Bereiding van formaline gefixeerde paraffine-ingebed weefsel Cores voor zowel RNA en DNA-extractie

Samenvatting

Deze gewijzigde extractie protocol verbetert RNA en DNA opbrengst van meer doelgerichte regio's van belang in histopathologische weefsel blokken.

Samenvatting

Formaline-gefixeerd paraffine-inggebed weefsel (FFPET) vormt een waardevol, goed geannoteerde substraat voor moleculaire onderzoeken. Het nut van FFPET bij moleculaire analyse wordt bemoeilijkt door zowel de heterogene weefselsamenstelling als de lage opbrengsten bij het extraheren van nucleïnezuren. Een zoektocht in de literatuur onthulde een gebrek aan protocollen die deze problemen aanpakken, en geen die een gevalideerde methode toonden voor gelijktijdige extractie van RNA en DNA uit gebieden van belang in FFPET. Deze methode behandelt beide kwesties. Weefselspecificiteit werd bereikt door kankergebieden van belang op microscoopglazen in kaart te brengen en aantekeningen over te brengen naar FFPET-blokken. Weefselkernen werden gehaald uit gebieden van belang met behulp van 0,6 mm microarray ponsen. De extractie van nucleïnezuren werd uitgevoerd met behulp van een commercieel FFPET-extractiesysteem, met wijzigingen in de homogenisatie-, deparaffinisatie- en Proteinase K-digestiestappen om de weefseldigerheid te verbeteren en de opbrengsten van nucleïnezuren te verhogen. Het gewijzigde protocol levert voldoende hoeveelheid en kwaliteit van nucleïnezuren op voor gebruik in een aantal downstream-analyses, waaronder een multi-analyt genexpressieplatform, evenals reverse transcriptase gekoppelde real-time PCR-analyse van mRNA-expressie, en methylatie-specifieke PCR (MSP) analyse van DNA-methylering.

Inleiding

Genomic biomarker onderzoek wil moleculaire correlaten die nauwkeurig en betrouwbaar de status van de ziekte te geven, en wel in een klinisch bruikbare manier. ¹ Biomarker ontwikkeling is afhankelijk van retrospectieve analyse van goed geannoteerde weefselmonsters te identificeren. Zieke en normaal weefsel monsters worden opgeslagen, hetzij als vers ingevroren weefsel in gespecialiseerde biobanken of formaline gefixeerde in paraffine ingebedde weefsel (FFPET) blokken in de klinische archieven. Vers ingevroren weefsel zorgt voor de winning van hoogwaardige nucleïnezuren en is op grote schaal gebruikt in genomische ontdekking van biomarkers studies. ^2,3 echter minder weefselmonsters zijn verkrijgbaar in biobanken en het bestuderen van dergelijke weefsel introduceert een voorkeur voor grotere steekproeven, ongebruikelijke categorieën ziekte en patiënten gezien in gespecialiseerde centra met grotere vermogens bank weefsel. ⁴ FFPET daarentegen is de standaard methode voor opslag van zieke menselijke en dierlijke weefsels. Terwijl FFPET blokken te handhaven cellulaire morphology het fixatieproces verknopingen andere cellulaire bestanddelen nucleïnezuren. Verknoopt RNA en DNA herstelbaar, maar alleen in aangetaste, sterk gefragmenteerde vormen. ^5,6 Maar deze DNA- en RNA-fragmenten vatbaar zijn voor analyse door een groeiende reeks assays, met inbegrip van mRNA, DNA hypermethylatie en gerichte sequencing. ^7,8 Om deze mogelijkheid in de grote hoeveelheid en verscheidenheid aan FFPET voor onderzoek te benutten, is er behoefte aan een efficiënte en betrouwbare extractie protocol.

Een groot deel van biomarker onderzoek in het weefsel richt zich op kanker. Net als andere vormen van ziek weefsel, kankerweefsel blijkt vaak aanzienlijke regionale heterogeniteit in cel behoud en celtype. Aangezien biomarker onderzoek berust op het vermogen om bestanddelen van ziek weefsel met moleculaire eigenschappen correleren, een kritische stap in dit proces is de precieze oogsten van weefsel dat goed bewaard gebleven en verrijkt voor disease in studie. In FFPET worden twee verrijking technieken vaak gebruikt: laser capture microdissectie (LCM), en microtoom snijden. LCM maakt zeer gerichte weefsel oogsten en kan worden gebruikt om specifieke, goed bewaarde celtypen isoleren heterogene weefsels. ^9,10 echter LCM vereist dure apparatuur en onbetaalbaar tijdrovend voor grote aantallen monsters. Microtome snijden is een meer algemeen gebruikte proces waarbij dunne secties van FFPET blokken worden gesneden. ^11,12 Microtome gesneden secties bevatten vaak weefsel dat heterogeen is in cel behoud (bijv necrotische vs. goed bewaard gebleven) en compositie (bv kanker versus benigne parenchym) en derhalve leiden tot de homogenisering van moleculaire eigenschappen best afzonderlijk onderzocht. Er is dus een behoefte aan een high throughput methode die verrijkt voor cellen van belang. Een derde methode, isolatie van nucleïnezuren uit FFPET kernen, biedt deze verrijking, geschikt voor hoge throughput protocollen, en is gebruikt door andere RNA of DNA uit afzonderlijke weefselkernen isoleren. ^7,13,14

