Methodenartikel

Een werkwijze van gerichte Cell Isolation via Glasoppervlak functionalisering

DOI:

10.3791/54315

⸱

20 september 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Liberal Arts & Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Biomedical Engineering, Illinois Institute of Technology

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de aanpasbare oppervlaktefunctionalisering van het desthiobiotine, streptavidine en APTES systeem om specifieke celtypen van belang te isoleren. Daarnaast behandelt dit manuscript de toepassingen, optimalisatie en verificatie van dit proces.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de beperkende factoren voor de acceptatie en ontwikkeling van gepersonaliseerde geneeskunde is het onvermogen om diagnostische hulpmiddelen te ontwikkelen om individuele nuances in expressie van patiënt tot patiënt te onderzoeken. Huidige methodologieën die proberen cellen te scheiden om deze niche te vullen, resulteren in verstoring van fysiologische expressie, waardoor de scheidingstechniek nutteloos wordt als diagnostisch hulpmiddel. In dit protocol beschrijven we de functionerisering en optimalisatie van een oppervlak voor de cellulaire opname en afgifte. Dit functionele oppervlak integreert gebiotineerde antilichamen met een glazen oppervlak gefunctionaliseerd met een aminosilaan (APTES), desthiobiotine en streptavidine. Celvrijlating wordt vergemakkelijkt door de introductie van biotine, waardoor het verzamelen en zuiveren van door het oppervlak opgenomen cellen mogelijk is. Deze afgifte gebeurt door het targeten van de secundaire component desthiobiotine, wat resulteert in een veel milder afgifteparadigma. Deze vermindering van agressieve reagentia en schurende krachten vermindert veranderingen in cellulaire expressie. Het functionele oppervlak vangt tot 80% van de cellen in een enkele celmix op en heeft een vangpercentage van 50% aangetoond in een dubbele celmix. Toepassingen van deze technologie op xenografts en kanserontkoppelingsstudies worden onderzocht. Kwantificeringstechnieken voor oppervlakteverificatie zoals platenlezer en ImageJ-analyses worden ook beschreven.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Huidige bench-top cel scheiding benaderingen (bijvoorbeeld fluorescentie-geactiveerde celsortering 1, laser capture micro-dissectie 2, immuno-magnetische kraal scheiding 1) kan enkele uren van voorbereiding en het sorteren te nemen. Deze grote tijdschalen kunnen beïnvloeden fysiologische respons en expressieniveaus, waardoor analyses die niet representatief zijn voor de fysiologische respons 3. Systemen nodig die snel en efficiënt specifieke celtypen isoleren zonder verstoring van celoppervlak receptor-niveaus om cel isolatie en verrijking voor biomedische applicaties te verbeteren. Daarom is de reden voor de aanpak is om een ​​zachte benadering voor celisolatie ontwikkelen.

De 'lab on a chip' concept biedt de belofte van ordes van grootte sneller (uren tot minuten) cel isolatie, en het vaakst gaat om het vastleggen van de cellen op een oppervlak en het vrijgeven van cellen of intracellulaire conteNTS door fysieke 4,5 of chemische methoden 6. Hoewel deze benaderingen bieden enkele voordelen zoals het identificeren van eiwit-expressie 7,8 identificeren RNA expressie 9-11, of waardoor zelfs cellen in vitro kweek 12,13, veel van deze technieken niet vertaald diagnostiek zoals celreceptor profilering wijten van de niet-fysiologische omgevingen. Enzymatische tillen middelen zoals collagenasen kan ook invloed hebben op deze receptor hoeveelheden 14,15, wat betekent cel receptor kwantificering technieken die deze opheffen van agenten zal niet het genereren van nauwkeurige fysiologische gegevens. Cellulaire lysis voorkomt differentiatie tussen de inheemse oppervlak receptoren, en degenen die voorheen werden geïnternaliseerd 16. Dit protocol beschrijft een snelle en zachte aanpak voor mobiele isolement.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Het schoonmaken van het glasoppervlak en het voorbereiden van reagentia

  1. Plaats een glazen oppervlak in een zuurstof plasma machine gedurende 5 minuten bij 50% macht om het schoon te maken.
  2. Bereid 2,5 ml 2% gereconstitueerd (3-aminopropyl) triethoxysilaan (APTES) oplossing door toevoeging van 50 pl APTES en 2,45 ml ethanol in een conische buis.

