Methodenartikel

Vergelijking van de Tabak Host Cell Protein methode voor het verwijderen van blancheren intacte planten of door een warmtebehandeling van Extracten

8.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54343

⸱

8 augustus 2016

 ,  , 
1Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 3Department of Biomolecular Separation Engineering, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

In dit artikel

Samenvatting

Drie warmte precipitatiewerkwijzen gepresenteerd die effectief meer dan 90% van gastheerceleiwitten (HCP) van tabak extracten te verwijderen vóór alle andere zuiveringsstap. De plant HCPs irreversibel aggregeren bij temperaturen boven 60 ° C.

Samenvatting

Planten bieden niet alleen voedsel, voer en grondstoffen voor de mens, maar ook ontwikkeld als voordelig productieplatform voor biofarmaceutische eiwitten, zoals antilichamen, vaccin kandidaten en enzymen. Deze moeten worden gezuiverd uit de plantaardige biomassa, maar chromatografie stappen worden belemmerd door de hoge concentraties van de gastheercel eiwitten (HCPs) in plantenextracten. De meeste HCPs irreversibel aggregeren bij temperaturen boven 60 ° C vervolgens gemakkelijker zuivering van het doeleiwit. Hier worden drie methoden voorgesteld om de warmte precipitatie van tabak HCPs bereiken hetzij intacte bladeren of extracten. Het blancheren van intacte bladeren kunnen gemakkelijk in bestaande processen worden opgenomen, maar kan een negatief effect hebben op de daaropvolgende filtratie stappen te hebben. Het tegenovergestelde geldt voor de warmte het neerslaan van blad extracten in een geroerd vat, die de prestaties van de downstream-activiteiten te verbeteren, zij het met grote veranderingen in het proces van het ontwerp van apparatuur, zoalshomogenisator geometrie. Tenslotte wordt een warmtewisselaar setup goed gekarakteriseerd in termen van warmteoverdracht omstandigheden en gemakkelijk op schaal, maar reiniging kan moeilijk zijn en er kan een negatief effect op filter capaciteit. Het ontwerp-of-experimenten benadering kan worden gebruikt om de meest relevante procesparameters invloed HCP verwijdering en productwinning identificeren. Dit vergemakkelijkt de toepassing van elke methode andere expressie en het ter bepaling van de meest geschikte methode voor een bepaalde zuiveringsstrategie.

Inleiding

Moderne systemen in de gezondheidszorg steeds meer afhankelijk van biofarmaceutische eiwitten 1. De productie van deze eiwitten in planten is voordelig vanwege de lage pathogeen last en grotere schaalbaarheid in vergelijking met conventionele expressiesystemen 2-4. Echter, de stroomafwaartse verwerking (DSP) van plantaardige geneesmiddelen uitdagend omdat de verstorende extractieprocedures resulteren in een hoge deeltjes belasting met troebelingen dan 5000 nefelometrische troebelingseenheden (NTUs), en eiwitten van de gastheercel (HCP) concentraties die vaak meer dan 95 % [m / m] 5,6.

Uitgebreide verduidelijkingsprocedures moeten 7-9 verspreide deeltjes te verwijderen, maar vloeistofchromatograaf is goedkoper om in-binden en elueren stand tijdens uitgangsproduct herstel of er een eerdere stap voor het effectief verwijderen van HCPs 10,11. Dit kan worden bereikt door het precipiteren van het doeleiwit via floccul12 mieren of lage pH 13,14, en door het veroorzaken van de HCPs te aggregeren. De selectieve aggregatie van ribulose-1,5-bisfosfaat carboxylase / oxygenase (RuBisCO), de meest voorkomende HCP in groene planten zoals tabak (Nicotiana tabacum), kan worden bevorderd door het toevoegen van polyethyleenglycol 15, maar dit is duur en onverenigbaar met grote -schaal productie. Warmtebehandeling is aangetoond dat het denatureren en precipiteren meer dan 95% van tabak HCP, terwijl eiwit malaria vaccin kandidaten zoals Vax8 stabiel in oplossing blijven 16-18.