Een aantal gepubliceerde protocollen die werkwijzen voor het extraheren van nucleïnezuren uit FFPET (tabel 1). Echter, protocollen waarbij RNA en DNA worden geëxtraheerd uit hetzelfde weefsel is geoptimaliseerd voor microtoom coupes, maar niet voor weefsel kernen. ^15,16 Ook gepubliceerde protocollen die bieden meer weefsel specificiteit, hetzij door middel van weefsel kernen of dia microdissections, specificeren procedures voor extractie van DNA, maar niet RNA. ^7,17 Hier een geoptimaliseerd protocol voor dubbele extractie van zowel DNA als RNA uit hetzelfde weefsel kern wordt aangetoond. Tissue kernen worden geoogst door het invoegen van tissue microarray (TMA) stoten in gebieden van belang in kaart gebracht op FFPET blokken. Het in kaart brengen wordt uitgevoerd door annoteren een microscoopglaasje met een markeerpen en overdracht van de annotatie bij het oppervlak van de overeenkomstige FFPET blok (figuur 1).

Voorafgaand werk dat leidde tot de ontwikkeling van dit protocol omvatte een vergelijking van verschillende commercieel verkrijgbare nucleïnezuur afzuiginstallaties. In deze vergelijking, wijzigingen van commerciële protocollen, zoals hieronder beschreven verschaft de hoogste DNA en RNA opbrengst en kwaliteit (Selvarajah et al., In prep). Tissue kernen zijn dikker dan de 5-10 micrometer micron secties meestal gebruikt in FFPET extractie protocollen ^{11,12,14,18 - 20,} en kunnen meer variabele hoeveelheden van paraffine bevatten. Om dit te compenseren, werd versterkt door het herhalen deparaffinisatie xyleen en ethanol behandelingen en door een gemotoriseerde homogenisatiestap (figuur 1). Verder werden proteinase K digestie keer verlengd DNA opbrengst te verhogen. Kortom, dit protocol is kosteneffectief en maakt het opzetten van verbindingen tussen moleculaire en histopathologische kenmerken van de ziekte bij laRGE, goed gekarakteriseerde populaties. Het protocol in zijn geheel kan worden uitgevoerd betrouwbaar binnen 2 dagen worden uitgevoerd, met inbegrip van 3 uur van de hands-on tijd met weinig behoefte aan speciale of dure apparatuur.

De stap-voor-stap protocol is hierna als een gemodificeerde versie van het protocol van de fabrikant. ²¹ Zie Tabel Materiaal / Apparatuur voor specifieke reagentia, apparatuur en fabrikanten.

Protocol

1. Tissue Coring

1. Geef je mening over de microscoop glijbaan en een overzicht van de regio ( 's) van de rente met een fijne punt permanent marker. Snijd een deel van paraffine film groot genoeg om de regio van de rente op de microscoop dia dekken. Plaats de film stevig op dia en wikkel film over randen om de film uit te glijden houden. Met behulp van een fijne punt permanent marker, een overzicht van de hele weefsel en de regio (s) van belang in het weefsel, waardoor de omtrek te raken - maar buiten - de regio ( 's).
2. Verwijder de film en mogelijk in de overeenkomstige weefselblokje. Oriënteren van de film door omkeren of draaien zodat de omtrek van het gehele weefsel overeenkomt met de waargenomen vorm van het weefsel in het blok (figuur 1). Op het gedeelte van de film stevig aan het oppervlak van het blok om slippen te voorkomen.
3. Met de punt van de viltstift, maak ondiepe maar toegankelijk (~ 0,2 mm) inkepingen langs de omtrek van het gebied (en) inlangstelling, verwijder de folie. Load 1 ml bleekwater, 70% ethanol, en water in afzonderlijke 1,5 of 2,0 ml microcentrifugebuizen.
4. Maak de receptor (rood) pons van de 0,6 mm punch door het schuiven van de stempel op en neer meerdere malen, terwijl de tip is ondergedompeld in de buis met bleekwater in te stellen. Herhaal de bovenstaande stappen met 70% ethanol en water (kritisch dat bleekmiddel waarborgen wordt verwijderd).
5. Drukt de stempel in het weefsel, in het gebied van belang tot een diepte van 3 mm en de stempel te trekken. Laat de kern in een lage bindend 1,5 of 2 ml buis door het uit van de stempel met de stylus te duwen. Bewaar de kernen bij -20 ° C (lange termijn) of 4 ° C voor korte termijn gebruik.
6. Maak de punch volgens stap 1.4 en ga verder met de volgende regio's of monster.

