Het bepalen van onderdrukking van het immuunsysteem versus CNS Bescherming voor farmacologische interventies bij auto-Demyelinisatie

Samenvatting

Dit protocol beschrijft hoe te bepalen of farmacologische behandelingen voor experimentele auto-immuun encefalomyelitis CNS-bescherming vertonen als gevolg van het onderdrukken van immuuncel-infiltratie of neuroprotectief zijn tijdens de aanval van immuuncel-infiltratie.

Samenvatting

Een belangrijk kenmerk van de auto-immuun demyeliniserende ziekte multiple sclerose (MS) is het binnendringen van immuuncellen in de hersenen en het ruggenmerg, wat resulteert in myelindestruc­tie, die niet alleen de geleiding van zenuwimpulsen vertraagt, maar ook axonale schade veroorzaakt, wat leidt tot motorische en cognitieve achteruitgang. Huidige behandelingen voor MS zijn gericht op het verminderen van het binnendringen van immuuncellen in het centrale zenuwstelsel (CZS). Deze behandelingen verminderen het aantal terugvallen, verbeteren de kwaliteit van leven, maar elimineren terugvallen niet volledig, waardoor langdurige handicap niet wordt verbeterd. Daarom zijn therapeutische middelen die het CZS beschermen gerechtvaardigd. Zowel in diermodellen als bij menselijke patiënten met MS wordt het binnendringen van T-cellen in het CZS over het algemeen beschouwd als het initiërende ontstekingsproces. Om te beoordelen of een geneesmiddel het CZS beschermt, moeten alle mogelijke effecten op het binnendringen of de proliferatie van immuuncellen in de periferie worden uitgesloten. Dit protocol beschrijft hoe te bepalen of CZS-bescherming die wordt waargenomen na geneesmiddelinterventie, een gevolg is van het verminderen van CZS-infiltrerende immuuncellen of het blokkeren van de dood van CZS-cellen tijdens ontstekingsstoten. De mogelijkheid om MS-behandelingen te onderzoeken die beschermend zijn voor het CZS tijdens ontstekingsstoten is zeer cruciaal voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën, aangezien huidige behandelingen terugvallen verminderen, maar niet volledig elimineren (d.w.z. immuuncellen infiltratie), waardoor het CZS kwetsbaar blijft voor degeneratie.

Inleiding

Multiple sclerose (MS) wordt gekenmerkt door inflammatoire lesies overwegend witte stof hersengebieden begin van de ziekte. Na langdurige progressie is grijze stof atrofie gedetecteerd door MRI en markeert de neurodegeneratieve fase van de ziekte. Reactieve gliosis, demyelinisatie en axonale schade in de witte stof worden toegeschreven aan CNS-infiltrerende immuuncellen. Geen van de behandelingen momenteel in MS keren of direct neurodegeneratie te voorkomen in het CZS - maar verminderen ze ontstekingen dempt T-celactivering en / of infiltratie in het CNS. Omdat er geen genezing voor MS en patiënten met behulp van de huidige behandelingen blijven progressie van de ziekte ervaren, ontdekkingen van geneesmiddelen die demyelinisatie en neuronale verlies te voorkomen zijn van cruciaal belang. Echter een verschil tussen de effecten op immune cellen en die op het centrale zenuwstelsel kan moeilijk experimenteel zijn, als resultaat - dat wil zeggen, minder schade aan het CZS - ziet de same ongeacht de mechanismen waardoor het zich voordoet. Daarom moet het mogelijk CZS bescherming worden samen met beoordeling van CNS-infiltrerende immuuncellen en proliferatie van immuuncellen in de periferie te bepalen hoe farmacologische middelen beïnvloeden ziektemechanisme.

Experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) is een gevestigde diermodel van autoimmune ontstekingsziekten die direct verantwoordelijk voor de ontdekking van geneesmiddelen die momenteel voor de behandeling van MS ^1-4 was. Muizen worden vaak gebruikt voor EAE, met C57BL / 6-muizen een populaire soort, afkomstig van de beschikbaarheid van genetische varianten. C57BL / 6-muizen geïnduceerd met EAE vertonen chronische progressie van de ziekte optreden rond dag 10 na inductie. Infiltratie van het ruggenmerg parenchym en cerebellum zijn kenmerkend voor de histopathologie van deze dieren, met afwezigheid van infiltratie in de corticale parenchym ^5. Bovendien, corticale letsels en demyelinisatie in Bregen zijn kenmerken van de ziekte ^6-9, die relatief afwezig in C57BL / 6 muizen. Daarom kan het de voorkeur indien mogelijk SJL muizen, die recidieve ziekten en afwijkingen in zowel de hersenen en het ruggenmerg die vergelijkbaar zijn met die in MS ¹⁰ weergegeven hebben gebruikt.

De behandeling kan niet worden aangemerkt als neurobeschermende als immuuncellen de CNS nooit bereiken. Daarom dit protocol maakt gebruik van flowcytometrische analyse van hersenen, ruggenmerg en de milt van muizen EAE behandelingseffecten op immuuncellen infiltratie in het CNS en de proliferatie van immune cellen in de periferie te bepalen zoals eerder aangetoond ^11. Immunohistochemische analyses van CZS-weefsel te bepalen omvang en aard van neuroprotectie wordt ook beschreven. Een combinatie van deze methoden maakt te bepalen of immune cellen geactiveerd en verspreidden zich in de periferie of immuuncellen ging de CNS en of het CNS was protected van ontsteking of beschadiging. Als neuroprotectieve effecten worden verdacht ondanks effecten op het immuunsysteem, kunnen onderzoekers veranderen behandeling starttijden na immune cel infiltratie in het CNS is opgetreden.

Hier presenteren we een protocol met twee verschillende modellen van actieve EAE, een T-cel gemedieerde diermodel van MS en flowcytometrie analyse gecombineerd met immunohistochemie op verschillende tijdstippen tijdens de ziekte op de werkzaamheid van experimentele therapieën bepalen verschillende aspecten van MS pathogenese. Deze methode zal onderzoekers helpen bij het differentiëren tussen de effecten op het immuunsysteem proliferatie en infiltratie versus CNS bescherming cel, waardoor het makkelijker wordt om een ​​beperking van hoe drugs handelen pathogenese van de ziekte.

Protocol

Experimentele procedures waarbij muizen moeten voldoen aan de relevante institutionele en overheidsvoorschriften. Voor het onderhavige onderzoek werden muizen gehuisvest en in overeenstemming met de National Institutes of Health en de Universiteit van Alabama in Birmingham Institutional Animal Care en gebruik Comite richtlijnen behandeld.

1. EAE Inductie en Scoring

1. EAE induceren in C57BL / 6 muizen ^11-13 of SJL-muizen zoals eerder beschreven ^{10,11 13.}
   LET OP: Experimentatoren moet kiezen voor een model ideaal is voor hun onderzoeksvraag (zie bespreking voor meer detail).
2. Record scores dagelijks zoals eerder beschreven ¹¹ voor elke muis beginnend op dag 7 post-inductie. Vergelijk gemiddelde dagelijkse scores in de tijd tussen de behandelingsgroepen.