Drie verschillende benaderingen werden gebruikt om de warmte-geïnduceerde precipitatie van tabak HCPs bereiken: (i) blancheren, dat wil zeggen, het onderdompelen van intacte bladeren in hete vloeistof, (ii) een thermisch geïsoleerde geroerd vat, en (iii) een warmtewisselaar ( figuur 1) 16. Voor intact bladeren, blancheren bereikte de snelle en efficiënte neerslaan van HCPs en was ook gemakkelijkopschalen en compatibel met bestaande grootschalige productieprocessen die een eerste stap om de plant biomassa 19 wassen omvatten. Daarentegen-geïsoleerde vaten, reeds op bepaalde werkwijzen en kan worden gebruikt voor de thermische behandeling van plantenextracten 20, maar de schaalbaarheid en energie overdrachtssnelheid beperkt omdat de oppervlakte-volumeverhouding van de tank geleidelijk verlaagd en ongeschikt wordt op procesniveau schaal. Een warmtewisselaar is een technisch goed gedefinieerde alternatief roervaten verhit maar vereist een overvloedige toevoer van verwarmings- en koelmiddelen zoals stoom en koud water, evenals een strak volumestroom die geschikt is om de warmtewisselaar geometrie en media eigenschappen, bijv., de soortelijke warmte. Dit artikel laat zien hoe alle drie methoden voor de warmte-geïnduceerde precipitatie van tabak HCPs en planten HCPs in het algemeen. De oprichting en de werking van each werkwijze in een laboratoriumomgeving worden gebruikt om hun geschiktheid voor grootschalige processen te evalueren. De grote uitdaging is om een ​​adequate schaal-down modellen en actief voorwaarden te identificeren voor elke operatie die de apparaten en voorwaarden gebruikt tijdens proces-grootschalige productie lijken. De hier gepresenteerde gegevens hebben betrekking op experimenten met transgene tabaksplanten expressie het malariavaccin Vax8 en fluorescerend eiwit DsRed 16, maar de methode is ook met succes toegepast op N. benthamiana planten transient expressie andere biofarmaceutische eiwitten 21.

Een ontwerp-of-experimenten (DoE) benaderen 22 kan procesontwikkeling vergemakkelijken en flocculatoren 23 kan ook nuttig in deze context zijn zoals eerder beschreven 8. Het belangrijkste verschil tussen blancheren verwarmde tanks en warmtewisselaars is dat blancheren wordt toegepast op intacte bladeren vroeg in het proces, terwijl de others toegepast op plantenextracten (figuur 1).

figure-introduction-1
Figuur 1:. Process Flow Scheme Ter illustratie van de uitvoering van drie verschillende methoden voor tabak HCP Heat Neerslag Het plantmateriaal wordt gewassen en gehomogeniseerd voor verduidelijking en zuivering. Apparatuur voor het blancheren stap (rood) kan eenvoudig aan de bestaande machines worden toegevoegd. In tegenstelling tot het gebruik van een geroerd vat (oranje) en in het bijzonder een warmtewisselaar (blauw) vereist een of meerdere extra apparatuur en leidingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Ontwikkel de Installaties van de tabak

  1. Spoel elk blok minerale wol met 1-2 liter gedeïoniseerd water en vervolgens met 1 liter 0,1% [w / v] kunstmestoplossing. Plaats een tabak zaad in elke minerale wol blok en voorzichtig spoelen met 0,25 L van kunstmest oplossing zonder wegwassen van het zaad 16.
  2. Cultiveren van de tabaksplanten 7 weken in een kas met 70% relatieve vochtigheid, een 16 uur fotoperiode (180 umol sec - 1 m - 2; λ = 400 - 700 nm) en een 25/22 ° C licht / donker regime temperatuur.
  3. Oogst alle bladeren behalve de vier zaadlob bladeren, die zich aan de voet van de plant stem.

2. Optioneel: Heat Neerslag door Blancheren

OPMERKING: Voer de stappen beschreven in stappen 2,1-2,12 om tabak HCPs neerslaan door blancheren. Sla de hele sectie 2, als de HCPs wordt neergeslagenin een verwarmde vat (deel 4) of met behulp van een warmtewisselaar (hoofdstuk 5).