2. Deparaffinize de FFPE Tissue Cores

1. Ophaal- deparaffinisatie in 1,5 of 2 ml buizen door toevoeging van 1 ml xyleen aan het weefsel kern en vortexen krachtig gedurende 10 seconden. Heat gedurende 3 minuten bij 50 ° C.
2. Centrifugeer gedurende 2 min bij kamertemperatuur (RT) en maximale snelheid (21.130 xg) en breng buis op ijs gedurende 5 min (kan de wasachtige residu stollen op geplaatst).
3. Verwijder voorzichtig paraffine ophopende meniscus met bovenstaande vloeistof met een pipet tip en herhaal xyleen behandeling (stappen 2,1-2,2).
4. Voeg 1 ml ethanol (100%) en vortex krachtig gedurende 10 seconden. Centrifugeer gedurende 2 min bij RT (maximumsnelheid) en zorgvuldig ethanol ontdoen. Herhaal de bovenstaande stap eenmaal.

3. Homogenisatie van het paraffine ontdaan Cores

1. Resuspendeer de kernen in 700 gl ethanol (100%) voorafgaand aan homogenisatie. Met behulp van een gemotoriseerde tissue homogenisator, slijpen de kernen in fijne deeltjes weefsel (~ 1 min op matig instelling). Maak de homogenisator sonde tussen elk monster naar carry-over besmetting te minimaliseren.
   1. Vul 15 ml buizen met ~ 10 ml bleekmiddel, RNase neutraliserende oplossing en 70% ethanol. Na monster homogenization, was de probe homogenisator in elk van de reinigingsoplossingen in de volgorde hierboven vermeld. Run de homogenisator op de hoogste snelheid tijdens de wasfase.
   2. Veeg de sonde met een tissue en laat de sonde volledig opdrogen voordat homogeniseren van het volgende monster. Inspecteer de probe messen voor het resterende weefsel stukken. Indien gevonden, het reinigen van de sonde weer. Wijzig de reinigingsmiddelen (bleekwater, ethanol en RNase neutraliserende oplossing) per dag.
2. Na homogenisatie, het monster volume op 1 ml door het toevoegen van meer 100% ethanol (~ 300 pi). Centrifuge bij maximale snelheid gedurende 15 minuten voorzichtig zuigen ethanol en drogen pellet gedurende ongeveer 15-20 minuten alvorens RNA extractie.

4. Digestie met Proteinase K

1. Resuspendeer de pellet in 150 pl Proteinase K digestie buffer en buisje tikken om de pellet los te maken. Voeg 10 ul van de temperatuur-stabiele proteinase K en meng door de knop (nietvortex de buis). Incubeer de inhoud van de buis bij 56 ° C gedurende 15 minuten onder zacht roeren.
2. Sta buis incuberen op ijs gedurende 3 min. Volledige koeling is belangrijk voor een efficiënte neerslag in de volgende stap. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij maximale snelheid.

5. Afzonderlijke RNA uit DNA

1. Breng voorzichtig de supernatant zonder de pellet te verstoren om een ​​nieuwe 1,5 ml voor RNA-zuivering.
2. Houd de pellet voor DNA-zuivering (pellet kan worden opgeslagen gedurende 2 uur bij KT, gedurende tot 1 dag bij 2-8 ° C, of ​​gedurende langere tijd bij -20 ° C).

