Meten In Vitro ATPase activiteit voor enzymatische Karakterisatie

Samenvatting

We beschrijven een basisprotocol voor het kwantificeren van in vitro ATPase-activiteit. Dit protocol kan worden geoptimaliseerd op basis van het activiteitsniveau en de vereisten voor een bepaalde gezuiverde ATPase.

Samenvatting

Adenosine-trifosfaat hydrolyserende enzymen, of ATPasen, spelen een cruciale rol in een breed scala van cellulaire functies. Deze dynamische eiwitten kunnen energie op te wekken voor het mechanisch werk, zoals eiwitten mensenhandel en degradatie, transport van opgeloste stoffen, en cellulaire bewegingen. De hier beschreven protocol is een eenvoudige test voor het meten van de in vitro activiteit van gezuiverde ATPasen voor functionele karakterisatie. Eiwitten hydrolyseren ATP in een reactie die resulteert in anorganisch fosfaat afgifte en de hoeveelheid fosfaat vrijgemaakt wordt vervolgens gekwantificeerd onder toepassing van een colorimetrische assay. Deze zeer flexibele protocol kan worden aangepast om ATPase-activiteit te meten in kinetische of eindpunt assays. Een representatief protocol is hier voorzien gebaseerd op de activiteit en vereisten van Epse, de AAA + ATPase betrokken type II Uitscheiding in de bacterie Vibrio cholerae. De hoeveelheid gezuiverde eiwit nodig te meten, lengte van de test en het tijdstip en het aantal sampling intervallen, buffer en zoutsamenstelling, temperatuur, co-factoren, stimulerende middelen (indien aanwezig), etc. kunnen afwijken van de hier beschreven en aldus sommige optimalisering nodig zijn. Dit protocol voorziet in een basiskader voor het karakteriseren ATPasen en kan snel worden uitgevoerd en gemakkelijk als nodig aangepast.

Inleiding

ATPases zijn integrale enzymen in veel processen in alle levenskoninkrijken. ATPasen fungeren als moleculaire motoren die de energie van ATP-hydrolyse gebruiken om diverse reacties aan te drijven, zoals eiwittransport, ontvouwen en assemblage; replicatie en transcriptie; cellulaire stofwisseling; spierbeweging; celbeweeglijkheid; en ionenpompwerking^1-3. Sommige ATPasen zijn transmembraaneiwitten die betrokken zijn bij het transporteren van opgeloste stoffen door membranen, andere zijn cytoplasmatisch en kunnen geassocieerd zijn met een biologisch membraan zoals het plasmamembraan of die van organellen.

AAA+ ATPasen (ATPasen geassocieerd met verschillende cellulaire activiteiten) vormen een grote groep ATPasen die enige sequentie- en structurele conservering delen. Deze eiwitten bevatten geconserveerde nucleotide-bindingsmotieven zoals Walker-A en -B boxen en vormen oligomeren (meestal hexameren) in hun actieve toestand¹. Grote conformationele veranderingen in deze eiwitten bij nucleotidebinding zijn gekarakteriseerd bij verschillende leden van de AAA+ familie. EpsE is een AAA+ ATPase en lid van de bacteriële Type II/IV secretie-subfamilie van NTPasen^4-6. EpsE drijft Type II Secretie (T2S) aan in Vibrio cholerae, de veroorzaker van cholera. Het T2S-systeem is verantwoordelijk voor de secretie van een grote verscheidenheid aan eiwitten, zoals de virulentiefactor choleratoxine die overvloedige waterige diarree veroorzaakt wanneer V. cholerae de menselijke dunne darm koloniseert⁷.

Technieken voor het kwantificeren van in vitro ATPase-activiteit zijn gevarieerd, maar meten gewoonlijk fosfaatrelease met behulp van colorimetrische, fluorescente of radioactieve substraten^8-11. We beschrijven een basismethode voor het bepalen van in vitro ATPase-activiteit van gezuiverde eiwitten met behulp van een colorimetrische test op basis van een commercieel verkrijgbaar malachietgroen bevattend substraat dat het vrijkomende anorganische fosfaat (Pi) meet. Bij lage pH vormt malachietgroenmolybdaat een complex met Pi en de mate van complexvorming kan worden gemeten bij 650 nm. Deze eenvoudige en gevoelige test kan worden gebruikt om nieuwe ATPasen functioneel te karakteriseren en om de rollen van mogelijke activatoren of remmers te evalueren, om de belangrijkheid van domeinen en/of specifieke residuen te bepalen, of om het effect van bepaalde behandelingen op enzymatische activiteit te beoordelen.