  1. Zet opzij 50 g plantmateriaal en extractie uit te voeren zonder blancheren (deel 3). Neem een ​​monster van dit extract als een interne controle tijdens de verdere analyse (hoofdstuk 7).
  2. Opzetten van een 8-L werkvolume waterbad, bijvoorbeeld 50 x 40 x 40 cm, in een thermisch geïsoleerde polystyreenschuim emmer of dergelijke. Monteer de regelbare thermostaat op het water bad voor verdere temperatuurregeling (stap 2.7).
  3. Breng de gehele samenstel op een magnetische roer bord en leg een magnetische roerstaaf in het waterbad. Zorgen dat het magnetische veld sterk genoeg is om de roerstaaf te roteren.
  4. Omringen de roerstaaf met minstens vier support tegels waarop een polypropyleen korf (stap 2,6) later tijdens de blancheer- procedure wordt geplaatst. Controleer of de drager tegels zijn gemaakt van een niet-magnetisch materiaal (bijvoorbeeld roestvrij staal legering met nikkel) en dathoger zijn dan de roerstaaf (figuur 2).
  5. Voeg 8 L gedemineraliseerd water in het waterbad.
    Opmerking. Het gebruik van een buffer, bijvoorbeeld 50 mM natriumfosfaat (pH 7,5), kan het doeleiwit opbrengsten verbeteren als lage pH precipitatie is een probleem.
  6. Plaats een 23 x 23 x 23 cm polypropyleen mand op de steun tegels en zorg ervoor dat de korf niet interfereert met het roerstaafje rotatie en dat het volledig is ondergedompeld in de vloeistof. Voeg zo nodig extra water / buffer totdat de mand volledig is ondergedompeld, dan weer verwijder de mand.
    LET OP: Alle volgende stappen tot aan 2,12 betrekking hebben op de behandeling van hete vloeistof. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder thermisch isolerende handschoenen.
  7. Met de instelbare thermostaat op het waterbad van 70 ° C (of de vereiste temperatuur voor de experimenten) brengen. Wacht tenminste 15 minuten na de gewenste temperatuur is bereikt om het gehele samenstel te waarborgen heeft bereikt thermal evenwicht.
  8. Bereid 150 g hoeveelheden van de geoogste tabaksbladeren. Plaats een hoeveelheid in het mandje met vermijding irreversibele compressie en schade aan de bladeren, bijvoorbeeld door scheuren. Vermijd overvulling van de mand met plantaardig materiaal of een dichte pakking van de laatste.
  9. Voorzichtig maar snel onderdompelen de mand in de hete vloeistof en plaats het op de steun tegels. Plaats een roestvrij stalen blok bovenop de mand flotatie voorkomen.
  10. Incubeer de bladeren voor 5 min in het blancheren vloeistof, of selecteer een tijd die past bij de experimentele opzet. Controleer de vloeistoftemperatuur gedurende de gehele incubatieperiode.
  11. Haal de mand uit het blancheren vloeistof en laat de resterende vloeistof drain uit de bladeren gedurende 30 sec. Neem dan de bladeren van de planten uit de mand, overbrengen naar de blender en onmiddellijk de extractie (deel 3) te starten.
    OPMERKING: Planten kunnen voor langere tijd bewaard na blancheren en voorafgaand aan the extractie, bijvoorbeeld meer dan 30 min op ijs of bevroren bij -20 ° C gedurende enkele weken is met succes getest. Echter, kan het product stabiliteit afnemen met toenemende bewaartijd en dus onmiddellijke verwerking wordt aanbevolen.
  12. Herhaal stap 2,8-2,11 met verse bladmateriaal tot de volledige geoogste biomassa wordt verwerkt.

3. Protein Extraction uit Tobacco Leaves

LET OP: De volgende stappen leiden tot een blender met roterende bladen. Werk niet in de blender emmer, terwijl het op de blender motor is gemonteerd.

  1. Plaats 150 g (nat gewicht) van geoogst (stap 1,3) of geblancheerd (stap 2.11) bladeren in de blender en voeg 450 ml extractiebuffer (50 mM natriumfosfaat, 500 mM natriumchloride, 10 mM natriumbisulfiet, pH 8,0).
    OPMERKING: De extractiebuffer samenstelling afhankelijk van de eiwit te extraheren en dus aanpassing, bijvoorbeeld, gebruik van een pH vereisen of buffer component zoals Tris.
  2. Homogeniseren van de bladeren voor 3 x 30 sec pulsen met 30 sec afgewisseld pauzes. Zorg ervoor dat de bladeren zijn gehomogeniseerd en niet verstoppen de blender emmer. Stop de blender en til de bladeren verstoppingen te voorkomen, indien nodig, en dan verder de homogenisering.
  3. Neem een ​​monster 1 ml van elk extract dat wordt geproduceerd voor verdere analyse (hoofdstuk 7). Als de plant materiaal wordt geblancheerd, blijft hoofdstuk 6. Ga anders verder met warmte neerslag in een vat (deel 4) of warmtewisselaar (hoofdstuk 5), afhankelijk van de gekozen experimentele benadering.