2. Behandeling

1. Behandel EAE muizen voordat ontstaan ​​van de ziekte om te bepalen of de behandeling van invloed op het immuunsysteem infiltratie of proliferatie.
   1. Kies een behandeling, method levering en behandelingsfrequentie inachtneming van de drug bloed-hersenbarrière permeabiliteit, halfwaardetijd en dosering.
      OPMERKING: EAE verhoogt bloed-hersenbarrière permeabiliteit en toestaan ​​geneesmiddelen om het CZS die anders zouden kunnen bij gezonde dieren bereiken. Experimenten voor de dosis-respons curven kijken EAE klinische scores kunnen helpen bij het kiezen van een geschikte dosis van het geneesmiddel. bedieningsorganen van het voertuig moeten worden uitgevoerd in parallel met behandeling met geneesmiddelen. Als alternatief kan conditionele knockout muizen worden gebruikt met nestgenoten als controles.
   2. Gebruik SJL of C57BL / 6-muizen voor dit experiment. Behandel muizen vroeg na EAE inductie (dag 7), vóór aanvang van de symptomen met behulp van de gekozen wijze van levering.
   3. Offeren en ontleden muizen op de piek van de ziekte (ongeveer dag 15), zoals in stap 3,1 en de sub-stappen, op basis van de hoogste klinische score gemiddelde in de tijd.
   4. Conduct flowcytometrie op de muis ruggenmerg (zoals in stap 3.2) naar immuuncel infiltrati bepalenop het CZS en milten (zoals in stap 3,3) immuun celproliferatie in de periferie bepalen. Op aparte muizen, gedrag immunohistochemie (zoals in stap 4) om astrocyten en microglia, en het behoud van myeline te kwantificeren.
2. Behandelen EAE muizen na begin van de ziekte te bepalen of behandeling beschermt het CNS na immuuncel infiltratie opgetreden.
   1. Herhaal stap 2.1.1.
   2. Gebruik SJL-muizen voor dit experiment, omdat deze muizen meetbare ziekte remissies. Behandel muizen tijdens de eerste piek in de ziekte (of, indien gewenst, op het hoogtepunt van een volgend recidief), gemeten door de gemiddelde klinische scores.
   3. Offer muizen op een gewenst tijdstip na EAE inductie. Omdat infiltratie al heeft plaatsgevonden, kan het niet zinvol zijn om infiltratie gemeten door FACS-analyse. Echter nemen ruggenmerg reactieve gliosis en myeline kwantificeren om te bepalen of er CNS bescherming ondanks immuuncel infiltratie.

3. Flowcytometrieanalyse

1. ontleding
   1. Label drie 15 ml conische buizen (een voor de hersenen, een voor ruggenmerg, en een voor milt) per dier met ID van het dier en het type weefsel bevatte. Bewaar alle weefsels in afzonderlijke buizen voor de hele procedure op ijs.
   2. Voor FACS-analyse van de milt, offeren muizen op de piek van de ziekte (~ 15 dagen na EAE-inductie) op kooldioxide met een stroomsnelheid van ongeveer 15% container volume per minuut gedurende 2-3 minuten. Bevestig euthanasie door het ontbreken van de ademhaling. Na opoffering van elke muis, verwijder de milt ¹⁴ en het in een individu, gelabelde 15 ml conische buis (uit stap 3.1.1) met ijskoude RPMI gesupplementeerd met 2% FCS, 100 IU penicilline en 100 ug / ml streptomycine ( aangeduid als "media" gehele protocol).
   3. Voor FACS analyse van de hersenen en het ruggenmerg, cardiale perfusie uitgevoerd door het snijden van de muis rechteratrium met chirurgische schaar circulatin vrijgeveng bloed en doorboren van de linker hartkamer met een naald verbonden met een injectiespuit gevuld met 10 ml ijskoude PBS. Injecteer langzaam de 10 ml PBS.
   4. Snijd het hoofd van de muis en maak een verknipt de middellijn van de hoofdhuid met chirurgische schaar. Schil de huid weer met de hand of met een tang en een verknipt de middellijn van de schedel met chirurgische schaar, met behulp van de ingang van het ruggenmerg als een basisplaats.
   5. Afpellen van de schedel met micro pincet en gebruik een schepje om de hersenen te bevrijden. Plaats de hersenen in gelabelde 15 ml conische buizen (uit stap 3.1.1) bevattende media.
   6. Verwijder het vel van de muis met een tang en chirurgische schaar, en uithalen van de muis met behulp van chirurgische schaar. Snijd de ledematen, staart, ribben, en alle omliggende spieren met chirurgische schaar om de wervelkolom te bevrijden.
   7. Snijd de wervelkolom in ongeveer 5 ongeveer gelijke stukken met chirurgische schaar en knijp het ene uiteinde van een stuk met een hemostat, en vervolgens een andere hemostaat to blijven knijpen, bewegen langs het stuk tot aan het ruggenmerg perst uit de top. Herhaal deze procedure voor elk stuk van de wervelkolom en plaats de koorden in afzonderlijke, gelabelde 15 ml conische buizen (uit stap 3.1.1) bevattende media.
2. Beoordeling van immuuncelinfiltraten die optreden in de hersenen en het ruggenmerg
   1. Snijd de hersenen en het ruggenmerg in kleinere stukken met behulp van steriele schaar. Plet met de plunjer van een 3 ml spuit over een 70 micrometer cel zeef in een nieuwe 50 ml buis, terwijl het spoelen van de zeef met de media. Breng elke buis tot een volume van 50 ml met media. Centrifugeer bij 453 xg gedurende 5 minuten tot pellet cellen.
   2. Aspireren supernatant en resuspendeer pellet in 4 ml 40% dichtheidsgradiënt media. overlay de 40% dichtheidsgradiënt bevattende cellen bovenop 2 ml 70% dichtheidsgradiënt in een nieuwe 15 ml conische buis-pipet langzaam op de wand van de conische buis zorgvuldig de juiste gelaagdheid van het verloop waarborgen. Spin bij 796 xg gedurende 20 min bij kamertemperatuur ondereen rem.
   3. Haal de bovenste laag van de myeline verloop met een 1 ml overdracht pipet, verwijder vervolgens levensvatbare cellen op het grensvlak met een 1 ml pipet overdracht en overdracht naar een nieuwe 15 ml conische buis. Breng de buis 15 ml met medium en centrifugeer bij 448 xg gedurende 10 min.
   4. Resuspendeer pellet in 200 pl medium en plaats in één putje van een 96-well rondbodem plaat (elk monster van elk dier zullen in een eigen bron). Centrifugeer de plaat bij 410 xg gedurende 5 minuten.
