23,24 zijn. Het is echter onduidelijk of deze cellen terugkeren naar een "normale" β-cel-achtige toestand na verwijdering doxycycline. Helaas, gebruik van deze cellen heeft opgeleverd algemene groeibevorderende stoffen die niet op onmiddellijk nut hebben24. Kortom, het gebruik van cellijnen groeiregulatie van een celtype weergave minimale spontane replicatie -activiteit kan beperkte toepasbaarheid hebben.

De β-cel-replicatie screening platform hierin gepresenteerd maakt gebruik van volwassen primaire rat β-cellen te behouden in vivo groei regelgeving voor zover mogelijk, eilandje-celkweken van gemengde cel-type samenstelling om identificatie van-lijn beperkt groeibevorderende activiteiten mogelijk te maken, multi -goed formatteren om de doorvoer en geautomatiseerde analyse te maximaliseren om vertekening te elimineren en de doorvoer te vergemakkelijken. Succesvol gebruik van dit platform is de identificatie van een aantal verbindingen die β-celdeling ^25,26 bevorderen ingeschakeld. Daarnaast is de test is gebruikt voor de structuur-activiteit relatie studies en chemische epistasie experimenten om mechanistische inzichten in de moleculaire regulatie van β-cel-replicatie bieden. De gepresenteerde platform is met succes aangepast for lentivirale RNAi-based onderzoek naar β-celdeling trajecten ^25. Beperkingen van de test omvatten geblokkeerde schaalbaarheid (gebruik van primaire cellen), gebruik van knaagdier plaats menselijke eilandjes-cellen (hoewel de test kan worden aangepast voor menselijk eilandje studies), kosten in verband met antilichamen gebaseerde beeldvorming en primaire eilandje gebruik, het gebruik van verspreide eilandjes (verstoord eilandje architectuur) om geautomatiseerde image Acquisition en de afhankelijkheid van de beschikbaarheid van een geautomatiseerde microscoop met het verwerven en analyseren vermogen vergemakkelijken. Hoewel een gemakkelijke in vivo screening methode voor het identificeren van genproducten of verbindingen die β-cel regeneratie in situ te stimuleren zou ideaal zijn, zoals een platform is nog niet beschikbaar ^27. Bijgevolg is de beschreven platform is geschikt voor onderzoeker geïnteresseerd in het onderzoeken van de meeste aspecten van β-cel-replicatie.

Protocol

Dit protocol werd uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Stanford University School of Medicine uitgevoerd. De beschreven protocol wordt opgeschaald voor eilandje isolatie van zes 250-300 g (8-9 weken oude) mannelijke Sprague Dawley-ratten, die voldoende is om 228 putjes van een 384-wells plaat eilandjes celdeling assessment genereren.