4. Optioneel: Warmte Neerslag in een geroerd vat

OPMERKING: Voer de stappen in secties 4,2-4,11 beschreven om tabak HCPs neerslag in een geroerd vat. Sla de hele afdeling 4, indien HCPs hebben door blancheren (deel 2) is neergeslagen of zullen worden neergeslagen met behulp van een warmtewisselaar (hoofdstuk 5).

  1. Instellen van twee 8-L werkvolume waterbaden, bijvoorbeeld 50 x 40 x 40 cm, in thermisch geïsoleerd polystyreenschuim of dergelijke. In het eerste bad, zet de instelbare thermostaat voor de volgende temperatuurregeling (stap 4.6). In de tweede, voeg 5 L gedeïoniseerd water en 2 kg ijs vervolgens afkoelen (stap 4,9).
  2. Breng de eerste waterbad op een magnetische roerplaat en plaats de 2-roestvast stalen vat in het waterbad, zodat het midden van het vat is gericht naar het midden van de roerplaat.
  3. Plaats een magnetische roerstaaf in de roestvrij stalen vat. Zorgen dat het magnetische veld sterk genoeg is om de roerstaaf te roteren.
  4. Vul het waterbad met gedeïoniseerd water tot 5 cm onder de bovenkant van het roestvast stalen vat. Vul dan het schip met extractiebuffer. Plaats een polystyreenschuim deksel op het vat.
    LET OP: Alle volgende stappen tot aan 4.9 betrekking hebben op de behandeling van hete vloeistof. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder thermisch insulated handschoenen.
  5. Plaats een thermometer in het roestvast stalen vat door middel van een passend bij gat in het piepschuim deksel. Stel het waterbad temperatuur tot 78 ° C en incubeer het geheel gedurende 15 min thermisch evenwicht bereiken. Zorg ervoor dat de temperatuur in het vat is 70 ° C, ongeveer 8 ° C onder de ingestelde waarde van het waterbad.
  6. Indien de temperatuur in het roestvast stalen vat verschilt van 70 ° C, stel de temperatuur van het waterbad en bijgevolg laat het systeem equilibreren gedurende 15 min. Herhaal deze stap tot de temperatuur in het vat is 70 ° C of zoals vereist voor het experiment en leeg het roestvast stalen vat.
  7. Giet 300 ml extract (stap 3,2) in de roestvast stalen vat terwijl het nog in het waterbad en start een timer. Roer het extract bij 150 rpm en incubeer gedurende 5 min. Zorgen dat het extract gedurende deze incubatieperiode een temperatuur van 70 ° C gedurende ten minste 2 min bereikt.
  8. Verwijder het warmwaterbad van de magneetroerder, verwijder de roestvast stalen vat en plaats het in de ijskoude emmer. Plaats de laatste op de magneetroerder en verwijder het piepschuim deksel.
  9. Controleer of de plantenhomogenaat goed geroerd met 150 rpm plaats de thermometer in het extract en incubeer totdat het een temperatuur van 20 ° C en de temperatuur door de proefopzet bereikt.
  10. Herhaal stap 4,7-4,9 voor alle monsters. Neem een ​​monster 1 ml van elk warmte neergeslagen halen zodra het de uiteindelijke temperatuur heeft bereikt, ga dan verder met hoofdstuk 6.

5. Optioneel: Warmte Neerslag in een warmtewisselaar

OPMERKING: Voer de stappen in paragrafen 5,2-5,12 beschreven om tabak HCPs behulp van een warmtewisselaar neerslaan. Sla de hele afdeling 5, indien HCPs zijn neergeslagen door blancheren (hoofdstuk 2) of in een verwarmde vat (deel 4).