6. RNA Purification

1. Incubeer de RNA-bevattende supernatant bij 80 ° C gedurende 15 minuten (niet meer dan deze tijd). Vervolgens centrifugeer kort de buis druppels verzamelen vanuit de binnenzijde van het deksel.
2. Voeg 320 ul Buffer RLT bindende voorwaarden aan te passen, en meng door pipetteren. Voeg vervolgens 720 gl ethanol (100%) en vortex.
3. Transfer 600 pl van het monster, met inbegrip van die neerslag kunnen gevormd hebben, RNA Spin Column (in de kit) in een 2 ml verzamelbuis en vernietiging van het restgehalte. Centrifugeer gedurende 15 sec bij ≥8,000 xg, gooi de doorstroming en opnieuw de verzamelbuis.
4. Transfer resterende monster op een kolom, zoals druppels opeengehoopt in het deksel van de buis gecentrifugeerd gedurende 15 sec bij ≥8,000 xg en gooi het doorstroomkanaal.
5. Voeg 350 ul Buffer FRN de spinkolom en centrifugeer 15 sec bij ≥8,000 xg, gooi de doorstroming en opnieuw verzamelbuis.
6. Meng 10 ul DNase I voorraad oplossing met 70 ul Buffer RDD, rechtstreeks toe te voegen aan de spin kolom membraan, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
7. Voeg 500 ul buffer FRN de spinkolom, centrifugeer gedurende 15 sec bij ≥8,000 xg en sla het doorstroomkanaal voor gebruik in de volgende stap. Om het herstel van kleine RNA's verbeteren, plaatst de spin kolom in eennieuwe 2 ml verzamelbuis en breng het doorstroomkanaal van de voorgaande stap naar de spinkolom.
8. Centrifugeer gedurende 15 sec bij ≥8,000 xg, gooi het doorstroomkanaal en hergebruiken verzamelbuis in de volgende stap. Voeg 500 ul buffer RPE de spinkolom en centrifugeer 15 sec bij ≥8,000 xg, gooi het doorstroomkanaal en hergebruiken verzamelbuis in de volgende stap.
9. Voeg 500 ul buffer RPE de spinkolom en centrifugeer 15 sec bij ≥8,000 xg en gooi de verzamelbuis met het doorstroomkanaal.
10. Plaats de spinkolom in een nieuwe 2 ml verzamelbuis open te klappen en centrifuge bij maximale snelheid gedurende 5 minuten. Gooi de verzamelbuis met het doorstroomkanaal.
11. Plaats de spinkolom in een nieuwe verzameling 1,5 ml, voeg 20 gl RNase-vrij water direct op het membraan spinkolom en incubeer de buis gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Centrifuge bij maximale snelheid gedurende 1 minuut aan het RNA te elueren. Bewaar het geëlueerde RNA monster bij -80 ° C.

7. DNA Purification

1. Resuspendeer de pellet verkregen tijdens de RNA-extractie door stapsgewijze toevoeging van 45 ui proteïnase K-buffer (400 mM Tris 7,5, 400 mM NaCl, 3 mM _MgCl2, 4% SDS); 45 ui _H2O; en 400 ug van hoge potentie Proteïnase K.
2. Incubeer de bovenstaande oplossing bij 56 ° C gedurende 24 uur (aanbevolen) of overnacht. Performincubation bij 90 ° C gedurende 2 uur zonder roeren en kort gecentrifugeerd microcentrifugebuis druppels verzamelen van de binnenkant van het deksel.
3. Laat het monster afkoelen tot kamertemperatuur en voeg 4 pi RNase A (100 mg / ml). Incubeer het monster gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
4. Voeg 200 ul Buffer AL aan het monster, en meng goed door vortexen. Voeg vervolgens 200 ul 100% ethanol, en meng goed door vortexen. Breng het gehele monster de verstrekte spinkolom af in een 2 ml verzamelbuis en centrifugeer gedurende 1 min bij ≥8,000 x g.
5. Gooi de collectie buis met dedoorstroom en plaats de spinkolom in een nieuwe 2 ml verzamelbuis. Voeg 700 ul buffer AW1 de spinkolom, centrifugeer gedurende 15 sec bij ≥8,000 xg, gooi de doorstroming en opnieuw de verzamelbuis.
6. Voeg 700 ul buffer AW2 de spinkolom, centrifugeer gedurende 15 sec bij ≥8,000 xg, gooi de doorstroming en opnieuw de verzamelbuis. Voeg vervolgens 700 pl 100% ethanol aan de spinkolom, centrifugeer gedurende 15 sec bij ≥8,000 xg en gooi de verzamelbuis met het doorstroomkanaal.
7. Plaats de spinkolom in een nieuwe 2 ml verzamelbuis Open het deksel van de spin kolom en centrifugeer bij volle snelheid gedurende 5 minuten. Gooi de verzamelbuis met het doorstroomkanaal.
8. Plaats de spin kolom in een nieuwe 1,5 ml verzamelbuis en voeg 25 ul nuclease-vrij verwarmd water (50 ° C). Incubeer kolom en buis bij 50 ° C gedurende 10 minuten. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij maximale snelheid, voeg 25 ul nuclease-vrij water (RT) kolom en incubeer1 min bij kamertemperatuur.
9. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij maximale snelheid (21.130 xg) en oogsten doorstroom die genoom DNA (ongeveer 50 pl DNA in totaal). Bewaar de kolom bij -20 ° C (bij een elutie hoger vereist).

Resultaten

Dit protocol geeft een geoptimaliseerde werkwijze voor het terugwinnen van DNA en RNA uit weefsel kernen, gebruik modificaties van commerciële extractie ontworpen voor weefselcoupes. Optimalisatie onder meer de invoering van weefsel homogenisering, het gebruik van meer potente Proteinase K voor DNA-extractie, en uitbreiding van het weefsel spijsvertering tijd. Grafieken en statistische analyses inbegrepen 2-way ANOVA, lineaire regressie en correlatie.