1. Materiaal Voorbereiding

1. Bereid coating media voorafgaand aan het initiëren eilandje isolement door het verzamelen van de geconditioneerde media van 804G rat blaas carcinoma cellen gehandhaafd op samenvloeiing gedurende 3 dagen (20 ml RPMI1640) in een 15 cm weefselkweek schotel ^28. Steriel filter en opslag (-20 ° C) geconditioneerde media voor later gebruik.
2. Steriliseren chirurgische instrumenten (een 12 cm getande weefsel tang, een 11,5 cm fijn schaar, een 14,5 cm chirurgische schaar, twee 16 cm gebogen pincet, een 12 cm gebogen hemostat, een 12 cm scalpel handvat) en een 30 mesh weefsel zeef voorafgaand aan initiating eilandje isolement.
3. Bereid pancreatische digestie oplossing door het oplossen van een 60%: 40% mengsel van gezuiverde klasse I: klasse II collagenase (totale collagenase activiteit van 300.000 - 400.000 eenheden) in 60 ml 1 x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), aangevuld met calcium en magnesium. Load 10 ml van de pancreas spijsvertering buffer in 10 ml spuiten (zes) met een 1 "22 G naald en leg ze op ijs.
   Opmerking: 10 ml ontsluitingsoplossing geïnjecteerd per rat. Schaal dienovereenkomstig.
4. Bereid 4,5 ml anestheticum cocktail in een zuurkast door het mengen van 1,3 ml ketamine (100 mg / ml), 0,2 ml xylazine (100 mg / ml) en 3 ml PBS. Bereid de verdoving cocktail binnen 1 uur van het initiëren eilandje isolement.
5. Bereid wasbuffer door toevoeging van 25 ml van pasgeboren kalfsserum tot 500 ml HBSS. Plaats wasbuffer op ijs voor later gebruik.
6. Bereid 1 fles eilandje medium dat 500 ml van laag glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 50 ml foetaal runderserum (FBS), 5000 eenheden / ml penicilline en 5000 ug / ml streptomycine.
7. Bereid eilandje functie medium van functionaliteit / levensvatbaarheid oplossing (500 ml) met 2% FBS, 2 mM glutamine, 5 mM glucose, 5000 eenheden / ml penicilline en 5000 ug / ml streptomycine. Bewaar het eilandje functie media (4 ° C) voor later gebruik.
8. Bereid 40 ml blokkerende buffer door toevoeging van 2,5 ml donkey serum en 0,12 ml Triton X-100-37,38 ml 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Store blokkerende buffer (4 ° C) voor later gebruik.
9. Het verkrijgen van de benodigde antistoffen voorafgaand aan het initiëren van het protocol.
   Opmerking: PDX-1 (TRITC) en Ki-67 (FITC) co-kleuring wordt gebruikt voor primaire β-celdeling screening. Voor lineage-specifieke replicatie analyse uit te voeren immunofluorescentiekleuring voor een extra cel identiteit markers (insuline, glucagon, vimentine en somatostatine; TRITC) samen met kernenergie (DAPI), PDX (Cy5) en Ki-67 (FITC) kleuring. alternatieve repmaking markers, bijvoorbeeld PCNA, kunnen eveneens worden gebruikt.
10. Bereid een 228-well behandelplan met elke behandeling aandoening uitgevoerd in viervoud. Inclusief positieve- (5-Iodotubercidin [1 uM] of dipyridamol [15 pm]) en voertuig-control (DMSO 1: 666 verdunning) putten.

2. Perfusie van de alvleesklier

1. Verdoven ratten door ip injectie van verdund anestheticum cocktail oplossing (0,30 ml / 100 g lichaamsgewicht). Zodra de rat is volledig verdoofd en reageert op schadelijke stimuli, uit te voeren cervicale dislocatie.
2. Plaats de rat gedood in rugligging (craniale-caudale richting) op een stapel papieren handdoek en spuit de buikstreek met 70% ethanol.
3. Open de buikholte van een U-incisie (base bij schaamstreek) en schuif huid in de rostrale richting over de borst te buikholte bloot.
4. pak voorzichtig de twaalfvingerige darm met behulp van twee paar gebogen pincet, zoek de twaalfvingerige darm ingang van de gemeenschappelijke bile kanaal (sfincter van Oddi) en klem de duodenale opening aan de papil met een gebogen hemostaat.
5. Til de gebogen hemostaat gebruikt om de galbuis papilla klem en pak de galwegen in de buurt van de lever met behulp van een gebogen pincet. Stompe dissectie met de gebogen forceps te isoleren en bloot de galwegen.
6. Plaats de rat met het hoofd proximale en de distale voeten.
7. Canule de galbuis (CBD) op of net distaal van de kruising van de blaas en hepatica kanalen met een pancreas verteringsoplossing -geladen 10 ml spuit en injecteer langzaam 10 ml van de pancreas ontsluitingsoplossing. Tijdens het injecteren, ondersteuning van de CBD met een scalpel handvat. Verplaats de naald als het kanaal en de alvleesklier niet op te blazen.
8. Verwijder de opgeblazen pancreas met de gebogen pincet en fijne schaar te scheiden van de dalende dikke darm, ingewanden, maag en milt. Plaats de opgeblazen alvleesklier op ijs in een 50 ml buis met 5 ml pancreatische digestie oplossing.
   NB: Voor een maximale opbrengst eilandje, verzamel alle pancreata binnen 30 minuten plaats en slechts 1 of 2 alvleesklieren in elke 50 ml spijsvertering buis.