Protocol

1. Voer ATP hydrolysereactie met Purified Protein

1. Bereid voorraden alle benodigde reagentia voor incubatie met gezuiverde eiwit.
   1. Bereid 5x HEPES / NaCl / glycerol (HNG) buffer die 100 mM HEPES pH 8,5, 65 mM NaCl en 5% glycerol (of ander testbuffer gebruik).
   2. Bereid 100 mM MgCl ₂ (of ander metaal, indien ATPase metaal-afhankelijk) in water.
   3. Bereid verse 100 mM ATP in 200 mM Tris Base (denk pH niet verder aan te passen) met behulp van hoge zuiverheid ATP. Aliquot en opslaan van de ATP-voorraad bij -20 ° C niet langer dan een paar weken, als ATP af zal breken na verloop van tijd, en zich te onthouden van invriezen en ontdooien van de ATP-voorraad.
   4. Premix _MgCl2 en ATP in een 1: 1 verhouding net voordat de ATP hydrolysereactie.
2. Bereiden en labelen 1,5 ml buisjes voor het nemen van monsters op regelmatige tijdstippen gedurende de reactie. Bereid buisjes om monsters te verzamelen op tijd 0 en op het moment 15, 30,45 en 60 min.
   Opmerking: Als alternatief verzamelen monsters slechts op tijdstip 0 en het eindpunt.
   1. Voeg 245 ul 1x HNG buffer aan elke buis om monsters van het ATP hydrolyse reacties 1:50 verdunnen.
3. Bereid een bad van droogijs en ethanol voor snel invriezen monsters om de reactie te stoppen. In een rubberen ijsemmer of andere veilige (niet-plastic) container, voeg verschillende stukken van droog ijs en giet genoeg 70-100% ethanol om het droogijs te dekken.
4. Verdun gezuiverde eiwit in 1x HNG buffer, voor zover van toepassing (gewoonlijk 5-10 uM), en blijf op ijs.
5. Stel de ATP hydrolyse reacties.
   1. In afzonderlijke buizen van 0,5 ml voor elk monster, de volgende reagentia (in volgorde): _H2O (tot een eindvolume van 30 pl), 6 pl 5x HNG of andere buffer, 3 pl 100 mM MgCl ₂ -ATP mengsel, en 0,25-5 uM eiwit.
   2. Onder meer een buffer-enige negatieve controle conditie waarin geen eiwit wordt toegevoegd.
6. Verwijderen 5 ul van het reactiemengsel op tijdstip 0, 1:50 verdunnen in de bereide 1,5 ml buis die 245 gl HNG buffer en onmiddellijk bevriezen van het monster in droogijs / ethanol bad.
7. Incubeer reacties bij 37 ° C om ATP hydrolyse optreedt gedurende 1 uur. Bij elk interval (15, 30, 45 en 60 min), 5 ul aliquots verwijderd uit het reactiemengsel en voeg aan gemerkt monsterbuizen met HNG buffer in stap 1,6.
8. Aan het eind van de hydrolysereactie ATP, verdunde monsters verplaatsen naar een -80 ° C vriezer voor opslag. Om ervoor te zorgen alle monsters zijn volledig bevroren, wacht minstens 10 minuten voordat u verder gaat.