2. APTES en DSB functionalisering

  1. Voeg APTES oplossing op de oppervlakken. Pipetteer 150 ul per putje voor 8 well platen. Pipet 100 ul per putje voor 24 well platen. Pipet 1,1 ml voor 60 x 15 mm glazen schalen. Dek de oppervlakken verdamping en ongelijke verdeling van APTES oplossing te voorkomen. Plaats de oppervlakken op een platform schudmachine gedurende 50 minuten bij kamertemperatuur, waarbij een gelijkmatige verdeling van de APTES laag creëert.
    OPMERKING: APTES is een aminosilaan, dat de eerste laag het oppervlak vormt. Bij gebruik van een andere ondergrond, heuristisch het volume van de oplossing nodig bedekken bepalen.
  2. Temperatuur kiezen voor de oven, terwijl de oppervlakken van de schudinrichting: Verwarm tot 55 ° C gedurende 2 uur voor de 8 putjes en 24 putjes. Warmte glas alleen gerechten 90 ° C gedurende 1 uur.
  3. Spoel het oppervlak met ethanol.
    1. Dien de hoeveelheid ethanol vereist referencing basis van het gebruikte oppervlak. Voeg 150 ul ethanol aan elk putje voor 8 putjes. Voeg 125 ul ethanol aan elke well van 24 wells platen. Voeg 1,1 ml ethanol voor glas gerechten.
    2. Spoel het oppervlak ontladen en het trekken van de vloeistof uit een vast punt, zoals de hoek van de put. Houd de tube ongeveer een 70 ° hoek, zodat het uiteinde niet direct gericht op het oppervlak. Spoel tweemaal op ethanol.
      Opmerking: Als een van de glazen bodem putjesplaten nog plastic in hen, ze niet verhitten boven 65 ° C, daar de kunststof beginnen te smelten en warp.
  4. Droog met 100% stikstofgas vrijgesteld van een tank. Plaats de oppervlakken in de oven.
  5. Bereid 2,5 ml van d-desthiobiotine (DSB) -oplossing door het combineren van 1,5 mg / ml DSB 37,5 pl dimethylsulfoxide (DMSO), en 5 mg / ml 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) in 2462,5 ul van de 0,1 M 4-hydraat morfolinoethaansulfonzuur (MES) (pH 6) buffer. Dan combineer beide oplossingen.
  6. Voeg 1 pl 2-mercaptoethanol β na 15 min in de oplossing om de reactie tussen DSB en EDC blussen. Verwijder hot APTES gefunctionaliseerd glazen oppervlakken uit de oven. 5-10 min wachten voor glasoppervlakken afkoelen.
  7. Voeg MES buffer het oppervlak te spoelen, via bedragen op basis van het oppervlak. Voeg 150 ul MES buffer aan elk putje voor 8 putjes. Voeg 125 ul MES buffer aan elk putje voor 24 well platen. Voeg 1,1 ml MES buffer voor glas gerechten.
  8. Spoel oppervlak door ontladen en het trekken van de vloeistof uit een vast punt, zoals de hoek van de put. Houd de pipet op ongeveer een 70 ° hoek, zodat de tip is niet direct gerichtin het oppervlak. Spoel tweemaal meer met MES buffer.
  9. Breng de DSB oplossing op de oppervlakken om hen te incuberen. Voeg 150 ul DSB oplossing per goed voor 8 well platen. Voeg 100 ul DSB oplossing per goed voor 24 well platen. Voeg 1,1 ml voor glas gerechten DSB-oplossing.
  10. Plaats de DSB gedekt glasoppervlakken op een vochtige papieren handdoek in een petrischaal. Dek af en incubeer in een 4 ° C koelkast voor 18-24 uur.