3. Dissociatie van de alvleesklier

1. Zodra alle alvleesklieren worden verzameld, plaatst u de spijsvertering buizen in een 37 ° C waterbad gedurende 15 min. Zwenk de buizen om de 3 min.
2. Na 15 min, krachtig schudden (verticaal) de buizen 10 keer en voeg 10 ml koud wasbuffer. Schud de buizen een extra 5 keer en plaats op ijs.
3. Vul het spijsvertering buizen tot 50 ml met koude wasbuffer en mix door het omkeren buizen 5 keer.
4. Centrifugeer de buizen bij 97 xg bij 4 ° C gedurende 1 min en giet het supernatant. Wees voorzichtig niet om het ingehulde weefsel te verwijderen.
5. Voeg 25 ml wasbuffer en resuspendeer het weefsel door voorzichtig vortexen. Herhaal stap 3.4 en 3.5 nog twee keer.
6. Plaats een 30 mesh weefsel zeef over een sterile bekerglas van 250 ml en giet het weefsel schorsing op de zeef. Spoel de spijsvertering buis met een extra 20 ml wasbuffer en giet op het gaas. De onverteerd pancreas en vetweefsel verwijderd bij deze stap.
7. Giet het gefilterde materiaal in twee verse 50 ml buis en pellet het weefsel door het draaien bij 97 xg gedurende 1 min bij 4 ° C. Giet supernatant en omkeren buisjes om overtollig buffer uitlekken.

4. Zuivering van eilandjes

1. Voeg 20 ml koud polysucrose / natrium diatrizoaat oplossing (1,119 g / ml dichtheid) aan de gepelleteerde pancreas weefsel. Homogeen resuspendeer de inhoud van elke buis door zachtjes en neer te pipetteren vijf keer.
2. Voorzichtig overlay de polysucrose / natrium diatrizoaat oplossing met 10 ml HBSS. Zorg voor een scherpe vloeistof-interface door het langzaam toevoegen van de HBSS langs de buiswand.
3. Centrifugeer de gedigereerde pancreata bij 560 xg gedurende 15 min (4 ° C) met langzame versnelling en zonder rem.
4. Collect het eilandje laag van de interface met behulp van een 10 ml pipet en plaats eilandjes in verse 50 ml buizen. Do eilandjes niet bundelen in dit stadium.
5. Voeg 40 ml wasbuffer aan elk 50 ml buisje en centrifugeren gedurende 1 min bij 140 xg bij 4 ° C.
6. Giet het supernatant en resuspendeer samengevoegd eilandjes in 50 ml wasbuffer met een paar keer omkeren van de buizen. Centrifugeer de buizen gedurende 1 min bij 97 xg bij 4 ° C om eilandjes te verzamelen in een pellet.
7. Giet het wasbuffer en herhaal het wassen. Breng eilandjes in de weefselkweek kap en zuig het supernatant.
8. Resuspendeer elk buisje eilandjes in 6 ml eilandje medium.
9. Breng de eilandjes van elk 50 ml buis in een putje van zes-putjes weefselkweekplaat. Zwenk de 6-putjes op eilandjes verzamelen in het midden van de put en observeren eilandje kwaliteit en zuiverheid onder een microscoop.
10. Handmatig verzamelen eilandjes met een 1 ml pipet overgebracht geplukte eilandjes in de naastliggendeputje met 6 ml eilandje media. Herhaal eilandje wervelende plukken tot> 90% zuiverheid wordt verkregen.
11. Breng de gezuiverde eilandjes een 10 cm weefselkweek schaal bevattende 20 ml medium eilandje.
12. Plaats eilandjes in een weefselkweek incubator (37 ° C, _5% CO2) gedurende de nacht (Figuur 1A).
13. Ter voorbereiding van plating eilandje cellen, de vacht van de putjes van een 384-wells plaat met 40 ul van 804G geconditioneerde media per goed. Incubeer overnacht in een weefselkweek incubator.