2. Incubate monsters die Gratis Pi met Detection Reagent

1. Dooi verdunde monsters met ATP hydrolysereactie porties op elk tijdstip (verkregen van stap 1,6 en 1,7) bij kamertemperatuur.
2. Het opzetten van een 96-well plaat met monsters en fosfaat standaarden.
   1. In een 0,5 ml tute verdunnen standaard fosfaat (Pi voorzien detectiereagens) van 800 uM tot 40 uM door toevoeging van 5,5 pi van 800 pM standaard 104,5 gl HNG buffer. Meng goed en voeg 100 ul van deze 40 pM Pi standaard goed A1 van een 96-wells plaat.
   2. Voeg 50 ul HNG buffer aan putjes B1-H1 voor 1: 1 seriële verdunningen van de Pi-standaard.
   3. Verwijder 50 pi 40 pM Pi uit goed A1 en voeg aan 50 pl assaybuffer in zowel B1, mixen en verwijdert 50 gl uit goed B1 en voeg goed C1, aanhoudende verdunningen met zowel G1. Gooi 50 gl van zowel G1 na menging te verzekeren elk putje heeft hetzelfde volume. Goed H1 mogen alleen buffer tot een norm vast Pi 40-0 uM bevatten.
      OPMERKING: Indien een aanvullende factor (bijvoorbeeld remmer) werd aan de monsters toegevoegd, maakt een standaardcurve die deze factor te controleren veranderingen in fosfaat afgifte of absorptie onder die omstandigheden.
   4. Voeg 50 ul van elk sample in tweevoud op de plaat. samples toe te voegen uit dezelfde tijd punt in de kolommen verticaal (monster 1 keer 0 = A2, A3; sample 2 keer 0 = B2, B3) en verschillende tijdstippen horizontaal. Dit maakt maximaal 8 samples en 5 tijdstippen per plaat.
3. Een steriele pipet voldoende malachietgroen / molybdaat Pi detectiereagens verwijderen om 100 ul toe aan elk van de putjes die monsters en standaarden (reagens vereist (ml) = 0,1 x aantal monsters en standaarden) en aan een schotel voor eenvoudige pipetteren met behulp van een multichannel pipet. Niet direct giet de detectie reagens in de schaal, als Pi besmetting dreigt te ontstaan.
4. Met een multichannel pipet, voeg 100 ul van de pi detectiereagens aan elk putje en meng door voorzichtig pipetteren en neer een consistent aantal keren zonder dat er luchtbellen, bij voorkeur in volgorde van de laatste tijdstippen aan de eerste tijdstippen.
5. Incubeer de plaat gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur, of volgens de mabrikant's richtingen.

3. Resultaten kwantificeren met behulp van een Microplate Reader

1. Lees de absorptie van de monsters bij 650 nm onder toepassing van een absorptie microplaat reader.
2. Maak een Pi standaard curve. Met behulp van een grafische software, grafiek de absorptiewaarden voor de Pi standaardmonsters tegen de concentratie om een ​​gebruikte vergelijking op te lossen voor de hoeveelheid fosfaat in elk monster te vinden.
3. Bereken de ATPase-activiteit voor elk monster door ijken met fosfaat standaard. Fosfaat vrijgegeven = (OD ₆₅₀ - Y as) / helling.
   1. Het gemiddelde van de totale Pi van duplicaten van elk monster. Trek de buffer-only control's absorptie het lezen van dit nummer. Vermenigvuldig dit met de verdunningsfactor (50 in ons voorbeeld).
   2. Bepaal de nmol Pi vrijgegeven per umol eiwit. Grafische deze waarden voor elk tijdpunt in een kinetische proef moet lineaire fits van ten minste R = 0,99 (figuur 1) werd verkregen; als not, kan de test worden aangepast met min of meer eiwitten of kortere of langere incubatietijd.
4. Vertegenwoordigen de resultaten als nmol Pi / umol proteïne / min (figuren 2, 3), of als nmol Pi / ug eiwit / min indien gewenst.

Resultaten

De in vitro activiteit van de T2S ATPase épse kan worden gestimuleerd door copurification van Epse met het cytoplasmatische domein van EPSL (EPSE-cytoEpsL) en toevoeging van de zure fosfolipide cardiolipine ^12. Het is ook mogelijk om de rol van specifieke resten in Epse ATP hydrolyse bepalen door de activiteit van wildtype (WT) voor variante vormen van het eiwit het gebruik van deze assay. Hier wordt het effect van het substitueren twee lysineresten in de EPSE-zink-bi...

Discussie

Dit is een algemeen protocol voor het meten van ATPase-activiteit in vitro van gezuiverde eiwitten voor biochemische karakterisatie. Deze werkwijze is eenvoudig geoptimaliseerd; bijvoorbeeld het aanpassen van de hoeveelheid proteïne, buffer en zout samenstellingen, temperatuur, en het variëren van de lengte en assay intervallen (inclusief de bevordering totaal aantal intervallen) kan activiteit kwantificering verbeteren. In de handel verkrijgbare malachietgroen-gebaseerde reagentia zijn zeer gevoelig en kunnen ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
HEPES buffer	Fisher	BP310-500
Natriumchloride	Fisher	BP358-212
Magnesiumchloride	Fisher	BP214-500
Adenosinetrifosfaat (ATP)	Fisher	BP41325
96-wells platen (helder, platte bodem)	VWR	82050-760
BIOMOL Green	Enzo Life Sciences	BML-AK111	Voorkeursfosfaat detectie reagens. Let op: irriterend.
Microplate reader			BioTek Synergy of vergelijkbaar
Prism 5	GraphPad Software