  1. Instellen van twee 8-L werkvolumewaterbaden, bijvoorbeeld 50 x 40 x 40 cm, in thermisch geïsoleerde polystyreenschuim emmers en dergelijke. In het eerste bad, zet de instelbare thermostaat voor de volgende temperatuurregeling (stap 5.3). In de tweede, voeg 5 L gedeïoniseerd water en 2 kg ijs vervolgens afkoelen (stap 5.10).
    LET OP: Alle volgende stappen tot aan 5.9 betrekking hebben op de behandeling van hete vloeistof. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder thermisch isolerende handschoenen.
  2. Vul het eerste waterbad met 8 liter gedemineraliseerd water. Stel de temperatuur tot 74,5 ° C met behulp van de thermostaat. Incubeer de assemblage gedurende 15 min thermisch evenwicht te bereiken.
  3. Bereid een geïsoleerd opslagvat door het plaatsen van een 0,5-L plastic beker in een 1-L plastic beker en vul de gaten met watten. U kunt ook gebruik maken van een speciale thermisch geïsoleerd vat met een 0,5-L werkvolume.
  4. Sluit de warmtewisselaar naar de peristaltische pomp aan één einde en een uitlaatslang op de allemaalr beëindigen via L / S 24 buizen. Plaats beide uiteinden buis samen met een thermometer in het voorraadvat geïsoleerde vullen met 300 ml extractiebuffer (figuur 2).
  5. Plaats de warmtewisselaar in het hete waterbad en start de peristaltische pomp met een snelheid van 300 ml min -1. Zorg ervoor dat de resulterende temperatuur in het vat is 70 ° C, ongeveer 4,5 ° C onder de ingestelde waarde van het waterbad, na 3 min.
  6. Als de temperatuur in de geisoleerde schip afwijkt van 70 ° C, stel de temperatuur van het waterbad en bijgevolg laat het systeem equilibreren gedurende 15 min. Herhaal deze stap tot de temperatuur van de extractiebuffer toe van omgevingstemperatuur tot 70 ° C in minder dan 3 minuten, of gelijk aan die welke voor het experiment en leeg de roestvrij stalen vat.
  7. Gooi de extractie buffer van de geïsoleerde vat en voor te bereiden van 300 ml porties van het plantenextract. Vul het geïsoleerde vat met één portie.
  8. Pomp de plantenextract (paragraaf 3.3) door de warmtewisselaar bij 300 ml min -1 gedurende 5 minuten. Zorg ervoor dat het extract temperatuur van 70 ° C na 3 min of gelijk is aan de temperatuur die in de experimentele opzet.
  9. Na 5 minuten, plaats de warmtewisselaar in de ijskoud waterbad terwijl het extract nog wordt gepompt. Incubate in deze instelling tot de temperatuur precies bereikt 20 ° C, of ​​de temperatuur die in de experimentele opzet.
  10. Verwijder de toevoerslang is verbonden met de peristaltische pomp van de geïsoleerde vat en blijven pompen residuele warmte geprecipiteerd plantenextract verzamelen vanuit de warmtewisselaar. stop dan de pomp.
  11. Herhaal stap 5,7-5,10 alle monsters. Neem een ​​monster van 1 ml van elk warmte neergeslagen extract nadat het de uiteindelijke temperatuur heeft bereikt, dan doorgeven aan de extracten aan zak filtratie (hoofdstuk 6).
    NB: Na een eerste doorlopen stappen 5,7-5,10 zal er geen extractiebuffer te zijngooi in stap 5.7.

6. Zak Filtratie van het plantenextract

  1. Monteer zakkenfilter in de overeenkomstige drager mand die in het filterhuis is aangebracht en biedt mechanische ondersteuning voor een flexibel filtermateriaal. Plaats een 1-L vat onder de mand en het extract fracties (sectie 3.3, 4,10 en 5,11, afhankelijk van de geselecteerde warmtebehandeling) aan de zak toe te passen bij een snelheid van 150 ml min -1.
  2. Na filtratie, het meten van de troebelheid van een 1:10 verdunning van het filtraat in extractiebuffer met behulp van de troebelheidsmeter.
  3. Neem een monster 1 ml en verwerken zak filtraat zoals gedefinieerd in de experimentele opzet, bijvoorbeeld dieptefiltratie en chromatografie 7,10.