5. Verspreiding en Plating van Islet Cells

1. De volgende dag, voorzichtig los eilandjes van de 10 cm schaal met een cel schraper en breng de eilandjes in een 50 ml buis.
2. Pellet de eilandjes door centrifugatie gedurende 1 min bij 22 xg bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant.
3. Spoel de eilandjes met 20 ml warme PBS en decanteer zoals hierboven.
4. Re-schorten eilandjes in 0,25% trypsine (150 ul per rat pancreas) En incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Pipet eilandjes op en neer 10 keer met behulp van 1 ml pipet na 5 en 10 min incubatie.
5. Na 10 min, evalueert een 20 pl monster van de trypsine eilandjes onder de microscoop om volledige digestie verzekeren en het eilandje cellen te tellen met een hemocytometer. Als onverteerd eilandjes blijven verder incuberen gedurende nog 3-5 min en pipet op en neer 10 keer. Indien nodig herhalen.
   Let op: De typische opbrengst bedraagt ​​~ 125.000 - 150.000 eilandjes van Langerhans-cellen per rat.
6. Verwijder 804G-geconditioneerde media gecoate 384-wells plaat uit de incubator en verwijder de media met behulp van een 12-well spruitstuk aspirator.
7. Schorsen eilandje cellen bij een dichtheid van 45.000 cellen per ml in medium Islet functie en plaat 70 pl (3150 cellen) per putje met een multichannel pipet (Figuur 1B).
   Opmerking: Omdat β-cellen in de buitenste putjes neiging om te migreren naar de omtrek van de plaat gebruik rijen C en N kolommen 4tot 21-228 putjes met het eilandje cellen geïsoleerd uit 6 ratten bord.
8. Plaats de plaat in de weefselkweek incubator gedurende 48 uur celadhesie mogelijk.

6. Islet cel Cultuur Treatment, Fixatie en kleuring

1. Bereid 200 pl medium en verbindingen (behandelingsomstandigheden worden uitgevoerd in viervoud) in een 2x concentratie in functie Islet medium. Regelen verbindingen in een steriele 96-putjes multi-well pipetteren vergemakkelijken.
2. Verwijder voorzichtig eilandje medium met een 12-well spruitstuk aspirator en te vervangen door eilandje functie medium (35 ul / putje) met behulp van een 12-well pipet. Verwijderen en media uit een rij te vervangen in een tijd om het risico van het drogen (figuur 1C) te beperken.
3. Initiëren behandeling door de overdracht van 35 ul / putje van de 2x samengestelde oplossingen. Keerplaat naar de incubator gedurende de duur 48 uur behandeling.
4. Na 48 uur van de behandeling, decanteren de behandeling media door het omkeren van de plaat.
5. Voorzichtig te wassen het eilandje cellen met 50 ul per putje van 1x PBS (1 min). Voeg de PBS een multi-kanaal pipet.
6. Decanteer de PBS en de cellen vast door toevoeging van 50 ul per putje van koude 4% paraformaldehyde (PFA) verdund in 1 x PBS. Incubeer cellen gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
7. Was de cellen drie keer (5 min elk) door het omkeren van de plaat om de PFA te verwijderen en voorzichtig toevoegen van 60 pi PBS per putje zoals hierboven.
8. Bereid 15 ml antigeenterugtrekking oplossing door het mengen van 14,25 ml formamide en 0,75 ml 0,15 M natriumcitraat (pH 6). Maak de antigen retrieval oplossing onmiddellijk voor gebruik.
9. PBS verwijderen uit putten door omkeren van de plaat en voeg 60 ul antigen retrieval oplossing in elk putje. Verwarm de plaat in 70 ° C waterbad gedurende 45 min. Plaats een verwarmingsblok bovenop de plaat tijdens deze incubatie om kromtrekken van de plaat met meerdere holtes voorkomen.
   Let op: Het water moet halverwege de plaat rok zijn; de plaat mag niet worden ondergedompeld.
10. Verwijder de plaat uit waterbad en laat deze afkoelen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de plaat niet wordt vervormd door visuele inspectie.
11. Was de cellen met 60 ul per putje van 1x PBS drie keer (5 min elk). Voeg PBS met een multi-channel pipet en decanteer PBS door het omkeren van de plaat.
12. Gebruik een multi-channel pipet 40 ul per putje toevoegen van blokkerende buffer en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de blokkerende buffer door het omkeren van de plaat en decanteren.
13. Voeg 40 ul van muizen anti-humaan Ki-67 (1: 200) en geit anti-humaan PDX-1 (1: 100) antilichamen verdund in blokkerende buffer aan elk putje en incuberen bij 4 ° C overnacht.
14. De volgende dag, giet het antilichaam-oplossing en was de cellen met 1x PBS driemaal (5 min elk) zoals hierboven beschreven. Schenk de PBS.
15. Voeg 40 ul per putje van verdund (1: 200) gebiotinyleerd ezel anti-muis IgG en rhodamine-geconjugeerd ezel anti-geit IgG in blokkeerbuffer. Incubeer gedurende 1 uurop kamertemperatuur.
16. Was de cellen met 1x PBS driemaal, 5 minuten elk. Voeg 40 pl verdund (1: 400 in blokkerende buffer) fluoresceïne geconjugeerd streptavidine aan elk putje. Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur.
17. Was de cellen met 1x PBS driemaal, 5 minuten elk. Voeg 40 ul per putje van DAPI (300 nM in blokkeerbuffer) en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
18. Was de cellen met 1x PBS tweemaal en laat cellen in 40 pl 1x PBS. De plaat is nu klaar om te worden geanalyseerd.

