Methodenartikel

Externe excitatie van neuronen Met behulp van elektrische en magnetische velden in een-en twee-dimensionale culturen

DOI:

10.3791/54357

⸱

7 mei 2017

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Genetics, The Salk Institute for Biological Studies, 2Department of Physics and SEAS, Harvard University, 3Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuronale kweken zijn een goed model voor het bestuderen van de opkomende hersenstimulatie technieken via hun effect op enkele neuronen of een populatie van neuronen. Hier voorgesteld zijn verschillende methoden voor het stimuleren van neuronale kweken patroon door een elektrisch veld rechtstreeks bad elektroden geproduceerd of geïnduceerd door een in de tijd variërend magnetisch veld.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een neuron een actiepotentiaal wordt geactiveerd wanneer de membraanpotentiaal bepaald maximum overschrijdt. In typische activiteit van de hersenen, dit gebeurt als gevolg van de chemische input zijn synapsen. Echter kunnen neuronen ook worden geëxciteerd door een aangebrachte elektrische veld. In het bijzonder de recente klinische toepassingen activeren neuronen door het creëren van een elektrisch veld extern. Het is daarom van belang om te onderzoeken hoe het neuron reageert op het externe veld en wat de oorzaak van de actiepotentiaal. Gelukkig, nauwkeurige en gecontroleerde toepassing van een extern elektrisch veld mogelijk embryonale neuronale cellen die zijn uitgesneden, gedissocieerd en gekweekt in kweken. Dit maakt het onderzoek van deze vragen in een zeer reproduceerbare systeem.

In dit artikel enkele technieken voor gecontroleerde toepassing van extern elektrisch veld op neuronale kweken worden beoordeeld. De netwerken kan zowel eendimensionale, dat wil zeggen een patroon in linear vormen of laat groeien over het gehele vlak van het substraat, en derhalve tweedimensionaal. Voorts kan de excitatie worden door de directe toepassing van elektrische velden via elektroden ondergedompeld in de vloeistof (bad elektroden) of door het induceren van het elektrische veld met de afstandsbediening ontstaan ​​van magnetische pulsen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De interactie tussen neuronen en externe elektrische velden heeft fundamentele implicaties en praktische degenen. Terwijl bekend sinds de tijden van Volta dat een extern aangeboden elektrisch veld weefsel te exciteren, zijn de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de productie van een resulterende actiepotentiaal in neuronen pas onlangs beginnen ontrafeld 1, 2, 3, 4. Dit omvat het beantwoorden van vragen met betrekking tot het mechanisme dat depolarisatie van de membraanpotentiaal, de rol van membraan eigenschappen en ionenkanalen, en zelfs het gebied veroorzaakt bij de neuron dat reageert op het elektrische veld 2, 5. Therapeutische neurostimulatie 6, 7, 8, 9,

Het meten van de interactie binnen de in vivo hersenen voegt hierbij een belangrijk onderdeel toe, maar wordt belemmerd door de onnauwkeurigheid en lage controleerbaarheid van metingen in de schedel. Daarentegen kunnen metingen in culturen eenvoudig worden uitgevoerd in hoog volume met hoge precisie, uitstekende signaal-ruisprestaties en een hoge mate van reproduceerbaarheid en controle. Met behulp van culturen kan een grote verscheidenheid aan neuronale eigenschappen van collectief netwerkgedrag worden toegelicht 11 , 12 , 13 , 14 , 15, 16. Evenzo is dit goed geregeld systeem verwacht zeer efficiënt bij het ophelderen van het mechanisme waarmee andere stimulatiemethoden werken, bijvoorbeeld hoe kanaalopening bij optische stimulatie optogenetically actieve neuronen 17, 18, 19 is verantwoordelijk voor het creëren actiepotentiaal.

Hier ligt de nadruk op het beschrijven van de ontwikkeling en het begrip van de instrumenten die efficiënt de neuron kan prikkelen via een extern elektrisch veld. In dit artikel beschrijven we de bereiding van tweedimensionale en eendimensionale patroon hippocampuskweken, stimulatie met verschillende configuraties en oriëntatie van een direkt elektrisch veld met bad elektroden, en ten slotte stimulering van tweedimensionale en gevormde eendimensionale kweken door een tijd variërend magnetisch veld, die een elektrisch veld induceert5 , 20 , 21 .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethiek Verklaring: Procedures met betrekking tot de behandeling van dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van het Weizmann Institute of Science en de juiste Israëlische wet. Het Weizmann Instituut is geaccrediteerd door de Vereniging voor evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care International (AAALAC). De Weizmann Institutional Animal Care en gebruik Comite deze studie, uitgevoerd met de hippocampus neuronen.