7. Sample Analysis

  1. Meet de totale hoeveelheid oplosbare proteïne (TSP) volgens de methode van Bradford 24,25.
    1. In drievoud pipet 2,5 ul van elk monster in de putjes van een enkele96-well plaat. Bestaat uit acht runderserumalbumine (BSA) standaarden in drievoud meetgebied 0 - 2000 ug ml-1.
    2. Voeg 200 ul Bradford-reagens aan elke well en meng door en neer te pipetteren maar voorzichtig genoeg om te voorkomen dat bellen vormen.
    3. Incubeer gedurende 10 minuten bij 22 ° C en meet de absorptie bij 595 nm in een spectrofotometer. Bereken de TSP-concentratie in de basis van een standaard curve door de BSA referentiepunten samples.
  2. Kwantificeren Vax8 door surface plasmon resonance spectroscopy 26.
    1. Stel het oppervlak plasmon resonantie apparaat met 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) loopbuffer (10 mM HEPES, 3 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 1500 mM natriumchloride, 0,05% v / v polysorbaat 20, pH 7,4) en zet een gecarboxymethyleerd dextran chip oppervlak in het apparaat. Gebruik de primaire functie om het systeem te spoelen en start een manuele run met een debiet van 30pl min -1 overstromen cellen 1 en 2. Injecteren 30 mM zoutzuur tweemaal gedurende 60 seconden met 60 seconden afgewisseld injectie van 25 mM natriumhydroxide.
    2. Bereid 200 ul van een 500 ug ml-1 mAb 5,2-oplossing in 10 mM natriumacetaat (pH 4,0). Ontdooi 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) en N-hydroxysuccinimide (NHS) flesjes en centrifugeer ze bij 16.000 xg gedurende 1 min. Mix 70 ul van EDC met 70 pi van de NHS en over te dragen aan een 7-mm plastic flesje.
    3. Activeer de gecarboxymethyleerde dextran chip oppervlak oppervlak door het injecteren van de EDC / NHS mengsel over stroomcellen 1 en 2 gedurende 10 minuten met een stroomsnelheid van 10 pl min -1.
    4. Stel de stromingsbaan slechts cel 2 stromen. Paar mAb 5,2 door intraveneuze toediening gedurende 15 minuten bij een snelheid van 10 pl min -1.
    5. Schakelt het stroompad cellen 1 en 2 stroomt en injecteer ethanolamine gedurende 7 minuten bij een debiet van 5 pl min -1 het oppervlak te deactiveren. Tkip injecteren 30 mM zoutzuur tweemaal gedurende 60 seconden met 60 seconden afgewisseld injectie van 25 mM natriumhydroxide.
    6. Injecteer de monsters en MSP1 - 19 standaarden met een snelheid van 30 pl min -1 voor 180 sec. Zorg ervoor dat de Vax8 concentratie is 50 - 1000 ng ml -1. Bereid pre-verdunningen in HEPES gebufferde zoutoplossing met EDTA en polysorbaat 20 (HBSEP) indien nodig.
    7. Trek het sterkste signaal van doorstroomcel 1 van dat van stroomcel 2 en gebruik het verschil met de Vax8 concentratie in monsters gebaseerd op het signaal van de MSP 1 berekenen - 19 injectie met een bekende eiwitconcentratie van 500 ng ml-1.
    8. Regeneratie van de chip oppervlak na elke monster of MSP 1-19 injectie door blootstelling aan 30 mM zoutzuur gedurende 60 sec bij een stroomsnelheid van 30 pl min -1.
  3. Kwantificeren DsRed door middel van fluorescentie spectrometrie
    1. In drievoud Pipetteer 50 ul van elk monster in de enkele putjes van een zwarte halve-area 96-well plaat. Inclusief zes DsRed normen voor het bereik van 0-225 ug ml-1.
    2. Meet de fluorescentie in tweevoud met behulp van een 530 ± 30 nm excitatie- filter en een 590 ± 35 nm emissiefilter in een spectrofotometer. Bereken de DsRed concentratie in de basis van een standaard curve door de DsRed referentiepunten samples.
  4. Bepaling van deeltjesgrootte verdelingen
    1. Was een cuvet met 1 ml isopropanol en vervolgens met 2 ml gedeïoniseerd water om stof te verwijderen. Pipetteer 850 ul van het monster in de cuvet.
    2. Plaats de cuvet in de zeta potentiaal en deeltjesgrootte analysator. Open de "Software" en start een handmatige meting met "eiwit" als het materiaal en "PBS" als de verspreider. Selecteer een temperatuur van 25 ° C en een equilibratie tijd van 180 sec.
    3. Kies de "DTS0012" cel en meet aan 173 ° backscatter. Controleer de "auto" function voor de duur meten en selecteer drie metingen zonder afgewisseld vertraging.
    4. Onderzoek de deeltjesgrootteverdeling piekprofiel wanneer de meting voltooid door het selecteren van de drie metingen van het monster in het experiment weergave. Kies het tabblad "Volume PSD".