7. β-Cell Replication Analyse

Opmerking: Een test protocol moet worden vastgesteld voor het hoge gehalte screening microscoop gebruikt om β-celdeling te meten. In zijn eenvoudigste samenstelling, dit protocol Twee-color assay waarbij een identiteit marker wordt gebruikt om β-cellen te bepalen (PDX-1 ⁺ -cellen) en een replicatie marker (Ki-67) wordt gebruikt om celdeling gebeurtenissen definiëren.

1. Identificeer voorwerpen (β-cellen) op basis van de average fluorescentie-intensiteit van PDX-1 kleuring (549 nm filter) binnen ongeveer een cirkel (lengte: breedte <1.6) binnen de verwachte pixel gebied van een β-celkern (Figuur 2A).
2. Vervolgens stellen instellingen replicatiegebeurtenissen (Ki-67-positiviteit) op basis van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (485 nm filter) in de PDX-1 ⁺ gebied (figuur 2B) te identificeren.
   Opmerking: Exposure tijden moet worden vastgesteld om pixel intensiteit vergelijkingen tussen beelden mogelijk te maken. Assay protocol parameters worden ingesteld, zodat de machine oproepen consequent uit te sluiten specifieke kleuring, puin en mobiele aggregaten die negatief zou kunnen beïnvloeden kwaliteit van de gegevens.
3. Analyseer minste 500 β-cellen per putje nauwkeurigheid en beperken variabiliteit maximaliseren.
   Opmerking: De basale β-celdeling index rat eilandjes culturen verwachting 0,5 te zijn - 3%. Gewoonlijk 40 beelden per putje is meer dan voldoende om 500 β-cellen te identificeren.
4. Voorafgaand aan de analyse van dehele plaat, analyseren geselecteerde negatieve- (-DMSO behandeld) en positieve controle (5-iodotubercidin [1 uM] of dipyridamol [15 pm])-behandelde putten om de geldigheid van de test protocol te beoordelen. Wanneer de test correct is ingesteld, positieve controle verbindingen veroorzaken ten minste een tweevoudige verhoging van het percentage van β-replicerende cellen.
5. Lees de hele plaat zodra de test protocol wordt gevalideerd.