1. Bereiding van twee-dimensionale (2D) en eendimensionale (1D) hippocampuskweken

  1. Bereiding van dekglaasjes voor 2D culturen.
    1. Bereid plaatmedium (PM) samengesteld als volgt: 0,9 ml minimaal essentieel medium (MEM) + 3G, 0,05 ml foetaal kalfsserum (FCS), 0,05 ml door warmte geïnactiveerd paardenserum (HS HI) en 1 pl B27 supplement. Opmerking: MEM + 3G bevat per 500 ml MEM x 1, 1 ml gentamycine, 5 ml gestabiliseerde L-glutamine 100x (zie Tabel van Materialen / Reagentia) en 5 ml 60% D - (+) - glucose.
    2. Bereid boraatbuffer samengesteld uit: 1,9 g borax (natriumtetraboraatdekahydraat) in 200 ml dubbel gedestilleerd water (DDW) (meng bij 60 ° C) en 1,24 g boorzuur in 200 ml DDW. Titreer de uiteindelijke oplossing op pH 8,5 met 1 M HC1. Opmerking: De uiteindelijke oplossing is 400 ml 0,1 M boraatbuffer.
    3. Dompel de glazen dekglazen in 65% salpeterzuur gedurende 2 uur. Spoel drie keer in DDW, gevolgd door drie spoelen met absolute analytische reagens (ABS AR) ethanol.
    4. Pas elke deksel kort door de vlam van een Bunsen-brander twee of drie keer voor 1 - 2 s, en laat het dan gedurende 1 uur in 24-platen platen met 1 ml poly-L-lysine 0,01% oplossing verdund 1: 5 in boraatbuffer 0,1 M, pH 8,4). Spoel dan de deklagen in DDW drie keer en laat met 1 ml PM per putje in een standaard 37 ° C, 5% CO 2 incubator overnacht.
  2. Voorbereiding van coverlips voor 1D culturen.
    1. Reinig glass dekglaasjes door onderdompeling in een basis piranha-oplossing bestaande uit 75 ml DDW, 25 ml 25% ammonia-oplossing en 25 ml 30% waterstofperoxide. Plaats oplossing met dekglaasjes op een verwarmingsplaat bij -50 ° C gedurende 30 minuten en droog de dekglaasjes met stikstof.
    2. Coat dekglaasjes eerst met een dunne chroomfilm (99,999%) 6 een dikte gevolgd door 30 een laag goud (99,999%), met behulp van dampfase of sputteren.
      1. Een sputteren van 0,05 te bereiken - 1 A / s gebruiken verstuivingsmachine met 2 e-stralen en een vacuümsysteem van 260 l / s met doel maten 2" en 4" . Gebruik een rotatie fase die kan gaan 0-100 omwentelingen per minuut (RPM). Gebruik een gelijkstroom (DC) het door verstuiving kracht van 0-750 Watt.
      2. Met een rotatie van 30 rpm en argon 99,999% aan plasma krijgen op 10 mTorr druk in de kamer.
      3. Bedien de voeding van de sputterkanonnen 40 W DC sputteren vermogen voor de chroom leidt tot -0,12 A / S dekkingsgraad, en bij 10 W DC sputteren vermogen voor het goud, wat leidt tot ~ 0,28 A / S.
    3. Los 0,1 g 1-octadecaanthiol in 100 ml absolute ethanol AR met ultrageluid gedurende 30 min. Plaats Cr-Au beklede dekglaasjes gedurende 2 uur in deze oplossing, daarna wassen met ethanol ABS AR en droge met stikstof.
    4. Bereid een oplossing van 100 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS) en 3,5 g tri-blokcopolymeer (zie Tabel Materialen / Reagentia) door roeren gedurende 1-2 uur bij 600-700 rpm. Plaats dekglaasjes in de oplossing gedurende 1 uur. Droge dekglaasjes met stikstof.
    5. Mechanisch etsen het gewenste patroon door krabben de bio-afstoting laag 22. Doe dit met een pen plotter, wanneer de pen wordt vervangen door een ets naald. Krassen het patroon door de metalen lagen aan het onderliggende glas bereiken. Besturen dit proces door een computer een gerepliceerde gewenst patroon te bereiken. Patronen gevormd door deze werkwijze worden aangetoond D in figuur 2 en figuur 3 .