   5. Flick uit het supernatant en resuspendeer pellet in 200 pl opnieuw stimuleren (RPMI gesupplementeerd met 10% FCS, 100 IU / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine, 1 x niet-essentiële aminozuren, 1 mM natriumpyruvaat en 55 uM β-mercaptoethanol, plus 50 ng / ml forbolmyristaatacetaat (PMA), 750 ng / ml ionomycine, en het eiwit remmer van Brefeldine A). Plaats de plaat in een incubator bij 37 ^° C gedurende 4 uur.
      LET OP: PMA en ionomycin herstimulatie resulteert in activatie van T-lymfocyten-ongeacht hun antigeenspecificiteit teneinde het totale aantal elke T cel subsets in bepaald weefsel te beoordelen. Echter kunnen antigeenspecifieke effector T-cel responsen op verschillende manieren, waaronder restimulating cellen met MOG peptide in aanwezigheid van Brefeldine A ^15,16 worden beoordeeld.
   6. Beoordeling van CNS CD4 ⁺ T cel fenotypes
      1. Na incubatie gecentrifugeerd met 96 putjes ronde bodemplaat (uit stap 3.2.5), bij 410 xg gedurende 5 minuten en flick uit de supernatant. Alle volgende kleuring stappen in deze plaat uitgevoerd.
      2. Was de cellen in 200 ul PBS met 2% FCS en centrifugeer bij 410 xg gedurende 5 minuten. Flick off supernatant en incubeer cellen met 200 pi PBS dat 2% FCS met Fc Block (kloon 2.4G2) gedurende 10 - 15 min op ijs.
      3. De extracellulaire vlek Centrifugeer cellen beginnen bij 410 xg gedurende 5 minuten, flick uit supernatant en resuspendeer pellet in 50 &# 956; l van aanslag op het oppervlak cocktail met fluorofoor gemerkte antilichamen tegen CD4 (1: 200, 1 ug / ml), TcR (1: 200, 1 ug / ml) en levensvatbaarheid kleurstof (1: 500) verdund in PBS gedurende 15 min op ijs. Centrifugeer cellen op 410 xg gedurende 5 minuten en flick off supernatant. Was cellen 2x in 200 pi PBS en centrifugeer bij 410 xg gedurende 5 minuten.
      4. Na het verwijderen van de extracellulaire vlek, inleiding van de intracellulaire kleuring procedure door de fixatie / permeabilisatie gevolgd door intracellulaire kleuring.
         1. Om te beginnen, flick off bovendrijvende en repareren / permeabilize cellen met Foxp3 transcriptiefactor kleurstoffen ¹⁷ (volgens de instructies van de fabrikant, zie Materials List) gedurende 30 minuten om 's nachts bij 4 ^° C.
         2. Was de cellen in 150 ul permeabilisatie buffer uit de set en centrifugeer plaat bij 410 xg gedurende 5 minuten. Flick uit supernatant en vlek cellen in 50 ul permeabilisatie buffer met fluorofoor gemerkte-antilichamen tegen IL-17A (1: 200, 1 ug / ml), IFN-γ (1: 200, 1 ug / ml) en Foxp3 (1: 200, 2,5 gg / ml) verdund in PBS gedurende 30 min op ijs.
         3. Centrifugeer cellen op 410 xg gedurende 5 minuten en flick off supernatant. Voor het verwijderen van overtollige antilichamen wassen 3x in 200 ul permeabilisatie buffer vervolgens centrifugeren bij 410 xg gedurende 5 minuten. Flick uit supernatant en resuspendeer in 200 ul PBS.
         4. Analyseer cellen door flowcytometrie, gating op levende CD4 ⁺ TcR ⁺ cellen zoals eerder beschreven ¹¹ tot percentage cellen dat elk molecuul bepalen. Tel de cellen met een hemocytometer ¹⁸ of andere gevalideerde methode om het aantal cellen per muis bij elk van de CD4 ⁺ T-cel fenotypes bepalen.
         5. Met behulp van de verkregen gegevens, berekenen percentage en het aantal CD4 ⁺ T-cellen infiltreren in de hersenen en het ruggenmerg van elke muis, met een bijzondere aandacht voor deze populaties die cruciale rol in EAE pathogenese en bescherming te spelen^19: IL-17A ⁺ IFN-γ ^-, IL-17A ⁺ IFN-γ ^+, IL-17A ^- IFN-γ ^{+, Foxp3.}
3. Controle van het perifere proliferatie en activering van T-cellen
   1. Crush milt met matglas dia's in een 60 x 15 mm cultuur schotel. Plaats celsuspensie in een 15 ml conische buis met behulp van de media om cellen op te schorten. Vulbuis tot 15 ml met medium en centrifugeer cellen bij 448 xg gedurende 5 minuten.
   2. Aspiraat media en resuspendeer pellet in 2 ml ACK lyserende buffer bij kamertemperatuur om rode bloedcellen te lyseren gedurende ongeveer 3 minuten.
   3. Breng de buis om het volume op 15 ml met media en spanning over een 70 micrometer cel zeef in een nieuwe buis. Centrifugeer cellen bij 448 g gedurende 5 minuten, zuig de supernatant en resuspendeer in 2 ml media.
   4. Controle van het perifere CD4 ⁺ T-cel proliferatie door Ki-67 kleuring
      1. Plaats een kleine hoeveelheid (meestal 200 pl) van equivalent aantal splenocyten van 3.3.3 in afzonderlijke putjes (één per monster) in een 96 putjes ronde bodemplaat.
      2. Centrifugeer bij 410 xg gedurende 5 minuten en flick off supernatant. Resuspendeer in 200 ul PBS bevattende 2% FCS en herhaalde centrifugatie. Flick uit supernatant en resuspendeer cellen met PBS met 2% FCS met Fc Block (kloon 2.4G2) en incubeer gedurende 10 - 15 min op ijs. Voor extracellulaire vlek herhaal stap 3.2.6.3.
      3. Na het verwijderen van de extracellulaire vlek, inleiding van de intracellulaire kleuring procedure door de fixatie / permeabilisatie gevolgd door intracellulaire kleuring.
         1. Herhaal stap 3.2.6.4.1.
         2. Centrifugeer cellen op 410 xg gedurende 5 minuten en flick off supernatant. Wassen cellen in 200 pl 1x permeabilisatie buffer uit de set en centrifugeer bij 410 xg gedurende 5 minuten. Flick off supernatant en vlek cellen in 50 ul permeabilisatie buffer met anti-Ki-67 antilichaam (1: 200, 1 ug / ml) gedurende 30 min.
         3. Centrifugeer cellen op 410 xg for 5 min en flick off supernatant. Was cellen 2x in 200 gl permeabilisatie buffer uit de set en centrifugeer bij 410 xg gedurende 5 minuten.
         4. Flick off supernatant en was 1x cellen in 200 pi PBS en centrifugeer bij 410 xg gedurende 5 minuten. Analyseer cellen door flowcytometrie, gating op levende CD4 ⁺ TcR ⁺ cellen zoals eerder beschreven ^11, dan beoordeelt procent Ki-67 ⁺ -cellen.
   5. Controle van het perifere CD4 ⁺ T-cel fenotypes
      1. Plaats 200 ul cellen (uit stap 3.3.3) in een 96 putjes ronde bodemplaat (één putje per monster) en centrifugeer bij 410 xg gedurende 5 minuten en opnieuw stimuleren zoals in 3.2.5.
      2. Plaats de plaat in een incubator bij 37 ^° C gedurende 4 uur. Voer dezelfde kleuring procedure als in stap 3.2.6 en de sub-stappen. Analyseer de cellen door flowcytometrie zoals in 3.2.6.4.4-3.2.6.5.5.