3. Streptavidine functionalisering

  1. Spoel iedere glasoppervlakte driemaal met 1 ml 1,0x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Spoel oppervlak door ontladen en het trekken van de vloeistof uit een vast punt, zoals de hoek van de put. Houd de tube ongeveer een 70 ° hoek, zodat het uiteinde niet direct gericht op het oppervlak. Verdun de streptavidine (SAV) stockoplossing aan 0,4 mg / ml (aanbevolen).
    OPMERKING: isotoon PBS zodat het kan worden gebruikt als een medium voor verdunning en spoelen. PBS wordt gebruikt als oplosmiddel voor de SAv, en daarom heeft geen invloed op het vermogen van de SAV-te binden aan de oppervlakte.
  2. Toepassen 0,4 mg / ml SAv oplossing gelijkmatig op het oppervlak zodat een dunne laag vormt op de bodem van het glas, selecteert de hoeveelheid oplossing op basis van oppervlakte. Voor 8 putjes, voeg 150 ul 0,4 mg / ml SAv oplossing per well. Voor 24 well platen, voeg 100 ul 0,4 mg / ml SAv oplossing per well. Voor glazen schalen, voeg 1,1 ml 0,4 mg / ml SAv oplossing.
  3. Dek af en zet de platen om een ​​14 cm petrischaal om vocht vast te houden. Incubeer de petrischaal in de koelkast voor 18-24 uur.
    LET OP: Het is van essentieel belang om consistente volumes van APTES, DSB, en SAv gebruiken op elke ondergrond.
  4. Spoel iedere glasoppervlakte driemaal met 150 pl PBS om SAv verwijderen. Spoel oppervlak door ontladen en het trekken van de vloeistof uit een vast punt, zoals de hoek van de put. Houd de tube ongeveer een 70 ° hoek, zodat het uiteinde niet direct gericht op het oppervlak.
  5. Bevochtig een papieren handdoek wet gedeïoniseerd water en het papier handdoek flat in 14 cm Petrischaal rond de platen vochtigheid in de putjes te behouden. Dek de petrischaal met de putjes. Incubeer de petrischaal in een 4 ° C Biosafety 1 (BSL-1) koelkast totdat het nodig is.

4. Cell Capture and Release

  1. Begin met T175 kolf (en) van cellen bestemd voor het experiment. Zuig de media van kolf (s). Spoel de resterende media met 5 ml van de ruimtetemperatuur PBS. Zuig PBS uit de fles (s).
  2. Voeg 10 ml van niet-enzymatische lifting middel zoals cel dissociatie oplossing, de T-175 kolf cellen. Plaats de kolf in de incubator gedurende 6 min mogelijk te maken voor het optillen van de cellen van de fles.
  3. Na 6 minuten, voeg 10 ml koud Hank's Balanced Salt Solution (HBSS; zie lijst van Materials) om de opheffing agens te inactiveren. Neem 20 ul van cellen om het aantal cellen in een oplossing met behulp van een hemacytometer tellen.
    OPMERKING: Afhankelijk van de functionalized oppervlakken gebruikt bij het vangen experiment werd het aantal cellen nodig varieert. Voor gefunctionaliseerde 8 putjes, gebruiken 300.000 cellen per putje. Voor gefunctionaliseerde glazen schalen, gebruiken 1,1 miljoen cellen. Voor gefunctionaliseerde 24 putjes, worden 125.000 cellen aan te bevelen. Meer informatie over celtelling wordt gevonden in het supplement.
  4. Herhaal stappen 4.1- 4.3 voor andere kolf van cellen, als er minder cellen aanwezig zijn dan nodig is voor het experiment zijn. Combineer celsuspensies en hertelling cellen tot het totale aantal cellen in oplossing te krijgen.
  5. Spin down celsuspensie in een centrifuge bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C een pellet van geconcentreerde cellen krijgen. Zoek de juiste hoeveelheid HBSS te voegen aan de celsuspensie tot een concentratie van 1 x 10 6 cellen per ml te krijgen, dan zuig het supernatant van de cellen afgedraaid en voeg het berekende volume. Dit volume kan worden berekend met de vergelijkingen in het supplement.
  6. Pipet op en neer (vermaal) naar th mengene cellen in oplossing en vermindering van cellulaire klonteren in oplossing die kan verminderen antilichaambinding. Splits de mobiele oplossing in aparte controle en experimentele oplossingen. Bekijk Aanvullende File voor componenten en berekeningen.
  7. Voeg de gebiotinyleerde antilichamen tegen de betreffende cel bereid zoals vermeld in de Aanvullende File. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C aan een uiteinde-over-end mixer.
    OPMERKING: MCF7GFP cellen, 0,5 mg / ml hIgG of 0,5 mg / ml HLA-ABC antilichamen worden aanbevolen. Voor RAW macrofagen, 1 mg / ml mCD11b worden aanbevolen op de helft van het volume om rekening te houden voor de verdunning verschillen. Menselijke navelstrengader endotheliale cellen (HUVEC's), 0,5 mg / ml hCD31 aanbevolen.
  8. Was de gefunctionaliseerd glazen oppervlak met HBSS. Voor dit experiment, is een 8-well plaat geadviseerd.
    1. Voeg 150 ul HBSS aan elk putje voor 8 well platen. Spoel nog twee keer met behulp van HBSS. Spoel oppervlak door ontladen en het trekken van de vloeistof uit een vast punt, zoals de hoek van de put.Houd de tube ongeveer een 70 ° hoek, zodat het uiteinde niet direct gericht op het oppervlak. Houd koud bij 4 ° C.
  9. Voeg cel oplossingen aan de putjes en wacht 45 minuten voor de cellen te incuberen op ijs op de shaker. Maak de oplossing van biotine in steriele HBSS met berekende volumes zoals beschreven in het supplement.
  10. De cel oplossing uit de putjes glas met HBSS.
    1. Voorzichtig pipet 150 ul HBSS in elk putje. pipet vervolgens de HBSS. Spoel oppervlak door ontladen en het trekken van de vloeistof uit een vast punt, zoals de hoek van de put. Houd de tube ongeveer een 70 ° hoek, zodat het uiteinde niet direct gericht op het oppervlak.
    2. Herhaal dit nog twee keer. Na wassen, voeg HBSS aan de putjes om de cellen vochtig houden.
  11. Voeg 150 ul van 20 mM biotine oplossing voor elke respectieve vrijlating goed, en dan 20 minuten wachten om voor de reactie.
  12. Herinneren niet-specifiek gebonden cels door wassen met HBSS zoals hierboven vermeld, en bij gebruik van fluorescent gelabelde cellen, gaat het beeld aan fluorescentie van de cellen. Beeld ook levende cellen in een kolf (als controle, te vergelijken met de cellen in het putje). Bij gebruik van groen fluorescent eiwit (GFP) getransfecteerde cellen, zal de excitatie 470 nm en de emissie is 515 nm.