    6. Bereid een bio-compatibele laag van 100 ml D-PBS, 3,5 g tri-blok copolymer, 35,7 μL / ml fibronectine en 29 μl / ml laminine.
      1. Steriliseer dekglazen in ultraviolet licht gedurende minstens 10 minuten. Incubeer deksels in de voorbereide bio-compatibele oplossing gedurende de nacht.
        OPMERKING: De bio-compatibele laag zal alleen vormen waar de bio-afstotingslaag is geëtst in de vorige stap.
      2. De volgende dag wassen deklips twee keer met P-DBS. Incubeer dekjes in PM overnacht. Omslagen zijn nu klaar om te plakken.
  3. Voer dissectie uit volgens standaardprocedures die al voorheen 23 , 24 gepubliceerd zijn.
    1. In samenvatting, pak hippocampus of cortex uit rat embryo's, typisch op dag E19, of van muizen, typisch op dag E17 23 ,class = "xref"> 24.
    2. Dissociëren cellen eerst in papaïne oplossing gedurende 20-30 minuten, gevolgd door een mechanische trituratie met 24 glaspipetten met toppen vuur gepolijst.
      Opmerking: Als de cellen afkomstig zijn van genetisch gemodificeerde muizen dan het weefsel van elk embryo moet een afzonderlijke 1,5 ml plastic buis gedurende het gehele proces behouden.
    3. Tellen cellen met trypaanblauw voor het zaaien.
      LET OP: Voor genetisch gemodificeerde dieren de telling moet worden afzonderlijk voor elke embryo.
    4. Voor 2D culturen, zaad muisneuronen 750.000 en rattenneuronen bij 850.000 cellen per putje. Voor 1D, zaad bij 650.000 cellen per putje. Schud de plaat iets onmiddellijk na het zaaien om homogene dekking van het dekglaasje te verzekeren.
  4. Onderhoud van de neuronale culturen.
    1. Bereid veranderende medium (CM) uit (per ml). 0,9 ml MEM + 3G, 0,1 ml Hl HS, 10 pl 5-fluor-2'-deoxyuridine (FUDR) met uridine 100x
    2. Bereid eindmedium (FM) op, samengesteld uit (per ml): 0,9 ml MEM + 3G en 0,1 ml HI HS.
    3. Vervang PM met 1-1,5 ml CM na 4 dagen in vitro (DIV). Bij 6 DIV, vervang 50% van de CM met verse CM. Bij DIV 8, verander het medium tot 1,5 ml FM, gevolgd door een 50% verandering van FM elke 2 dagen. Na ongeveer een week ontstaat spontane synchrone activiteit.
  5. Imaging van spontane of opgeroepen activiteit in neuronale culturen met fluorescerende kleurstoffen.
    1. Bereid een oplossing van 50 μg calciumgevoelige fluorescerende kleurstof op (zie tabel van materialen / reagentia ) in 50 μl DMSO (dimethylsulfoxide).
    2. Bereid extracellulaire opnameoplossing (EM) die (in mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 139 NaCl, 10 D-glucose, 45 sucrose (pH 7,4) bevat.
    3. Incubate neuronale cultuur in 2 ml EM met 8 μL van de calciumgevoelige fluorescerende kleurstofoplossing gedurende 1 uur. Bescherm tegen licht en draai voorzichtig om homogeen te verzekerenous verspreiding van de kleurstof aan de cellen.
    4. Vervang met een fris EM voorafgaand aan de beeldvorming. De fluorescente beeldvorming wordt getoond in figuur 4.
    5. Beeld in een fluorescentiemicroscoop met optische filters voor calcium fluorescentie beeldvorming (excitatie piek bij 488 nm, emissiepiek bij 520 nm), met een camera en software waarmee kwantificeren van de intensiteit van elk gebied van belang (ROI) binnen het gezichtsveld van de microscoop.