4. Immunohistochemie eend kwantificering

1. tissue voorbereiding
   1. Offeren EAE muizen in een afzonderlijk experiment die worden gebruikt in stap 3 en substappen op elk moment na EAE-inductie (vaak ~ dag 30 tijdens de chronische fase van de ziekte C57BL / 6 muizen of tijdens een piek in gemiddelde klinische scores voor SJL muizen) naar aanleiding van de onderstaande stappen om de omvang van reactieve gliosis en demyelinisatie te bepalen.
   2. Verdoven muizen met 2,5% isofluraan en 97,5% zuurstof en bevestigt de juiste diepte van de anesthesie met een zachte teen knijpen behulp van een tang, op zoek naar een gebrek aan reactie. Voer transcardiale perfusie zoals beschreven in stap 3.1.3. Na de injectie PBS in de linker ventrikel, gebruik dan een nieuwe injectiespuit met 10 ml van 4% paraformaldehyde in PBS LET injecteren. Paraformaldehyde is een huid en longen irriterende, kan ernstige schade aan de ogen veroorzaken, en wordt verdacht van het veroorzaken van kanker. Vermijd inademing, inslikken en contact met de huid en ogen. Perfusie moeten worden uitgevoerd in een zuurkast.
   3. Verwijder hersenen en wervelkolommen zoals beschreven in de stappen 3.1.4 - 3.1.6. Bind wervelkolommen te sticks met een touwtje om rechte lijn van het ruggenmerg te verzekeren.
   4. Zet hersenen in scintillatieflesjes gelabeld met ID van het dier met ongeveer 20 ml 4% paraformaldehyde in PBS en ruggenmerg in 50 ml conische buizen voorzien van ID van het dier met ongeveer 50 ml 4% paraformaldehyde in PBS post-fix nacht.
   5. Om hersenen cryoprotect, spoel 3 keer in 1x PBS en bewaar bij 4 ^° C in 30% sucrose in 1x PBS. Laat de hersenen om naar de bodem van de verpakking (ongeveer 3 dagen).
   6. Verwijdert calcium uit de wervelkolom door spoelen 3 maal in 1x PBS en het in een groot volume (ongeveer 50 ml voor een muis ruggenmerg) van 0,5 M EDTA in 1 x PBS (vanaf pH zal ~ 10; pH op ~ 7,8 met 6 N HCl) gedurende 2-3 weken totdat het been niet meer rigide. Cryoprotect de wervelkolom door stap 4.1.5.
   7. Insluiten hersenen enwervelkolommen in OCT na de substappen onderstaande zodra ze naar de bodem van de verpakking.
      1. Voeg een mengsel van 1 deel 30% sucrose in 1x PBS en 2 delen oktober (bijvoorbeeld, voeg 15 ml 30% sucrose in 1 x PBS tot 30 ml OCT).
      2. Voeg oktober / sucrose mengsel aan de inbedding mal (22 x 22 x 20 mm voor de hersenen en 22 x 30 x 20 mm voor het ruggenmerg) tot ongeveer ½ vol.
      3. Snijd wervelkolommen in 6 even grote stukken met behulp van een scheermesje en plaats in een 22 x 30 x 20 mm inbedding mal naar voren voor coronale ruggenmerg secties. Plaats de hele hersenen in 22 x 22 x 20 mm mallen naar voren.
      4. Voeg oktober / sucrose mengsel om het weefsel te bedekken en laat het zitten gedurende 1 uur. dus bellen kan ontsnappen. Tijdens deze uur, voeg 2-methylbutaan naar een gerecht dat het inbedden van matrijzen voor flash-bevriezing kan houden. Zet de schotel op droog ijs en dekken voor een pre-cool.
      5. Flash-bevriezing van de schimmel in 2-methylbutaan op droog ijs en op te slaan bij -80 ^o C binnenkant van acontainer om uitdroging te voorkomen.
   8. Als u klaar bent, sectie weefsel bij 16 micrometer met een cryostaat en monteren op elektrostatisch geladen dia's. Zet elke 10 ^ste gedeelte op een dia elk voor de hersenen en het ruggenmerg (bijvoorbeeld dia 1 zal secties 1, 11 hebben, en 21, en ​​schuif 2 zal in paragraaf 2, 12 hebben, en 22, en ga zo maar door). Store dia's bij -80 ^o C of meteen gebruiken voor het kleuren.
2. Kleuring voor reactieve gliosis en myeline
   1. Als u klaar bent voor het kleuren, kiest u een dia elk voor de hersenen en het ruggenmerg per vlek voor elk dier in dezelfde (of zo dicht mogelijk) regio. Voor de hersenen, kiest u dia's tonen het corpus callosum en cingulum bundel.
   2. Plaats de glaasjes met weefsel op een verwarmingsblok bij 70 ^° C gedurende 7 min. Na 7 minuten zet het vuur blok en laat de dia's te koelen op de hitte blok voor nog eens 10 - 15 min. Dit voorkomt weefselsecties vallen buiten de objectglaasjes gedurende de kleuringsprocedure.
   3. Wassen slides 3 maal elk in 1x PBS met 0,1% niet-ionogeen detergens (voor intracellulaire antigenen) of 1x PBS (voor antilichamen gericht oppervlakteantigenen) gedurende 5 min.
      OPMERKING: Aangezien de met dit protocol antilichamen intracellulair wordt ionogene detergentia worden gebruikt in daaropvolgende stappen. Laat nooit dia's goed drogen na deze stap.
   4. Plaats de glaasjes in een houder en deksel met citraatbuffer pH 3,0. Om citraatbuffer, voegt 0,192 g watervrij citroenzuur tot een eindvolume van 100 ml in water. Stel de pH met azijnzuur bij temperaturen boven pH 3,0 of NaOH als hieronder.
   5. Incubeer objectglaasjes bij 37 ^° C gedurende 30 minuten en was 3 maal in 1x PBS met 0,1% ionogeen wasmiddel voor 5 min.
   6. Cirkel een gebied rond het weefsel met een hydrofobe barrière pen en plaats de objectglaasjes in een vochtige kamer (bijvoorbeeld een dia doos met natte papieren handdoeken). Voeg het blokkeren van buffer aan het weefsel. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
      LET OP: Het blokkeren van buffer bestaat uit 1x PBSplus 0,3% niet-ionische reinigingsmiddel en de juiste serum (5%), gebaseerd op de host van het secundaire antilichaam, dat wil zeggen, paard serum voor myeline basisch eiwit (MBP) en gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP), en geit serum voor Iba1.
   7. Flick blokkeerbuffer van de glijbanen en voeg primair antilichaam (1: 1000 of 0,2 ug / ml geit anti-myeline basisch eiwit voor oligodendrocyten, 1: 1000 of 1 ug / ml tot 3 ug / ml muis anti-GFAP voor astrocytes of 1 : 750 of 0,67 ug / ml konijn anti-Iba1 voor microglia) verdund in de juiste blokkerende buffer (zie stap 4.2.6) om het omcirkelde gebied. Laat bij 4 ^° C gedurende de nacht in de vochtige kamer.
   8. Flick antilichamen in blokkeerbuffer van de glijbanen en was de objectglaasjes 3 keer in 1 x PBS met 0,1% ionogeen wasmiddel voor 5 min.
   9. Voeg secundair antilichaam (1: 200 of 7,5 ug / ml gebiotinyleerd paard anti-muis voor de MBP en GFAP, of gebiotinyleerd geit anti-konijn voor Iba1) verdund in de juiste blokkerende buffer (zie step 4.2.6) met de omcirkelde stippellijn laat dia geïncubeerd in de bevochtigde kamer gedurende 1 uur bij KT.
   10. Flick antilichamen in blokkeerbuffer van de glijbanen en was de objectglaasjes 3 keer in 1 x PBS met 0,1% ionogeen wasmiddel voor 5 min.
   11. Bereid avidine-biotine-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase (zie materialen lijst) 30 min voor gebruik en ageren op een shaker totdat het nodig is in 4.2.12. Voeg 0,3% H ₂ O ₂ in methanol om het omcirkelde gebied voor 10 min endogene peroxidase activiteit te blussen.
   12. Flick oplossing van de glijbanen en wassen in 2 keer in 1x PBS of 1x PBS met 0,1% ionogeen detergens gedurende 5 min, dan 1 keer in 1 x PBS. Voeg ABC reagens met de omcirkelde gebied voor 30 min.
   13. Flick oplossing van de glijbanen en was 3 maal in 1x PBS gedurende 5 minuten, vervolgens 2 keer in water gedurende 5 minuten. Maak oplossing 3,3'-diaminobenzidine (DAB) (zie Materials List) en voeg deze toe aan de secties omvatten.
       LET OP: Deze stap vereist een microscoop te observeren optimaal te detecterenion moment van kleuring en moet worden uitgevoerd gedurende dezelfde hoeveelheid tijd voor dia's te vergelijken.
   14. Wassen glijdt 3 keer in water gedurende 5 minuten elk. Dehydrateer het weefsel door het plaatsen in de volgende oplossingen gedurende 2 minuten per: 70% ethanol in water, 95% ethanol in water, 100% ethanol in water, 50% xyleen en 50% ethanol, 100% xylenen. Zegel een dekglaasje op de dia met een harsachtige montage medium.
   15. Alternatief voeren immunofluorescentiekleuring zoals eerder beschreven ¹¹ reactieve gliosis gebruik van antilichamen tegen Iba-1 en GFAP beoordelen.
   16. Neem afbeeldingen van elke ruggenmerg sectie (gekleurd met de respectieve antilichamen met behulp van DAB) met een 4X, 0,13 NA doelstelling en de beelden op te slaan als .tiff. U kunt ook foto's van het corpus callosum en cingulum bundel in de linker of rechter hersenhelft met behulp van een 20X, 0,50 NA doelstelling en de beelden op te slaan als .tiff. Een uitgebreidere bepaling van laesies in de hersenen, is het voor beide omvatten hemispheres in analyses.
3. Het meten van de gemiddelde fractie ruimte voor reactieve gliosis (Iba1 en GFAP kleuring)
   1. Download NIH ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) en open op een computer. Op ImageJ software, gebruikt u het menu snaar Bestand> Openen en selecteert u een afbeelding vanaf stap 4.2.16. Teken een gebied met behulp van de "Polygon selecties" tool op de menubalk. Voor ruggenmerg, traceren van de hele sectie; voor hersenen, het corpus callosum en cingulum bundel. Omzetten op de afbeelding om 16-bits door te gaan naar Afbeelding> Type en te klikken op "16-bit."
   2. De-ruis het beeld door te gaan naar Proces> Aftrekken Background en zet de "Rolling bal radius" ten minste de grootte van het grootste object dat geen deel uitmaakt van de achtergrond (zie de ImageJ gebruikershandleiding op http: //rsbweb.nih .gov / ij / docs / gids / 146-29.html).
      LET OP: Voor een 4X beeld van Iba-1 kleuring gebruiken we 4,0 en voor GFAP wij gebruiken 50.0, maar deze aantallen kunnen variëren, afhankelijk van beeldvergroting en vlekken intensity.
   3. Check "Sliding Paraboloïde" en klik op "OK". Ga naar Afbeelding> Aanpassen> Drempel ... en stel de lagere drempel niveau (de bovenste balk) met behulp van de schuifbalken. Neem alleen kleuring die cellulaire en zijn consistent beelden. Voor beelden met donkere achtergronden (geldt alleen voor fluorescerende vlekken), ervoor zorgen dat de "Donkere achtergrond" vakje aangevinkt.
   4. Ga naar Analyze> Set Metingen ... en kies "Area fractie" (geeft het percentage thresholded gebied binnen de regio van belang). Zorg dat "Beperk tot drempel" is uitgeschakeld en "Toon label 'is aangevinkt. Klik op "OK" als u klaar bent.
   5. Om metingen te verkrijgen, gaat u naar Analyze> Measure. A "Results" pop-up box zal verschijnen en deze gegevens kunnen worden opgeslagen als is of gekopieerd in een ander programma. Voor de analyse, te vergelijken "Area-fractie" waarden tussen de behandelingsgroepen.
4. Kwantificering van MBP kleuring door optical dichtheid
   1. beeld Open en teken een gebied van belang, zoals beschreven in stap 4.3.1. Ga naar Analyze> Set Metingen ... en selecteer "Mean grijswaarde" (de som van grijswaarden binnen de selectie, gedeeld door het aantal pixels). Zorg dat "Beperk tot drempel" is uitgeschakeld en "Toon label 'is aangevinkt. Klik op "OK" als u klaar bent.
   2. Om metingen te verkrijgen, gaat u naar Analyze> Measure. Zich aan een "Resultaten" pop-upvenster verschijnt. Kopieer deze gegevens en opslaan als is of kopiëren in een ander programma.
   3. Voor de analyse, kopiëren en plakken waarden in een ander programma. Converteren gemiddelde grijswaarde in optische dichtheid (OD) volgens de formule: OD = ₁₀ log (255 / gemiddelde grijswaarde).