5. Antibody Optimization: titratie van antilichamen

  1. Begin met het optillen van de cellen van de T75 of T175 kolf zoals beschreven in stap 4.1- 4.3.
    LET OP: Deze volumes zijn gekalibreerd voor 24 putjes, maar kan worden gewijzigd in een glazen gefunctionaliseerde oppervlakken door middel van heuristische testen aan te passen. Een representatieve titratie van antilichamen wordt weergegeven in figuur 1.
  2. Aantal cellen met de hemacytometer en vervolgens spin down de cel oplossing in een conische buis bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Reconstitueren cellen tot 1 miljoen cellen per ml, volgens de in de Bijlage beschreven berekeningen.
  3. Splits de 1 million cellen per ml oplossing in zes verschillende oplossingen van 500 pl in verschillende centrifugebuizen van het antilichaam (Ab) oplossingen.
    1. Verdun het antilichaam stockoplossing aan 10 ug / ml, 1 ug / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. Maak de controles met 100 pl Stain buffer (PBS + 1% natriumazide + 1% BSA) en 500 pl van cellen voor de controle zonder Ab daarin. Voor de blanco controle (No Ab en geen cellen), gebruik dan een oplossing van 300 ul PBS.
      LET OP: LET OP: Natriumazide is uiterst giftig, explosief, en extreme zorg moeten worden genomen bij het gebruik ervan. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad (VIB) en gebruik de juiste beschermingsmiddelen.
  4. Combineer en incubeer de Ab oplossingen met de mobiele oplossingen in de end-over-end menger bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Spoel de gefunctionaliseerde 24 putjesplaten met HBSS driemaal. Spoel het oppervlak ontladen en het trekken van de vloeistof uit een vast punt, zoals de hoek van de put. Houd de piPette ongeveer een 70 ° hoek, zodat het uiteinde niet direct gericht op het oppervlak.
  5. Aliquot 125 ul van elk monster oplossing in de juiste APTES, DSB, en SAv gefunctionaliseerde goed. Incubeer bij 4 ° C of op ijs gedurende 45 min op het glasoppervlak. Spoel het oppervlak met HBSS driemaal aspecifiek gebonden cellen te verwijderen. Spoel oppervlak door ontladen en het trekken van de vloeistof uit een vast punt, zoals de hoek van de put. Houd de tube ongeveer een 70 ° hoek, zodat het uiteinde niet direct gericht op het oppervlak. Niet uitspoelen de onderste rij, als die zijn controles.
  6. Voeg 150 ul van HBSS aan elk putje gewassen, zet de 24 well platen op ijs, en vervolgens een bord lezer om fluorescentie van GFP-cellen (excitatie 485 nm / emissie 528 nm) te meten.