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Warmte precipitatie van tabak gastheerceleiwitten door blancheren
Het blancheermedium werkwijze onder punt 2 beschreven werd met succes gebruikt om HCPs precipiteren van tabaksbladeren met 70 ° C, waardoor de TSP bij 96 ± 1% (n = 3) onder winning tot 51% van de Vax8 doeleiwit, en aldus meer de zuiverheid van 0,1% tot 1,2% voor 16 chromatografische scheiding. Het was ook mogelijk om te herstellen 83 ± 1% (n = 3) van het fluorescente eiwit DsRed, verhoging van de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De drie methoden voor warmte-precipitatie hierboven beschreven effectief verwijderen tabak HCPs voorafgaand aan een chromatografische zuiveringsstap 16,17. Zij vullen andere strategieën die gericht zijn oorspronkelijke product zuiverheid, bijvoorbeeld guttatie 29, rhizosecretion 30 of centrifugale extractie 31,32, die beperkt zijn tot uitgescheiden eiwitten verhogen. Echter, de warmte gebaseerde methoden alleen gebruikt op een zinvolle wijze als het doeleiwit te zuive...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen Dr. Thomas Rademacher, Alexander Boes en Veronique Beiß bedanken voor het verstrekken van de transgene tabakzaden, en Ibrahim Al Amedi voor het kweken van de tabakplanten. De auteurs willen Dr. Richard M. Twyman bedanken voor redactionele assistentie, evenals Güven Edgü voor het verstrekken van de MSP1-19 referentie. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de European Research Council Advanced Grant ''Future-Pharma'', voorstelnummer 269110, de Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Toekomststichting) en Fraunhofer-Gesellschaft Interne Programma's onder subsidienummer Attract 125-600164.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2100P Portable TurbidimeterHach4650000Turbidimeter
Amine Coupling KitGE HealthcareBR100050 SPR chip coupling kit
Autoclaving basketNalgene6917-0230Mandje voor het blancheren van bladeren
Biacore T200GE Healthcare28-9750-01SPR apparaat
Bio Cell Analyser BCA 003 R&D with 3D ORMSequipn.a.Deeltjesgrootte-analysator
BlenderWaring800EGBlender
BP-410Furh2632410001Zakfilter
Centrifuge 5415DEppendorf5424 000.410Centrifuge
Centrifuge tube 15 mlLabomedic2017106Reactiebuis
Centrifuge tube 50 ml zelfstandigLabomedic1110504Reactiebuis
CM5 chipGE HealthcareBR100012 Chip voor SPR-metingen
Cuvette 10 x 10 x 45Sarsted67.754Cuvet voor Zetasizer Nano ZS
Design-Expert(R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.DoE-software
DinatriumfosfaatCarl Roth GmbH 4984.3 Mediacomponent
Ferty 2 MegaKammlott5.220072Meststof
Forma -86C ULT-vrieskastThermoFisher88400Vrieskast
Kassenn.a.n.a.Voor plantenteelt
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cmGrodan102446Steengoedblok
Twentey-loop warmtewisselaar (4,8 m lengte)n.a. (op maat)n.a.Warmtewisselaar
HEPESCarl Roth GmbH9105.3Mediacomponent
K200P 60DPall5302303Dieptefilterlaag
KS50P 60DPallB12486Dieptefilterlaag
Lauda E300Lauda Dr Wobser GmbHZ90010Waterbadthermostaat
L/S 24MasterflexSN-06508-24Buis
mAb 5.2American Type Culture CollectionHB-9148Vax8-specifiek antilichaam
Masterflex L/SMasterflexHV-77921-75Peristaltiekpomp
MiraclothLabomedic475855-1RFilterdoek
MultiLine Multi 3410 IDSWTWWTW_2020pH-meter / geleidbaarheidsmeter
Osram cool white 36 WOsram4930440Lichtbron
PhytotronIlka Zelln.a.Voor plantenteelt
NatriumdisulfaatCarl Roth GmbH8554.1Mediacomponent
NatriumchlorideCarl Roth GmbHP029.2Mediacomponent
RVS-vat; 0,7 kg 2,0 L; hoogte 180 mm; diameter 120 mmn.a. (op maat)n.a.Container voor hitteprecipitatie
Synergy HTBioTekSIAFRTFluorescentie- en spectrometrische platenlezer
VelaPad 60PallVP60G03KNH4Filterbehuizing
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600DLS-meting van deeltjesgrootteverdeling
Zetasizer Software v7.11Malvernn.a.Software voor het bedienen van het Zetasizer Nano ZS-apparaat