Resultaten

Hier gebruikten we twee modellen van EAE te begrijpen als een farmacologisch middel biedt CNS bescherming door een verzachtende CNS-infiltrerende T-cellen of voorkomen van myeline en axonen letsel tijdens de aanval van inflammatoire immuun cel infiltratie. Om te bepalen of een therapeutisch middel voorkomt immune cel infiltratie in het ruggenmerg, is de C57BL / 6 muizenmodel van chronische EAE gebruikt wanneer immuuncellen infiltratie en pathologie voornamelijk ligt in het ruggenmerg (figuur 1A). Om te bepalen of een therapeutisch geneesmiddel verschaft CNS bescherming tijdens het binnendringen van immuuncellen in het CNS, de SJL diermodel van EAE recidieve gebruikt die pathologie toont in zowel de hersenen en het ruggenmerg (Figuur 1B).

Clinical Assessments

Relevante klinische evaluaties worden uitgevoerd volgens de volgende rubriek voor typische (figuur 1C) of atypische (figuur 1D) EAE. Voor typische klinische ziekte, een score van 0 is geen abnormaal gedrag. Als deze wordt opgepakt door de basis van de staart, kan de staart snel roteren (net als een helikopter rotor) en de achterste benen uit elkaar. Een klinische score van 1 is een gedeeltelijk slappe staart, die kan worden bepaald door het optillen van de muis door de basis van de staart. De gewone helikopter-achtige roterende kan worden verzwakt of afwezig zijn, en een deel van de staart kan volledig slap. Een handige manier om te bepalen omvang van de staart verlamming is om je vinger omhoog de lengte van de staart lopen, als een unparalyzed staart meestal krullen rond de vinger, terwijl een gedeeltelijk verlamd staart niet in staat om dat te doen zal zijn. Een klinische score van 2 een volledig verlamd staart. Geen beweging van de staart treedt helemaal bij het ophalen van de muis bij de basis van de staart. Een klinische score van 3 vertegenwoordigt een gedeeltelijke verlamming. Bepaling van deze score vereist dat de muis vrij te bewegen op een flat oppervlak. Als een achterpoot sleept als de muis naar voren beweegt, of als een of beide achterpoten lijken gedeeltelijk verlamd te zijn, kan een score van 3 worden gegeven. Een klinische score van 4 staat voor volledige verlamming van de achterpoten. Met deze score, zal een muis niet meer aan zijn achterpoten te bewegen en zal zich te slepen naar voren met behulp van de voorste ledematen. Een klinische score van 5 betekent een stervende muis of een muis met moeite bewegen zich over zijn kooi of ademhalen. Als een muis zich niet langs de bodem van de kooi of de ademhaling moeizaam kan slepen, moet de muis humane wijze worden gedood. Een klinische score van 6 een muis dood aangetroffen in zijn kooi. Een score van 6 is ongebruikelijk en de oorzaken van andere dan EAE de dood moeten worden onderzocht.

Atypische klinische ziekte kan al dan niet gepaard gaan met verlamming. Het kan nodig twee aparte scoring omvatten als een muis weer met atypische ziekte plus typische symptomen. Een score van 0 is geen abnormaal gedrag, eens met de typische scoresysteem. Een klinische score van 1 betekent een lichte kop turn of kantelen, terwijl de muis loopt. Deze kan worden vastgesteld doordat de muis naar voren lopen en observeren van een constante links of rechts gerichtheid zijn beweging. Een klinische score van 2 geeft een meer uitgesproken hoofd te draaien en slechte oprichtende vermogen. Net als bij een atypisch score van 1, de muis heeft gerichtheid om zijn beweging en kan lichte problemen met de balans te hebben. Een klinische score van 3 vertegenwoordigt een onvermogen om te lopen in een rechte lijn. De muis zal moeilijk balanceren en kan gebruik maken van de kant van de kooi naar rechts te helpen zichzelf als het loopt. Een klinische score van 4 een muis tot op zijn kant, niet in staat om te lopen als gevolg van het balanceren van problemen. De muis in staat zijn om zich sleuren de bodem van de kooi, maar kan directionaliteit moet zijn beweging. Een klinische score van 5 vertegenwoordigt doorrolt tenzij ondersteund. Een muis die deze score bereikt worden op humane wijze gedood. Een clinical score van 6 een muis dood aangetroffen in zijn kooi. Een score van 6 is ongebruikelijk en de oorzaken van andere dan EAE de dood moeten worden onderzocht.

Het kan nodig zijn om voor "in-between" scores zijn, bijvoorbeeld, het toevoegen van 0,5 tot een score als voorwaarde veranderingen een muis lichtjes of als kiezen tussen twee scores is moeilijk. Bijvoorbeeld, een muis die begint om langzamer te bewegen dan zijn normale tegenhangers, maar geeft geen verlamming, of een muis die zijn achterste poten omklemt met de voorkant in plaats van wijd te spreiden haar benen toen opgepikt door de staart kan een score van 0,5 worden gegeven . Een muis die zich alleen over de bodem van de kooi slepen en is alleen in staat om haar achterpoten periodiek trillen of bij aanraking kan een score van 3,5 wordt gegeven.

Het beoordelen van een verlaging van de immuuncel Infiltration

Na inductie van EAE in de C57BL / 6 muismodel (Figuur 1A, dag 0), antigeen Presentatop en proliferatie van T-cellen in de milt plaatsvinden op dagen 1-5 gevolgd door immuuncellen infiltratie in het CNS rond dag 7 ongeveer 3 tot 5 dagen na de initiële immune celinfiltratie muizen aanwezig met klinische scores. Te beoordelen of een therapeutisch middel blokkeert immune cel infiltratie in het ruggenmerg worden drugs of drager ingebracht op dag 7 na antigeen presentatie en proliferatie in de milt en vóór immuuncellen beginnen te infiltreren in het ruggenmerg. Als immune infiltratie is verzwakt, dient het klinisch ziekteverloop verbeterde klinische scores tijdens de stijgende fase van de ziekte van 10 tot 15 dagen (figuur 2) weerspiegelen.