6. Cell Optimization: Cell titratie

  1. Til de cellen, zoals vermeld in de stappen 4.1 -4.3.
  2. Aantal cellen met een hemacytometer. Spin down cel zolutie in conische buis bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Reconstitueren cellen tot 1 miljoen cellen per ml.
    OPMERKING: Meer informatie over het gebruik van de hemacytometer is te vinden in het Supplement.
  3. Pipetteer 1,6 ml van de cel oplossing voor de 1,6 miljoen cellen voorraad en plaats in een conische buis. Pipet 800 ul van cellen uit de cel oplossing voor de 800.000 cellen stock en in een conische buis. Pipet 80 ul uit de cel voorraad voor de 80.000 cellen stock en in een conische buis. Pipette 8 ul van de cel voorraad voor 8.000 cellen stock en in een conische buis.
    LET OP: De concentraties zijn per 8 well plaat metingen, repliceren als dat nodig is. Een voorbeeld van output plaat wordt getoond in figuur 2.
  4. Neem de vier voorraadoplossingen en draaien in een centrifuge bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Re-schorten alle voorraad oplossingen in 400 ul van HBSS.
  5. Voeg 1,6 pl 100 ng / ml antilichaam aan de cel 1.600.000 stock, 0,8 μl op de 800.000 cel stock, en 0,5 pl voor alle andere bestanden. Incubeer het antilichaam gedurende 30 min in end-over-end mixer gedurende 30 min bij 4 ° C. Was de gefunctionaliseerd glazen oppervlak met HBSS driemaal.
    LET OP: De gefunctionaliseerde 8 wells plaat wordt aanbevolen voor microscopie kwantificering, terwijl de gefunctionaliseerde 24 wells plaat wordt aanbevolen voor plaatlezer kwantificering. Antilichaamconcentratie van 8000 cellen stock niet beperkt tot de beperkende factor van het opvangoppervlak laat het gebrek aan antilichamen in oplossing zijn, maar het vastleggen eigenschappen van het oppervlak.
  6. Toepassen 150 ul van de monsteroplossingen aan elk putje. Breng de 1,6 miljoen cel bouillon aan de eerste kolom van waterputten aan de linkerkant. Breng de 800.000 cel bouillon aan de tweede kolom van links. Breng de 80.000 cel bouillon aan de derde kolom van links. Ten slotte gelden de 8000 cel bouillon aan de laatste kolom. Incubeer gedurende 45 minuten bij 4 ° C op de shaker.
    OPMERKING: De 1,6 miljoencel stock dient als de hoogste concentratie te onderzoeken, en het dubbele van de hoeveelheid cellen die kenmerkend wordt gebruikt in mobiele scheidingsexperimenten (600.000 cellen per putje) De 800,000 cel stock is de plaats voor het experiment is de typische celconcentratie die wordt gebruikt in mobiele scheidingsexperimenten (3.000.000 cellen per putje). De 80.000 cel voorraad dient als een tienvoudige verdunning om te testen op lagere concentraties voor mobiele capture (30.000 cellen per well). De cel 8000 stock fungeert als een honderdvoudige verdunning te gebruiken als een test om de ondergrens van cellulaire afscheiding (3000 cellen per putje) controleren.
  7. Spoelen met HBSS drie keer. Spoel oppervlak door ontladen en het trekken van de vloeistof uit een vast punt, zoals de hoek van de put. Houd de tube ongeveer een 70 ° hoek, zodat het uiteinde niet direct gericht op het oppervlak. Verzamel alle wasbeurten.
  8. Het imago van de cellen op een fluorescentiemicroscoop, als het gebruiken van 8 putjes, neem foto's van elke surgezicht en toepassing 150 ul biotine elk oppervlak gedurende een uur bij 4 ° C op de shaker. Na één uur, spoel afgifte putjes biotine met HBSS 3 keer als voorheen. Verzamel alle wasbeurten uit putten voor het tellen van de hemocytometer en beeld de release putten.
  9. Solliciteer 150 ul van 20 mM overmaat biotine oplossing voor vrijlating putten biotine eigenen gedurende 1 uur, bij gebruik van 24 putjes en spoel dan die putjes 3 keer met HBSS. Kwantificeren 24 well platen met behulp van een plaat lezer. Gebruik een hemacytometer om cellen te tellen van alle verzamelde goed wast.