Referenties

  1. PhRMA. 2013 Report: Medicines in Development - Biologics. , Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. Washington, D.C., USA. (2013).
  2. Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
  3. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. C. Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases. Annu. Rev. Plant Biol. 65, 743-768 (2014).
  4. Melnik, S., Stoger, E. Green factories for biopharmaceuticals. Curr. Med. Chem. 20, 1038-1046 (2013).
  5. Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
  6. Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
  7. Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
  9. Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
  10. Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
  11. Buyel, J. F., Woo, J. A., Cramer, S. M., Fischer, R. The use of quantitative structure-activity relationship models to develop optimized processes for the removal of tobacco host cell proteins during biopharmaceutical production. J. Chromatogr. A. 1322, 18-28 (2013).
  12. Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
  13. Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
  14. Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
  15. Arfi, Z. A., Drossard, J., Hellwig, S., Fischer, R., Buyel, J. F. Polyclonal antibodies can effectively detect tobacco host cell proteins after RuBisCO depletion and endotoxin removal. Biotechnol. J. , (2015).
  16. Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
  17. Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
  18. Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
  19. Ma, J. K., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).
  20. Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. Postharvest treatments of fresh produce. Philos T R Soc A. 372, (2014).
  21. Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. , (2015).
  22. Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216(2014).
  23. Buyel, J. F. Procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts. J. Vis. Exp. , e53940(2016).
  24. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 76, (2006).
  25. Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
  26. Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. Surface plasmon resonance biosensing. Methods Mol. Biol. 503, 65-88 (2009).
  27. Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., Kim, J. Thermal behavior of proteins: Heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes. Biochemistry-Us. 39, 14839-14846 (2000).
  28. Kwon, S., Jung, Y., Lim, D. Proteomic analysis of heat-stable proteins in Escherichia coli. Bmb Rep. 41, 108-111 (2008).
  29. Komarnytsky, S., Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Alam, M. Z., Raskin, I. Production of recombinant proteins in tobacco guttation fluid. Plant Physiol. 124, 927-933 (2000).
  30. Drake, P. M. W., et al. Development of rhizosecretion as a production system for recombinant proteins from hydroponic cultivated tobacco. FASEB J. 23, 3581-3589 (2009).
  31. Turpen, T. H. Tobacco mosaic virus and the virescence of biotechnology. Philos. Trans. R. Soc. Lond., Ser. B: Biol. Sci. 354, 665-673 (1999).
  32. Kingsbury, N. J., McDonald, K. A. Quantitative Evaluation of E1 Endoglucanase Recovery from Tobacco Leaves Using the Vacuum Infiltration-Centrifugation Method. Biomed. Res. Int. , (2014).
  33. Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. , (2015).
  34. Mandal, M. K., Fischer, R., Schillberg, S., Schiermeyer, A. Inhibition of protease activity by antisense RNA improves recombinant protein production in Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY-2) suspension cells. Biotechnol. J. 9, 1065-1073 (2014).
  35. Welty, J. R., Wicks, C. E., Wilson, R. E. Fundamentals of momentum, heat, and mass transfer. , Wiley. (1976).
  36. Lowe, D., et al. Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics. Advances in protein chemistry and structural biology. 84, 41-61 (2011).
  37. Gong, R., et al. Engineered human antibody constant domains with increased stability. J. Biol. Chem. 284, 14203-14210 (2009).
  38. Rouet, R., Lowe, D., Christ, D. Stability engineering of the human antibody repertoire. FEBS Lett. 588, 269-277 (2014).
  39. Stabel, J. R., Lambertz, A. Efficacy of pasteurization conditions for the inactivation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in milk. J. Food Prot. 67, 2719-2726 (2004).
  40. Wichers, H. Ch. 12. Managing Allergens in Food. Mills, C., Wichers, H., Hoffmann-Sommergruber, K. , Elsevier Science. 336(2006).
  41. Davis, P. J., Williams, S. C. Protein modification by thermal processing. Allergy. 53, 102-105 (1998).
  42. Dubois, M. F., Hovanessian, A. G., Bensaude, O. Heat-shock-induced denaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferon-induced p68 kinase. J. Biol. Chem. 266, 9707-9711 (1991).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Blancheren van tabaksplantenhittebehandeling extractenprecipitatie in een geroerde reactoropstelling van warmtewisselaarexperimenteel ontwerpchromatografische zuiveringdownstream filtratieanalyse van eiwitzuiverheidprocesoptimalisatie

Gerelateerde artikelen