Een vermindering van immuun infiltratie zou ook resulteren in verminderde inflammatoire processen. Reactieve astrocytose en microgliosis worden beschouwd als de belangrijkste kenmerken voor neuroinflammatie. Kleuring voor astrocyten met GFAP en microglia met Iba-1 kan vervolgens worden gebruikt om te beoordelen Changes in gemiddelde oppervlak fractie kleuring kwantificeren neuroinflammatie (figuur 3).

Om te bepalen of immuun cel infiltratie wordt verminderd, worden de ruggenmerg verwijderd en verwerkt voor flowcytometrie-analyse op het hoogtepunt van de ziekte (figuur 1A, ongeveer dag 18). Dit zorgt ervoor dat het grootste aantal immuuncellen in het ruggenmerg heeft ingevoerd. Ingang van T-cellen in het CZS wordt beschouwd als de initiërende gebeurtenis en inflammatoire zowel Th1 en Th17 cellen in dierlijke modellen van EAE en MS. Bij elkaar genomen, moet flowcytometrische analyse omvat de beoordeling van beide soorten pathogene T-cellen. Bovendien Tregs goed gekarakteriseerde suppressor-T-cellen die ziekte temperen. Daarom moet het percentage Tregs een totale CD4 ⁺ populatie geëvalueerd vergeleken met het percentage van effector T-cel populaties. Dit zal onthullen als een algehele vermindering van T-cel infiltratie heeft plaatsgevonden of als there is een scheeftrekken van T cel fenotypes in het CZS. Representatieve dot plots (Figuur 4A) tonen een vermindering van de totale aantal CD4 ⁺ infiltrerende T-cellen in het ruggenmerg van-geneesmiddel behandelde muizen in vergelijking met het ruggenmerg van het voertuig behandelde muizen (nummers in de rechterbovenhoek kwadranten). IFN-γ ⁺ IL-17 ⁺ en Foxp3 ^+, respectievelijk worden verlaagd (Figuur 4A): Th1, Th17 en Treg cellen de volgende ondertekening eiwitten geëvalueerd evalueren. Statistische analyse worden uitgevoerd op CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ IL-17 ⁺ en Foxp3 ⁺ celaantallen significante reductie (figuur 4B) tonen. Uit te sluiten scheeftrekken van T cel subsets, statistische beoordeling van het percentage IFN-γ ⁺ IL-17 ^+, IFN-γ ⁺ IL-17 ^- IL-17 ⁺ IFN-γ ^- en Foxp3 ⁺ cellen wordt uitgevoerd ( Figuur 4C).

Om de mogelijkheid dat een vermindering van CNS-infiltrerende T-cellen is een gevolg van de remming proliferatie, activatie en differentiatie in de periferie te elimineren, het aantal actief prolifererende T-cellen alsook de hoeveelheid T cel subtypes geëvalueerd worden. Geen verandering in het percentage CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ IL-17 ⁺ of ^Foxp3 moeten vinden als activering en differentiatie niet beïnvloed (Figuur 5A). Bovendien moet geen verandering in Ki67 ⁺ CD4 ⁺ cellen worden gevonden als proliferatie niet beïnvloed (Figuur 5B). Geneesmiddelbehandelingen worden geïntroduceerd op dag 7 of hoger te vermijden wijziging initiële antigeenpresentatie en T-celactivering in de periferie. Echter, in de genetische modellen eiwitten worden vaak constitutief verwijderd tijdens embryogenese of geïnduceerde voor inductie van EAE maken splenocyten assessment van groot belang.

Het beoordelen van CNS Protection

Om aan te tonen of een bepaald therapeutisch middel moduleert ziekte pathologie in het CZS na immuuncel infiltratie, moet drug interventies worden toegediend tijdens de eerste piek in klinische ziekte scoren. De SJL model van EAE is voordelig voor deze experimenten aangezien deze muizen vertonen een relapsing-remitting fenotype. Als een behandeling met geneesmiddelen voorkomt myeline-axon degeneratie, zal een verbetering van de klinische scores worden waargenomen (Figuur 6). Pathologische beoordeling van myeline moet een vermindering myelinebeschadiging overeenstemming met verbeterde klinische scores bevestigen. Myeline integriteit DAB kleuring van myeline basisch eiwit kwantitatief te evalueren (MBP) wordt uitgevoerd, gevolgd door statistische analyse van de optische dichtheid voor deze kleuring (Figuur 7). Om verder te onderbouwen dat neuroinflammatie wordt ondersteund of verlaagd therapeTherapeutische interventies, kunnen reactieve gliosis worden beoordeeld door het meten gemiddelde fractie ruimte voor reactieve gliosis zoals hierboven (figuur 3) beschreven. Om te bevestigen dat een therapeutische interventie de CNS rechtstreeks beschermt zonder immunomodulerende effecten, moet verzwakking van het immuunsysteem cel infiltratie in het centraal zenuwstelsel en de proliferatie in de milt worden verdisconteerd. Om dit aan te pakken, moeten werkwijzen voor de hersenen en het ruggenmerg beoordeling van immuuncellen infiltratie en controle van het perifere proliferatie en activering van T-cellen wordt uitgevoerd zoals hierboven beschreven (figuren 4 en 5). Tezamen therapeutische middelen die celbeschadiging in het CNS blok geen bewijs voor een vermindering van CNS-infiltrerende T-cellen of proliferatie van T-cellen in de periferie CNS-beschermende behandelingen.

Figuur 1. Representatieve Results Klinische scores van EAE in C57BL / 6 en SJL muizen. (A) Klinische scores (gemiddelde ± SEM) van C57BL / 6 muizen (n = 10) geïnduceerd met MOG _35-55 om EAE te produceren met chronische ziekte. (B) Klinische scores (gemiddelde ± SEM) van SJL-muizen (n = 3) geïnduceerd met PLP _139-151 EAE produceren met recidieve ziekte. (C) De klinische scoring rubriek waarmee u een ziekteprogressie volgen in EAE muizen. (D) De klinische scoring rubriek gebruikt om atypische progressie van de ziekte in EAE muizen te volgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Farmacologische behandeling vóór immuuncel infiltratie in C57BL / 6 muizen met EAE. Klinische score (gemiddelde ± SEM) van C57BL / 6 muizen die met PBS (n = 20) of SAS (n = 19) vanaf dag 7 immunisatie met MOG _35-55. De gegevens zijn afkomstig van drie samengevoegde onafhankelijke experimenten. Statistisch verschil werd bepaald met behulp van een niet-parametrische tweezijdige Mann-Whitney U test, * p <0,05. Re-print met toestemming van (11).