7. Beeldanalyse

Let op: de Fiji-softwarepakket (http://fiji.sc/Fiji) wordt aanbevolen voor beeldanalyse. Aanvankelijk werden de beelden omgezet in grijstinten afbeelding in, en vervolgens werd de helderheid / contrast aangepast om de cellen uit te brengen.

  1. Laad de afbeelding en om te zetten in grijswaarden door te klikken op de tab afbeelding vervolgens naar beneden scrollen naar 'Type' en vervolgens te klikken op4, 8 bit ".
  2. Verhoog het contrast van de afbeelding door te klikken op de tab afbeelding en vervolgens scrollen naar "Adjust". Klik op "Helderheid en contrast", en gebruik de schuifbalken om de cellen te onderscheiden. Bij gebruik van fluorescentie beelden, keren de beelden naar de cellen meer bepaald te maken.
  3. Laad een plugin op ImageJ ITCN genoemd (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) om de beelden te analyseren.
  4. Open ITCN. Wanneer een dialoogvenster waarin dwingt de gebruiker verschillende parameters om de grootte van de cel te schatten, de minimale breedte van de cel van belang als eerste. Klik op de optie "Detect Dark Peaks" als de afbeelding fluorescerende en de cellen worden verduisterd.
  5. Stel de drempelwaarde op 2 in eerste instantie, en dan druk op de knop "Count". Een nieuw telde versie van de foto zal verschijnen met rode stippen af ​​te bakenen waar de cellen werden geteld.
  6. Stel de parameter drempel en de breedte om meer accurate mobiele data door defini krijgenng groot als een "cel". Opmerking: Het aantal cellen geteld zal worden in een dialoogvenster aan de rechterkant. Het veranderen van parameters zal verschillend aantal cellen geteld geven.
  7. Blijf doorloopt de drempel en breedteparameters tot een goede schatting is bereikt voor het aantal cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met dit protocol tonen wij cell capture (figuur 3A) en mobiele afgifte (figuur 3C) van MCF7GFP cellen en levende cellen (Afbeelding 4). We gekwantificeerd de cel vast te leggen als de 60% ​​en 80% werden vrijgegeven (figuur 3C). Wanneer we deze benadering uitgebreid tot een mengsel van RAW 264,7 macrofagen en MCF7GFP cellen, 50% RAW macrofagen werden vastgelegd (fig. 3D) en 80% van RAW macrofagen waren r...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verbeteringen in cel isolatietechnieken bevordert wetenschappelijke studies in de structuur-functie relaties in Neuroscience 18, stamcel programmering regeneratieve biologie en angiogene signalering in vasculaire biologie 19. Inderdaad, primaire celkweek 20 (bijvoorbeeld HUVEC) vasculaire biologie voornamelijk plaatsvinden door gebruik van cel isolatietechnieken. Cell isolatie werd onlangs ook gebruikt voor de kwantitatieve flow (qFlow) cytometrie analyse van de plasmamembraan r...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen de American Cancer Society, Illinois Division (282802) en de National Science Foundation CBET (1512598) bedanken voor de financiële ondersteuning. We willen ook Dr. Dianwen Zhang van het University of Illinois Beckman Institute bedanken voor de training in microscopie. Ten slotte willen we Jared Weddell, Stacie Chen en Spencer Mamer bedanken voor hun inzichtelijk discussies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)Acros Organics919-30-2Wordt gebruikt om 2% APTES-oplossing te maken
Plasma Cleaner PicoDienerModel 1Reinigt oppervlakken en maakt binding van PDMS aan glas mogelijk
d-Desthiobiotin (DSB)SigmaD20655Wordt gebruikt als vrijlatingsmechanisme in het cel-opvangoppervlak. 
dimethyl sulfoxide (DMSO)British Drug Houses (BDH)BDH1115-1LPLos DSB op in oplossing
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)Thermo-Scientific5g: 22980
25g: 22981		Activeert carbonzuren en maakt binding van eiwitten aan het glasoppervlak mogelijk.
Uncoated 8-well culture slideBD FalconCase of 24: 354118
Case of 96: 354108		Wordt gebruikt in cellulaire experimenten met de Zeiss-fluorescentiemicroscoop, zoals experimenten voor het aanvankelijke vastleggen en het bepalen van de hoeveelheid vrijlating
Glass bottom 24-well platesMatTekP24G-0-13-FWordt gebruikt in cellulaire experimenten met de plate reader, zoals antilichaam- en celtitratie-experimenten