Optimalisaties van Proteinase Spijsvertering
De commerciële kit inbegrepen kamertemperatuur stabiel proteinase K oplossing werd gesubstitueerd met een krachtiger proteinase K, resulteert in hogere opbrengst DNA (Figuur 2A). Verder verbeteren, DNA opbrengst werd uitgebreid digestie 2 tot 24 uur. Werden geen significante verschillen waargenomen tussen de twee tijdstippen, maar de 24 uurs spijsvertering bleek meer consistente rendementen over sa biedenmples. Echter, verdere incubatie bij 48 uur geen verdere verbetering DNA herstel (figuur 2B; p = 0,74).

Typische DNA Herstel van FFPE prostaatkanker Tissue Monsters

Met het geoptimaliseerde protocol, RNA en DNA werden samen geëxtraheerd uit 333 monsters prostaatkanker FFPET variërend van 3 tot 14 jaar oud monster. Van elk monster werden 3 weefsel kernen (gemiddelde totale volume weefsel van 0,95 ± 0,13 mm ³⁾ gebruikt als input. Terwijl er andere microfluïdische gel-elektroforese methoden die concentraties schatten hoeveel evaluaties van de grootteverdeling van nucleïnezuren moleculen zijn dergelijke methoden niet reproduceerbare nucleïnezuren kwantificering en kan geen onderscheid maken tussen RNA en DNA als flourometrically-gebaseerde testen doen. ²² En omdat microfluïdische gebaseerde gel-elektroforese resultaten niet betrouwbaar versnipperingnucleïnezuren afgeleid van FFPET, werden ²³ nucleïnezuur opbrengsten fluorometrisch gemeten (zie reagens lijst voor details). De gemiddelde opbrengst was 2270 ng RNA en 820 ng DNA (Figuur 3A). Ongeveer 90% van alle FFPET monsters geanalyseerd in deze studie leverde ≥100 ng DNA en ≥ 500 ng RNA. Interessant was er geen significante correlatie tussen de leeftijd van het monster en FFPET nucleïnezuur herstel (Figuur 3B). In totaal werden RNA en DNA opbrengsten correlatie te vertonen monsters (R ² = 0,39; p <0,0001), hoewel meer dan tweemaal RNA dan DNA uit elk monster (Figuur 3C) werd gewonnen.

Als de piloot en optimalisatie werk werd uitgevoerd op prostaat weefsels, is de volgende stap was om de prestaties van dit protocol op een aantal andere soorten archiefmateriaal weefsel te onderzoeken. Te beginnen met operatief verwijderd en autopsie FFPET monsters die zijnNign lever (1 monster van 1 geval), kanker van de hersenen (8 monsters van 1 geval), urineblaas (2 monsters van 2 gevallen) en borst (3 monsters van 3 gevallen), het protocol leverde> 100 ng DNA en RNA van 90% van de monsters (Figuur 3D). Terwijl nucleïnezuur opbrengsten lager in autopsie weefsels dan in chirurgische weefsels waren, representatieve resultaten geven aan dat het protocol produceert soortgelijke opbrengsten tegenover kankers afkomstig van verschillende sites.

Beoordeling van RNA en DNA Integriteit en hun vertegenwoordiger optreden in Downstream Analyse

RNA expressie van 47 genen in 8 geselecteerde FFPET prostaatkanker monsters en vers PC-3 prostaatkanker cellijn monster (als positieve controle) werd uitgevoerd met een commerciële multianalyte genexpressie platform dat is geoptimaliseerd voor FFPET. Het mRNA telt in PC3 waren doorgaans hoger dan die uit FFPET samples (Figuur 4A). Uit een vergelijking van relatieve expressie van alle genen, FFPET prostaatkanker monsters vertoonden gelijksoortige expressieprofielen PC-3 RNA, wat aangeeft dat beide bronnen van RNA geschikt voor RNA-expressieprofiel.

Om de prestaties van genomisch DNA geëxtraheerd met dit protocol te tonen, werden bisulfiet-geconverteerde DNA extracten FFPET monsters geamplificeerd door methylatie specifieke PCR (MSP). ²⁴ MSP analyse van ALU repetitieve elementen, sterk gemethyleerde gebieden aanwezig in miljoenen kopieën in het menselijk genoom, ²⁵ werd gebruikt als een genomische methylatie controle en wordt naar minimale verschillen tussen monsters tonen. Zoals getoond in figuur 4B, was er weinig tot geen verschil waargenomen tussen verschillende monsters ALU MSP methylatie niveaus. Verder MSP assays op basis van GSTP1, een gen waarvan bekend is dat gehypermethyleerd prostaatkanker, maar niet in monsters goedaardig, ²⁶ vertoonde geen detecteerbare versterker;nicatieorganisatie in DNA van goedaardige monsters. Zoals verwacht, waren lager qPCR cyclus drempelwaarden gedetecteerd in DNA van kanker weefsels, met vermelding van de verrijking van gemethyleerde GSTP1 exemplaren. Het nut van nucleïnezuren gewonnen door dit protocol werd verder getest in de typische downstream assays, met behulp van nucleïnezuren hersteld van goedaardige levertumoren en vanuit een brein (post-mortem) en van twee operatief verwijderd borstkanker monsters. Zowel RT-qPCR gebaseerde expressie en MSP assays presteerden goed op borstkanker en de lever FFPET, maar de RT-PCR-test niet in geslaagd een sterk tot expressie gebracht mRNA uit de post-mortem hersentumor monster (Figuur 4C) te versterken, wat suggereert dat RNA was gedegradeerd, waarschijnlijk vanwege vertraagde fixatie van het weefsel.