Figuur 3. immunofluorescentiekleuring en kwantificering van reactieve gliosis in ruggenmerg of Control, EAE en behandelde C57BL / 6 muizen. (A) Fluorescente labeling voor GFAP (astrocyten) en Iba-1 (microglia) in het ruggenmerg van controle (niet-geïmmuniseerde ) muizen (links panelen) en EAE muizen behandeld met PBS (middelste panelen) of SAS (rechter panelen). Schaal bar = 100 micrometer. Kwantificering van de kleuring werd bepaald met behulp van het gebied fractie techniek om procent immunop metenOSITIEVE gebied voor GFAP (B) en Iba-1 (C). Gemiddelde ± SEM, n = 3 controle, n = 3 SAS-behandelde of n = 4 PBS-behandelde muizen, 6 delen per muis. Statistische verschillen werden bepaald met een one-way ANOVA, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Re-print met toestemming van (11). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. FACS analyse van EAE C57BL / 6 muis ruggenmerg demonstreren kleinere T-cel infiltratie in behandelde muizen. C57BL / 6-muizen behandeld met PBS of SAS, beginnend 7 d postinduction van EAE. Ruggenmerg werden verkregen op dag 15 (A) Representatieve dot plots tonen Th1 (IFN-γ ⁺ / IL-17 ^-) en Th17 (IFN-γ^- / IL-17 ⁺⁾ cellen CD4 ⁺ gate (bovenste panelen) en regulatoire T-cellen (Foxp3 ⁺⁾ (onderste panelen). Dot plots tonen percentages in de rechterbovenhoek kwadrant. (B) Absolute aantallen CD4 ⁺ -cellen en IFN-γ ^+, IL-17A ⁺ en Foxp3 ⁺ cellen werden statistisch geanalyseerd. (C) De procentuele verandering van T cel populaties tussen SAS- en PBS behandelde muizen EAE werd eveneens onderzocht. Gemiddelde ± SEM, n = 10 voor PBS behandelde en n = 9 voor SAS behandeld twee onafhankelijke experimenten. Tweezijdig t-toets werd gebruikt voor alle grafieken. ** P <0,01. Re-print met toestemming van (11). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. FACS Analyse van EAE C57BL / 6 muis milten Aantonen Equivalent T cel proliferatie en expressieprofielen in behandelde en onbehandelde muizen. Milten van PBS en SAS-behandelde muizen werden geanalyseerd 15 d postinduction van EAE. (A) het percentage van CD4 ⁺ T-cellen Th1 (IFN-γ ⁺ / IL-17 ^-), Th17 (IFN-γ ^- / IL-17 ⁺⁾ en regulatoire T-cellen (Foxp3 ⁺⁾ in de milt van PBS- behandeld (n = 10) en SAS-behandelde (n = 9) muizen uit twee onafhankelijke experimenten. (B, linker paneel) Het percentage van Ki-67 ⁺ cellen in de CD4 ⁺ populatie naïeve milten (n = 4) en uit PBS (n = 5) en SAS-behandelde muizen (n = 5) geïnduceerd met EAE. Een one-way ANOVA-test aangetoond statistische significantie tussen het aandeel van de Ki-67 ⁺ cellen uit naïeve milt in vergelijking met ofwel PBS of SAS-behandelde EAE milt. Geen significantie werd waargenomen tussen PBS en SAS-behandelde EAE milt. (B, rechter paneel) Vertegenwoordiger puntdiagrammen; getallen geven percentage proliferatie. Dot plots tonen percentages. Staafdiagrammen vertegenwoordigen tweezijdige t-toets, *** p <0,001. Re-print met toestemming van (11). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. Farmacologische behandeling na immuuncel infiltratie in SJL muizen met EAE. Klinische score (gemiddelde ± SEM) van SJL-muizen behandeld met PBS (n = 8) en SAS (n = 8) van dag 24 immunisatie (stippellijn) met PLP _139-151. Gegevens zijn gemiddelde ± SEM van klinische scores. Statistisch verschil werd bepaald met behulp van een niet-parametrische tweezijdige Mann-Whitney U test, *** p <0,001. Top lijn geeft waarden die worden gebruikt voor statistischeanalyse. Re-print met toestemming van (11).

Figuur 7. Kwantificering van MBP kleuring met behulp van optische dichtheid. (A) Vertegenwoordiger kleuring van MBP in thoracale ruggenmerg van een niet nader genetische knockout muis vergeleken met littermate controle C57BL / 6 muis geïnduceerd met EAE. Beugel geeft representatieve gebied van verminderde MBP kleuring aangeeft demyelinisatie. (B) MBP kleuring van thoracale ruggenmerg van een niet nader genetische knockout C57BL / 6 muis. (C) opgegeven genetische knockout muizen geïnduceerd met EAE (KO; n = 6 muizen, 2-4 lumbale en thoracale secties per dier) vertonen een hogere optische dichtheid (OD) van MBP kleuring in het ruggenmerg dan wildtype (WT; n = 3 muizen, 2-4 lumbale en thoracale secties per dier) muizen geïnduceerd met EAE. Statistisch geanalyseerd using een tweezijdige t-toets, * p <0,05. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Schaal bar 100 micrometer.

Discussie

Patiënten met MS blijven ziekte recidieven ervaren tijdens het nemen van drugs dat T cel activatie en / of infiltratie te verzwakken in het centraal zenuwstelsel, rechtvaardigt de ontwikkeling van de behandeling opties die het centrale zenuwstelsel rechtstreeks te beschermen. EAE is klassiek gebruikt om de symptomen van MS model en kan een krachtig hulpmiddel zijn bij het ​​bestuderen van de aard van de interacties tussen het immuunsysteem en het centrale zenuwstelsel in vivo. Gebruik timing van de behandeling overwegingen in EAE, bijvoorbeeld voor of na het begin van ziekte, in samenhang met de behandeling immuuncel infiltratie in het CZS en proliferatie en activering in de periferie is het mogelijk de effecten van behandelingen in te gaan op zowel het immuunsysteem het CNS.

Terwijl EAE in de C57BL / 6 muis op grotere schaal toegepast, kunnen EAE in SJL muizen representatiever voor de meeste gevallen van MS, omdat deze muizen een relapsing remitting fenotype en infiltratie van immuuncellen in het parenchymvan de hersenen ^10. SJL muizen duidelijk herstel tijdens remissie en maakt het mogelijk om de behandeling te beginnen nadat de ziekte is gepresenteerd, maar in tijden van verminderde ontsteking. Het is belangrijk om te overwegen dat SJL muizen niet altijd terugvallen en afdragen synchroon, wat resulteert in potentieel grote variabiliteit wanneer de resultaten worden samengevoegd. Daarom kunnen sommige onderzoekers kiezen om representatieve resultaten voor de klinische scores te tonen van het ene dier tijdens het gebruik van muizen voor FACS-analyse en histologie bij geïndividualiseerde punten in de progressie van de ziekte.

Aangezien bij manipulaties worden gegeven aan EAE muizen kunnen helpen bij het bepalen hoe een behandeling beïnvloedt het immuunsysteem of CNS. Er zijn vele opties voor als behandeling begint, elk met zijn eigen connotatie of immuuncellen het CZS heeft ingevoerd en hoe ze kunnen krijgen met het CNS. Behandeling vóór aanvang van de symptomen impliceert dat immuuncellen nog niet heeft ingevoerd of veroorzaakt schade aan het centrale zenuwstelsel.Behandeling na aanvang van de symptomen impliceert dat afweercellen de CNS zijn binnengekomen en wat schade hebben veroorzaakt. SJL-muizen gebruikt, kan de behandeling ook beginnen in een terugval, waarbij immuuncellen actief infiltreren en die ontsteking of tijdens remissie, waarbij immuuncellen minder vaak in het CZS kunnen met minder ontstekingen. Initiële hypotheses over hoe behandelingen beïnvloeden het CNS en het immuunsysteem kan worden gemaakt bij het overwegen wanneer immuuncellen in het ziekteproces tijdens de behandeling.

Er zijn een aantal manieren waarop behandelingen kunnen beïnvloeden immuuncellen en de CNS, elk met het eindresultaat van het verminderen ernst van EAE symptomen. Daarom is het noodzakelijk om flowcytometrische analyse en immunohistochemie om te kijken hoe immuuncellen worden beïnvloed in de periferie en CZS of immuuncellen het CZS heeft ingevoerd, en hoe het CZS reageert op behandeling. Terwijl flowcytometrische analyse van het ruggenmerg kan bepalen hoeveel cellen have ging de CNS op een gegeven moment, kan men vaststellen dat dit effect door verminderde immuuncel handel tenzij proliferatie van immuuncellen wordt niet beïnvloed in de milt. Daarom is het noodzakelijk om zowel perifere als CNS weefsel te analyseren en te bepalen welke resultaten mechanistisch bedoel wanneer beide weefsels worden vergeleken. Het is ook mogelijk dat immuuncel activiteitsprofielen worden gewijzigd door behandeling, bijvoorbeeld met een schakelaar in een pathogene helper T-cel-zwaar profiel een regulatoire T cel zware profiel. Kijkend naar merkers voor verschillende celtypes en vergelijken procent expressie tussen behandelde en onbehandelde dieren is dan ook een belangrijke overweging. Een nieuwe concept in het MS onderzoek suggereert dat B-cellen een belangrijke rol in auto-immune demyelinisatie spelen. Dit is gebaseerd op studies blijkt dat B-cellen nodig zijn voor de reactivering van T-cellen ^20. Dit concept wordt ondersteund door het succes van behandelingen zoals rituximab, een antilichaam tegen CD20 exgedrukt op het oppervlak van B-cellen ^21,22. Zoals aangetoond door het succes van het monoklonale antilichaam ocrelizumab in klinische studies, kunnen medicijnen die verschillende epitopen van CD20 de werkzaamheid van B-cel gerichte therapieën ²³ verbeteren.