MercaptoethanolScience Lab60-24-2Wordt gebruikt om de reactie tussen EDC en DSB te onderdrukken
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate
(MES Hydrate 99%)		Fisher ScientificAC172590250Wordt gebruikt om 0,1 M MES-buffer te maken voor gebruik in EDC-reactie
Precision OvenThermo Scientific11-475-153Wordt gebruikt bij het uitharden van PDMS en APTES-laag.
Titramax 1000 ShakerHeidolph13-889-420Wordt gebruikt om een gelijkmatige verdeling van APTES op oppervlakken te garanderen.
1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg]Proteo Chem9013-20-1Biotine-bindend eiwit. Kan irritatie veroorzaken.
5 cm Glass DishFisher Scientific08748AWordt gebruikt in HUVEC-studies en toekomstige profileringsstudies.
14 cm Petri Dish met dekselSigma-AldrichZ717231Wordt gebruikt om monsters die worden gefunctionaliseerd vast te houden en ze te vervoeren.
MCF7-GFP cellenCell BiolabsAKR211Opgeslagen in vloeibare stikstof
RAW264.7 muismacrofagenATCCTIB-71Aangeboden door Smith lab aan de University of Illinois. Opgeslagen in vloeibare stikstof.
TrypLELife Technologies12605036Opgeslagen in 100 ml bij kamertemperatuur
Dulbecco’s gemodificeerd Eagle-mediumCell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC50003PCLeverancier: Corning
Niet-essentiële aminozurenCell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC25-025-CIAl toegevoegd aan DMEM door de faciliteit. Leverancier: Corning.
Cell scraperFisher Scientific12-565-58Kleine 23 cm 50-pack
Cell Dissociation SolutionCorningMT-25-056CIWordt gebruikt om cellen niet-enzymatischerwijs op te tillen voor gebruik in celexperimenten
HemacytometerHausser02-671-54Wordt gebruikt om cellen te tellen voor de kwantificering van celoplossingen en de effectiviteit van vastleggen en vrijlating.
BiotineAmresco58-85-5Wordt gebruikt om cellen van het oppervlak te laten los.
HBSSGemaakt volgens receptN/AWordt gebruikt om cellen in suspensie levend te houden, evenals om oppervlakken te wassen van niet-specifieke binding. Aangepast uit Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, gebruik 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 en 0.5 g glucose. Voeg DI-water toe om 500 ml te bereiken, filter en koel vervolgens.
HLA-ABC AntilichaamBioLegend311402Antilichaam gebruikt om MCF7gfp-cellen vast te leggen
hIgG AntilichaamBioLegendHP6017Antilichaam gebruikt om MCF7gfp-cellen vast te leggen
MCF7 GFP cellenCell BiolabsAKR-211Luminale borstkankerlijn die is getransfecteerd met groen fluorescerend eiwit.
Assorted ConicalsThermo-Scientific15mL: 12-565-26850/15 ml kunststof kegelbuisjes voor het opslaan van oplossingen en aliquoten.
Mini-Tube Rotators (End over End Mixer)Fisher Scientific05-450-127Wordt gebruikt om antilichaam te incuberen en andere cellulaire oplossingen te mengen om te mengen
Axiovert 200M (fluorescentiemicroscoop)ZeissN/AZeiss Axiovert 200 M omgekeerde fluorescentiemicroscoop.
Zeba Desalting columnsThermo-ScientificPI-87770Wordt gebruikt om nieuw gebiotinyleerde antilichamen te zuiveren na het gebruik van de Biotinylering Kit. Instructies op: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation KitThermo- ScientificWordt gebruikt om antilichamen te biotinyleren om ze te laten integreren met het opvangoppervlak
Plate ReaderBioTekSynergy HTX Multimode ReaderWordt gebruikt om de fluorescentie-intensiteit kwantitatief te meten in de titratie-experimenten.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage. Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).
  2. De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques. Histol. Histopathol. 26 (2), 267-275 (2011).
  3. Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation. Cell. Mol. Bioeng. 8 (3), 383-403 (2015).
  4. Cheung, L. S. L., et al. Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel. Lab Chip. 9 (12), 1721-1731 (2009).
  5. Privorotskaya, N., et al. Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters. Lab Chip. 10 (9), 1135-1141 (2010).
  6. Park, K., Akin, D., Bashir, R. Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array. Biomed. Microdevices. 9 (6), 877-883 (2007).