Figuur 1:. Overzicht van de Extraction procedure voor FFPET Samples De figuur laat zien hoe een gebied van belang in eenweefselblokje is toegewezen gebaseerd op histopathologische selectie uit een microscoopglaasje. Drie 0,6 mm weefsel kernen worden vervolgens uit elk weefsel gebied, verkregen door het gebruik van biopsie stoten, samen gehomogeniseerd en vervolgens onderworpen aan extractie van zowel RNA en DNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: nucleïnezuren (DNA en RNA) opbrengsten in ng / mm ³ van FFPET uit twee Proteinase K (temperatuur Stabiel en hoge potentie Enzymen), en getest in een heel scala van incubatietijden voor de laatste (A) Prestaties van Proteinase K. van verschillende leveranciers. DNA extracties werden uitgevoerd op een representatief monster met behulp van FFPET temperatuur stabiel enzym met de k meegeleverdeHet versus een meer potente enzym van een andere fabrikant. (B) Het bepalen van optimale Proteinase K incubatietijd de DNA opbrengst te maximaliseren. Prestaties van hoge concentratie Proteinase K digestie werd geëvalueerd op drie verschillende incubatie periodes middels 3 FFPET monsters. Fout balken geven standaardfout van het gemiddelde (SEM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3:. Nucleïnezuren (DNA en RNA) opbrengsten in ng / mm ³ van FFPET in Total, over Sample Years en vertegenwoordiger Tissue Types (A) Totaal teruggewonnen nucleïnezuren uit in formaline gefixeerde in paraffine ingebedde weefsel. De nucleïnezuren hoeveelheden is men uitgegaan van de extracties van 333 monsters FFPET uzingen de geoptimaliseerde protocol. (B) perceel Correlatie tussen herstelde totaal DNA en RNA en de leeftijd van FFPET monsters. De onttrokken FFPET monsters gebruikt werden verkregen uit de jaren 2000 tot 2012. (C) De correlatie tussen de rendementen van gelijktijdig geëxtraheerd DNA en RNA van 333 prostaat monsters. Er is een positieve correlatie tussen DNA en RNA opbrengst. (D) Demonstratie van het protocol met behulp van extra archivering soorten weefsel. De geoptimaliseerde protocol werd toegepast om nucleïnezuren te extraheren uit 14 kanker (borst, blaas en hersenen) en normaal (lever) monsters. Fout balken geven SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Prestatie van RNA en DNA co-geëxtraheerd uit Tissue Cores in Downstream Applications. (A) mRNA telt voor FFPE prostaatkanker weefsels en voor verse PC-3 cellijn controle. Elk punt is het gemiddelde van 3 technische replica afzonderlijk gewonnen. Fresh PC-3 cellijn RNA waarden worden geïllustreerd door gele balken en FFPET weefsel waarden worden vertegenwoordigd door gekleurde stippen. (B) Methylering specifieke PCR-tests op DNA van FFPET prostaatkanker monsters. Cyclus drempelwaarden werden verkregen voor 10 monsters uitgevoerd zoals verwacht gebruik 50 ng / reactie van bisulfiet geconverteerde DNA. ALU MSP assays uit alle FFPET monsters had soortgelijke cyclus drempelwaarden (p> 0,67). GSTP1 MSP assays vertoonden hogere methylatie (lagere cyclus drempel) niveaus bij prostaatkanker dan bij benigne prostaat. (C) Evaluatie van DNA- en RNA kwaliteit van andere weefseltypen. HPRT1 genexpressie en Alu methylatie gen werden onderzocht aan nucleïnezuren (RNA en DNA respectievelijk) geëxtraheerd uit nochmal lever (autopsie), en de hersenen (autopsie) en borstkanker (alle FFPET). Resultaten van prostaatkanker worden ter vergelijking getoond. Opmerking: vergelijkbare resultaten werden waargenomen uit elk weefseltype, behalve mislukte mRNA amplificatie van een autopsie monster. Elk punt of balk vertegenwoordigt een monster, en foutbalken vertegenwoordigen SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