Resultaten

Om β-cel of α-cel-replicatie te beoordelen, is een vier kleuren assay protocol vereist. Eerst worden objecten geïdentificeerd met DAPI kleuring (kanaal 1, 386 nm). Vervolgens β-cellen (event 1) worden geteld: objecten die co-express PDX-1 ⁺ (kanaal 2, 650 nm) en peri-nucleaire insuline (kanaal 3, 549 nm). Vervolgens replicerende β-cellen (event 2) geteld: P-cellen (event 1) dat co-express Ki-67 (kanaal 4, 485 nm) (figuur 3). Het percentage van het repliceren v...

Discussie

Experimentele methoden voor het bestuderen van de moleculaire pathways dat de groei van β-cel en regeneratie onder controle zijn belangrijke hulpmiddelen voor diabetes onderzoekers. Hierin, een rat-eilandje-based screening platform voor het identificeren en karakteriseren van kleine moleculen stimulatoren van β-cel-replicatie wordt gepresenteerd.

Terwijl de meeste aspecten van dit protocol gemakkelijk worden uitgevoerd door ervaren onderzoekers, een paar stappen vereisen bijzondere techniek....

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
250 g male Male Sprague Dawly Rat	Charles River	Stain # 400
12 cm teeth tisuue forceps	Fine Science Tools	11021-12
11.5 cm fine scissors	Fine Science Tools	14058-11
14.5 cm surgical scissors	Fine Science Tools	14001-14
16 cm curved forceps	Fine Science Tools	11003-16
12 cm curved hepostat	Fine Science Tools	13011-12
12 cm scalpel handle	Fine Science Tools	10003-12
Tissue sieve-30 mesh	Bellco Glass	1985-85000
Cizyme RI, 375,000 CDA units	VitaCyte	005-1030
Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++)	Gibco	24020-117
Ketamine HCl (200 mg/20 ml)	JHP Pharmaceuticals	NDC# 42023-113-10	om anesthesiecocktail te maken
Xylazine (5 g/50 ml)	LLOYD	NADA# 139-236	om anesthesiecocktail te maken
Histopaque 1077	Sigma	H-1077	om histopaque 1100 te maken
Histopaque 1119	Sigma	H-1119	om histopaque 1100 te maken
Newborn Calf Serum 500 ml	Hyclone	SH30118.03
Hanks' Balanced Salt solution	Hyclone	SH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose	Hyclone	SH30021.01
Functionality/Viability Solution	Mediatech	99-768-CV
RPMI1640 media	Hyclone	SH30096.01	om geconditioneerd medium te maken
804G rat bladder carcinoma cell-line	Available upon request		om geconditioneerd medium te maken
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	26160
GlutaMax-I	Gibco	35050-061
Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)	MP Biomedicals	1670049
Formamide 500 ml	Fisher BioReagents	BP227-500
Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0)	Vector Laboratories	H-3300	om 0,15 M Natriumsitraat oplossing te maken
Dextrose, Anhydrous	EMD Chemicals	DX0145-1	om 1 M glucose oplossing te maken
Nomal Donkey Serum (Powder)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
Mouse anti-human Ki67 antibody	BD Biosciences	556003
Goat anti-human PDX-1 antibody	R&D Systems	AF2419
Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody	Dako	2016-08
Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody	Dako	2014-06
Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody	Dako	2011-08
Polyclonal chicken anti-vimentin antibody	abcam	ab24525
Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	715-065-150
StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated	Invitrogen	S32354
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG	Jackson ImmunoResearch	705-025-147
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG	Jackson ImmunoResearch	706-025-148
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	711-025-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG	Jackson ImmunoResearch	706-175-148
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG	Jackson ImmunoResearch	705-175-147
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	711-175-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG	Jackson ImmunoResearch	703-175-155
DAPI	Millipore	S7113
Disposable Reagent Reservoir 25 ml	Sorenson BioScience	39900
384 well, black/clear, tissue culture treated plate	BD Falcon	353962
96 well, black/clear, tissue culture treated plate	Costar	3603
Multi-channel pipettor	Costar	4880
12-channel vaccume aspirator	Drummond	3-000-096
Cell Scraper	Falcon	353085
Isotemp Water Bath Model 2223	Fisher Scientific
High-content screening instrument: ArrayScan VTI	Thermo Scientific