Een beperking van de hier gepresenteerde technieken is dat het mogelijk is immuuncellen het CZS voeren maar niet in staat om in de parenchym. Immunohistochemie kan worden gebruikt om perivasculaire cuffing van immuuncellen detecteren en beoordelen afstand in het parenchym tussen behandelde en onbehandelde dieren. Een andere mogelijke beperking betreft de werking van de microbiome op EAE pathogenese. Commensal darmflora kan een enorme invloed op de ziekte pathogenese ^24; derhalve muizen ondergebracht in verschillende kolonies en zelfs in verschillende kooien kunnen grote verschillen in ernst van de ziekte hebben. Dienovereenkomstig is het altijd beter om waar mogelijk nestgenoot controles opgegroeid in dezelfde kooi voor gebruikexperimenten met EAE. Een laatste opmerking is dat als het experimenteel wenselijk het immuunsysteem van cel proliferatieve veranderingen in de periferie te elimineren, kan het mogelijk zijn om dit te doen met passieve overdracht inductie in plaats van de actieve inductie beschreven in dit protocol.

Verdere bevestiging voor neuroprotectie kunnen worden met behulp van een co-kweeksysteem ¹¹ specifieke mechanismen van celdood of door het gebruik van conditionele knockout muizen die zorgt voor verwijdering van eiwitten op selectieve wijze op een celtype testen. Bovendien, om de exploratie van farmacologische middelen die neuroprotectieve zijn uit te breiden, moet markers van axonale doorsnijding en neuronale dood worden opgenomen. Een ander punt van belang is remyelinisatie. Gewonde axonen zijn niet remyelinate lenen verdere ondersteuning dat neuroprotectieve therapieën een belangrijk onderdeel van remyelinisatie therapie moet worden. Bovendien, niet-gemyeliniseerde axonen zijn gevoeliger voor schade dan myelinated axonen. Dit suggereert dat wanneer een axon wordt gedemyeliniseerde therapeutische interventies die tijdig remyelination zal axonen letsel te voorkomen promoten. Om deze mogelijkheden te ontdekken, kunnen andere in vivo modellen voor demyelinisatie en remyelinisatie worden gebruikt (bijv cuprizone en lysolecithine). De hierin beschreven werkwijze gericht op het beoordelen van neuroprotectie door het kwantificeren van myeline verlies. Voor de evaluatie van remyelinisatie het aantal voorlopercellen en hun vermogen om te prolifereren en rijpen ook belangrijk onderzoeken. Met het noemen van deze alternatieve modellen, moet men ook rekening houden met verschillende modellen van hersenontsteking die viraal worden bemiddeld. Er zijn twee goed gekarakteriseerde virale RNA modellen myeline verlies produceren: men Theiler's murine encephalomyelitis, een niet-omhulde Picornaviridae virus, en de andere muis hepatitis virus, lid van de familie Coronaviridae virus ^25,26.

EAE is een waardevol instrument voor studies hoe manipulaties of behandelingen invloed op het immuunsysteem en het CZS in vivo. Het protocol beschreven kunnen helpen bepalen waar behandelingen beïnvloeden het ziekteproces, of het nu in de periferie van de bloed-hersenbarrière of in het CZS. Geen huidige behandelingen voor MS te genezen van de ziekte en de patiënten vaak last van verval in de tijd. Evenzo kunnen andere ziekten waarbij immune cel infiltratie in het CNS en de afbraak van myeline, waaronder acute gedissemineerde encefalomyelitis, transversale myelitis en neuromyelitis optica, gebrek behandelingen die het CZS beschermen zij rechtstreeks aangevallen door infiltrerende immuuncellen. Gezien de timing van de behandeling en het gebruik van flowcytometrische analyse van de milt en het ruggenmerg samen met immunohistochemie van het centraal zenuwstelsel aan ontsteking en beschadiging evalueren zal zorgen voor mechanische vaststellingen worden gemaakt voor behandelingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
22 x 22 x 20 mm inbeddingsvorm	Fisher Scientific	NC9719245
22 x 30 x 20 mm inbeddingsvorm	Fisher Scientific	NC9531194
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Thermo Fisher Scientific	21985-023
2-Methylbutaan	Fisher Scientific	O3551-4
30 x 22 x 20 mm inbeddingsvorm	Fisher Scientific	18-30
ACK Lysering Buffer	Quality Biological	118-156-101
anti-CD4 PE-Cy7	BD Biosciences	552775	0.2 mg/ml stock concentratie
anti-Foxp3-FITC	eBioscience	11-5773-82	0.5 mg/ml stock concentratie
anti-GFAP (Cocktail)	Biolegend	835301	1 - 3 mg/ml stock concentratie
anti-Iba-1 Polyclonal Antibody (50 µg)	Wako	019-19741	0.5 mg/ml stock concentratie
anti-IFN-γ APC	eBioscience	17-7311-82	0.2 mg/ml stock concentratie
anti-IL-17A PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-7177-82	0.2 mg/ml stock concentratie
anti-Ki-67 PE	eBioscience	12-5698-82	0.2 mg/ml stock concentratie
anti-MBP (D-18)	Santa Cruz Biotechnology	sc-13912	0.2 mg/ml stock concentratie
anti-TCRβ FITC	eBioscience	11-5961-85	0.5 mg/ml stock concentratie
anti-TCRβ PE	eBioscience	12-5961-83	0.2 mg/ml stock concentratie
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG	Vector Labs	BA-1000	1.5 mg/ml stock concentratie
Biotinylated Horse Anti-Mouse IgG	Vector Labs	BA-2000	1.5 mg/ml stock concentratie
Citroenzuur, Anhydraat, 99,5%	Fisher Scientific	AC42356-5000
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), tetranatriumzout dihydraat, 99%	Fisher Scientific	AC446085000
Fetaal bovien serum	HyClone	SH30071.03
Fisherbrand Superfrost Plus Microscoopglazen, doos van 10	Fisher Scientific	12-550-15
Golgi Plug	BD Biosciences	555029	eiwittransportremmer
Immedge Hydrofobe Barrière Pen	Fisher Scientific	NC9545623
Ionomycin	EMD Millipore	407952-5mg
L-Glutamine, 100x	Corning	25-005-Cl
MEM Niet-essentiële Aminozuren	Corning	25-025-Cl
Near IR Live/Dead Kleuring Kit	Life Technologies	L10119	levensvatbaarheidskleurstof
Normaal geitenserum	Vector Labs	S-1000
Normaal paardenserum	Vector Labs	S-2000
Paraformaldehyde, 96%	Fisher Scientific	AC416785000
Penicilline-Streptomycine Oplossing, 100x	Corning	30-002-Cl
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	dichtheidsgradient
Permount	Fisher Scientific	SP15-500	harsachtige montagemedium
Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA)	Sigma	P1585-1mg
Gezuiverd anti-Myeline Basiseiwit Antilichaam	BioLegend	808401
RPMI 1640	Corning	10-040-CM
Natrium Pyruvaat	Corning	25-000-Cl
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	niet-ionogene detergent
Vectastain Elite ABC Kit (Standaard)	Fisher Scientific	NC9206402	avidine-biotine-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase
Vector Laboratories Peroxidase Substraat Kit (DAB)	Fisher Scientific	NC9276270	DAB oplossing