tissue Cores
	Tissue Input (mm3)	Geëxtraheerd nucleïnezuur	bevestiging		Kwaliteitscontrole: DNA			Kwaliteitscontrole: RNA
			(# Monsters)	Leeftijd van Monster (jaar)	Total Yield (ng)	Fragmentgrootte (bp)	PCR	Total Yield (ng)	Fragmentgrootte (bp)	PCR	NanoString
Pikor et al.	43-129	DNA	Geen gegevens	Geen gegevens	Geen gegevens	Geen gegevens
Montaser-Kouhsari et al.	18-29,5	RNA	763	0-25				843	Geen gegevens
Dit papier	1.71	DNA en RNA	> 350	3-12	820	100-500		2270	100-500		/ftp_upload/54299/check_mark.jpg "/>
weefselcoupes
	tissue Input	Geëxtraheerd nucleïnezuur	bevestiging		Kwaliteitscontrole: DNA			Kwaliteitscontrole: RNA
			(# Monsters)	Leeftijd van Monster (jaar)	Total Yield (ng)	Fragmentgrootte (bp)	PCR	Total Yield (ng)	Fragmentgrootte (bp)	PCR	NanoString
Heikal et al.	5 x 5 urn	DNA	12	22/07	88-300	103-351
Chung et al.	1 x 20 um	RNA	9	> 5				16,000- 23.000	100-200
Antica et al.	2 x 4 pm	RNA	18	Geen gegevens				Onbekend (621 ng / ul)	80-202 +
Ghatak et al.	5 x 5 urn	DNA en RNA	5	1	14 256	<1030		16 000	109-400 +
Hennig et al.	1 x 10 pm	DNA en RNA	210	1-25	Geen gegevens	Geen gegevens		Geen gegevens	Geen gegevens
Lasermicrodissectie
	Tissue Input (mm2)	Geëxtraheerd nucleïnezuur	bevestiging		Kwaliteitscontrole: DNA			Kwaliteitscontrole: RNA
			(# Monsters)	Leeftijd van Monster (jaar)	Total Yield (ng)	Fragmentgrootte (bp)	PCR	Total Yield (ng)	Fragmentgrootte (bp)	PCR	NanoString
Sneeuw et al.	1-2	DNA	110	0-2	430	Geen gegevens

Tabel 1:. Een vergelijking van gepubliceerde DNA en RNA-extractie protocollen voor weefselkernen, profielen en laser capture microdissections Ook inbegrepen zijn verschillende moleculaire eindpunten beoordeling van deze werkwijzen met PCR en NanoString assays.

Discussie

Voor succesvolle extractie van DNA en RNA uit weefsel interessegebieden, nauwkeurige uitboren kritisch. Dit protocol beschrijft het gebruik van een weefsel stoot 0,6 mm diameter geleiders isoleren en schetst voor de overgang notaties van objectglaasjes aan overeenkomstige FFPET blokken. Modificaties het protocol van de fabrikant werden vereist om efficiënt extraheren van nucleïnezuren uit kernen, die ongeveer 50 maal dikker dan de microtoom gedeelten waarvoor het protocol was bedoeld. Aangezien de kernen meer paraffine opzichte van weefselcoupes, effectieve deparaffinisatie geleiders door herhaalde xyleen en ethanol behandelingsstappen kan bevatten nodig waren. Het succes van de post-deparaffinisatie stappen afhankelijk van de juiste mechanische weefsel kernen homogenisering en efficiënte proteinase K spijsvertering. Verdere optimalisatie van de proteinase K digestie kan worden uitgevoerd.

Vermeldenswaardig is dat deze methode identifies gebieden van de rente op het oppervlak van het blok, zoals geïdentificeerd in de overeenkomstige histopathologie dia's. Als de kern oogsten weefsel dat 3 of 4 mm diep kan zijn, kan de gebruikers van dit protocol bezorgd over wat cellen of weefsels te leggen onder het blok oppervlak. Hoewel dit een geldige zorg zijn meerdere studies (besproken in referentie ²⁷⁾ toonden aan dat weefselkernen nauwkeurig beeld van histologische en moleculaire kenmerken van pathologisch weefsel blokken, vooral wanneer duplo of triplo kernen worden getrokken uit het interessegebied.

Aangezien de gemodificeerde commerciële extractie dit protocol vastgesteld kit maakt gelijktijdige extractie van zowel DNA als RNA uit hetzelfde weefsel, het protocol spaart waardevolle biologisch materiaal en maakt een directe vergelijking tussen de twee resulterende nucleïnezuren uit hetzelfde monster. Concurrent extractie van RNA en DNA vermindert arbeid en weefseldepletie met de helft, en maakt een nauwkeurige geïntegreerde analyse van gen exprsessieschijven, alsmede epigenetische en genetische kenmerken in DNA. Omdat de opbrengsten van zowel RNA als DNA uit deze representatieve weefselkernen typisch meer dan 600 ng en 300, respectievelijk, en aangezien de meeste huidige PCR en next generation sequencing toepassingen vereisen typisch 10-100 ng dient meeste gezuiverd door dit protocol monsters voor adequate voor meerdere keren downstream assays. Dit protocol is aangetoond in onafhankelijke laboratoria reproduceerbaar zijn (Selvarajah et al., In prep.). RNA van dit protocol was voldoende kwaliteit voor genexpressie analyse met behulp van RT-PCR of populaire multianalyte platform en DNA presteerde goed in methylatie specifieke PCR assays. Toekomstige studies ter beoordeling van het nut van teruggewonnen nucleïnezuren in next generation sequencing worden gerechtvaardigd.