  7. Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device. Lab Chip. 14 (1), 147-156 (2014).
  8. Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays. Lab Chip. 9 (12), 1676-1680 (2009).
  9. Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems. Lab Chip. 10 (21), 2875-2886 (2010).
  10. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a. PNAS. 107 (35), 18392-18397 (2010).
  11. Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
  12. Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. >Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab Chip. 14 (1), 89-98 (2014).
  13. Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells. Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).
  14. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors. Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).
  15. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle. PLoS One. 7 (9), e44791(2012).
  16. Ludwig, A., Kretzmer, G., Schügerl, K. Determination of a "critical shear stress level" applied to adherent mammalian cells. Enzyme Microb. Technol. 14 (3), 209-213 (1992).
  17. Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. I. Secondary anchor targeted cell release. Biotechnol. Bioeng. 112 (11), 2214-2227 (2015).
  18. Drenan, R. M., Nashmi, R., Imoukhuede, P., Just, H., McKinney, S., Lester, H. A. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol. Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
  19. Imoukhuede, P. I., Dokun, A. O., Annex, B. H., Popel, A. S. Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia. Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4 (8), H1085-H1093 (2013).
  20. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  21. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantitative fluorescent profiling of VEGFRs reveals tumor cell and endothelial cell heterogeneity in breast cancer xenografts. Cancer Med. 3 (2), 225-244 (2014).
  22. BD Biosciences. CD Marker Handbook: Human and Mouse. , at: https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf (2010).
  23. Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnol. Bioeng. 104 (2), 360-370 (2009).
  24. Processing Blood. , at: https://www.google.com/patents/US20140030238 (2014).
  25. Fukuda, S., Schmid-Schönbein, G. W. Centrifugation attenuates the fluid shear response of circulating leukocytes. J. Leukoc. Biol. 72 (July), 133-139 (2002).
  26. dela Paz, N. G., Walshe, T. E., Leach, L. L., Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival. J. Cell Sci. 125 (Pt 4), 831-843 (2012).
  27. Allard, W. J., et al. Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant diseases.". Clinical Cancer Research. 10, 6897-6904 (2005).
  28. Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
  29. Chen, S., Weddel, J., Gupta, P., Conard, G., Parkin, J., Imoukhuede, P. I. QFlow Cytometer-Based Receptoromic Screening: A High-throughput Quantification Approach Informing Biomarker Selection and Nanosensor. Submiss. , (2016).
  30. Vasa, M., et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ. Res. 89 (1), E1-E7 (2001).
  31. Hirsch, J. D., Eslamizar, L., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Anal. Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).
  32. Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey. Methods Enzymol. 152 (1), 183-189 (1987).
  33. Wu, X., et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots. Nat. Biotechnol. 21 (1), 41-46 (2002).
  34. Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling. J. Mater. Chem. B. 1, 6434(2013).
  35. Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof. , Available from: http://www.google.com/patents/US5512439 (1996).
  36. Naranbhai, V., et al. Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function. J. Immunol. Methods. 366 (1-2), 28-35 (2011).
  37. Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces. Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cell Capture ReleaseBiotinylated AntibodiesDesthiobiotin StreptavidinAPTES Surface TreatmentCell Isolation MethodFluorescence Imaging AnalysisFlow Cytometry DownstreamTumor Angiogenesis ScreeningPersonalized Medicine Diagnostics

Gerelateerde artikelen