Zo werden een aantal wijzigingen aangebracht in een commercieel verkrijgbare protocol, ontworpen voor dunne FFPET secties, waardoor het geschikt for de co-extractie van RNA en DNA van 0,6 mm FFPET kernen. Het protocol aangetoond constant hoge rendementen in een groot cohort van prostaatkanker monsters en in een beperkt aantal monsters van kanker van de borst, de hersenen en de blaas. Over het algemeen moet het protocol gebruikers in staat gericht op genen gebaseerde analyses van grote, goed geannoteerde weefsel collecties uit te voeren. Belangrijk is dat de protocol maakt efficiënte gerichte bemonstering van gebieden van belang in FFPET relatief weinig praktische tijd, en zo hoog rendement voor de meeste verdere toepassingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Plastic paraffin film, "Parafilm 'M'"	Bemis	RK-06720-40	Elke generieke paraffinefilm werkt als alternatief
Sodium Hypochlorite, "Ultra Bleach"	Likewise	53-2879-2	Elke generieke bleekmiddel werkt als alternatief. Gevaarlijk materiaal dat bij contact brandwonden kan veroorzaken.
Molecular biology grade absolute ethanol	Fisher BioReagents	BP2818-500	Sigma-Aldrich E7023 volstaat als alternatief
Molecular Grade H2O	G-Biosciences	786-293	Sigma W4502 volstaat, evenals elke andere merk van moleculaire graad H2O
0.6 mm Punch Set voor Beecher Instruments	Estigen	MPO6[Yellow]	Zorg ervoor dat u de rode ontvanger punch uit het set gebruikt
Fine point permanente marker	Sharpie	10365796S	Het gebruik van de marker op FFPE weefsels zorgt ervoor dat deze snel opdroogt, dus er kunnen er meerdere nodig zijn
FFPE weefselblok
Gekleurde weefselslide overeenkomstig FFPE blok
1.5 ml Micro-Centrifugebuizen	Fisher BioReagents	05-408-137
2.0 ml Low binding buizen (LoBind Micro-Centrifugebuizen)	Eppendorf	22431048
1.5 ml Low binding buizen (LoBind Micro-Centrifugebuizen)	Eppendorf	22431021
Histology Xylene	VWR	CA 95057-822	Fisher Scientific X5-500 volstaat als alternatief
Molecular Biology Grade 2-Propanol	Sigma	I9516
AllPrep FFPE DNA/RNA Kit	Qiagen	80234	Bereid buffers voor volgens het AllPrep DNA/RNA FFPE Handleiding21
Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI oplossing	Qiagen	80234	Bereid buffers voor volgens het AllPrep DNA/RNA FFPE Handleiding21
Temperatuurstabiele proteinase K	Qiagen	80234
High potency proteinase K	Invitrogen	25530-049	Invitrogen 25530-015 volstaat als alternatief
RNAse neutraliserende oplossing (Rnase AWAY)	Molecular BioProducts	7003
RNaseA 100 mg/ml	Qiagen	19101
BD Integra Spuit 3 ml 21G x 1/2	BD	305274
Gemotoriseerde weefselhomogenisator (TissueRuptor)	Qiagen	9001271	Fisher Scientific 14-261-29 volstaat als alternatief
-20 °C en -80 °C Laboratoriumvriezer
Micro-Centrifuge met rotor voor 2 ml buizen
Digitale Vortex Mixer
Pipetten en filtertips
Verwarmingsblokken of waterbaden
Tris Hydrochloride	Amresco	0234
Sodium Chloride	Amresco	0241
Watervrij Magnesium Chloride	Sigma	M8266
Sodium Dodecyl Sulfaat	Sigma	L4509
Acrodisc 25 mm spuitfilters met 0.45 µm Supor membraan	Pall	PN 4614
Spuit met intrekbare BD PrecisionGlide naald 3 ml	BD Integra	305274
Hydrochloorzuur	BDH	3026
Multianalyt gene expressie platform (nCounter ® CAE codeset en Nanostring nCounter platform)	Nanostring nCounter platform, Nanostring
Fluorometrische nucleïnezuur kwantificering (Qubit dsDNA HS Assay Kit en Qubit® RNA BR Assay Kit)	Invitrogen