2. Elektrische stimulatie of Cultures

OPMERKING: De basisinstellingen voor elektrische stimulatie is getoond in figuur 1. Een afdekstrook waarop de neuronale kweek werd gekweekt gedurende 14 dagen geplaatst in een petrischaal onder een fluorescentiemicroscoop. Elektrische activiteit van neuronen wordt afgebeeld met behulp van calcium kleurstoffen terwijl een spanning aangelegd via twee paren bad elektroden die buiten de kweek worden geplaatst. De elektroden worden aangestuurd door alsignal generator waarvan het uitgangssignaal versterkt wordt door een dubbelkanaals versterker. Spanningsregeling voor stimulatie de voorkeur boven de meer standaard stroomregeling 25, 26 omdat het elektrisch veld vectoren direct bepaald, waardoor eenvoudige vectoroptelling en combinatie. Dit vereist een zorgvuldige controle van de uniformiteit van het elektrisch veld, waarbij over het gehele monster kan worden uitgevoerd bij spanningsregeling. Bij gebruik stuurspanning zorg moet worden genomen om aardlussen voorkomen en de homogeniteit van het elektrisch veld moet worden gecontroleerd (zie 2.2).

  1. Voor elektrische stimulatie met een homogeen elektrisch veld gebruiken een paar evenwijdige elektrodedraden.
    1. Gebruik elektroden van platina met een dikte in de orde van 0,005 "(127 urn). In combinatie met de 13 mm dekglaasjes, opdat de afstand tussen de twee elektroden is ongeveer 11 mm en plaats de elektrodeS 1 mm boven de kweek.
      OPMERKING: Gebruik de polytetrafluorethyleen (PTFE) om de elektrodehouder ( Figuren 5A en 6A ) te maken. Boor smalle gaten door de PTFE om de elektroden te plaatsen. Het apparaat moet hoger zijn dan de extracellulaire oplossing, zodat het bovenste uiteinde, waar de elektroden worden blootgesteld, nooit in contact komen met de oplossing. Voor isolatie, gebruik epoxy lijm op elk deel van de elektrode leidingen die kunnen worden blootgesteld.
    2. Gebruik een vierkante pulsvorm met een 50% duty cycle, zonder DC component om elektrolyse te vermijden. Varieer de pulsduur tussen 10 μs en 4 ms om effectieve stimulatie te veroorzaken zonder de cultuur te verbranden. Zorg ervoor dat de amplitude in de orde is van ± 22 V (zie figuur 5 ). De vierkante pols kan worden waargenomen op een parallelle parallel aan de elektroden verbonden oscilloscoop.
      OPMERKING: Voor een gemakkelijke programmering van een gewenst golfvorm, gebruik een commerciële waveform editing software (zie Materialenlijst       ). Voer grafisch de gewenste golfvorm en het naar de golfvormgenerator.
  2. Om te testen op veldhomogeniteit gebruik van een sonde-elektrode. Gebruik een raster van ten minste 1 mm x 1 mm om de sonde in het gebied tussen de elektroden te verplaatsen en meten van elektrische potentiaal.
    1. Meet elektrische potentiaal. Gebruik figure-protocol-1 het elektrische veld te berekenen. Een van de elektroden een referentie-elektrode. Meet het elektrische veld met variërende pulsduur van 100 ps tot 4 ms (zie Figuur 5B een voorbeeld van 100 ps pulsduur) om te controleren of het veld homogeen binnen het traject van stimulerende duur.
      OPMERKING: Zie Figuur 5D een voorbeeld van een gemeten elektrische veld homogeniteit bij de pulsduur bedroeg 1 ms.
  3. Gebruik 2 loodrechte paren elektroden bad ingewikkeldere vormen elektrisch veld te produceren, enkunnen het veld in verschillende richtingen te oriënteren (zie fig. 6B). Inrichting met 2 paren elektroden worden gebruikt, en het signaal op elk paar elektroden wordt waargenomen op twee afzonderlijke oscilloscopen.
    1. Positioneer de elektroden 1 mm boven de cultuur en op een afstand van 10-11 mm van elkaar. Zorg ervoor dat beide elektrodeparen zweven (geen massaverbinding), en geen vast niet door het meten van de weerstand tussen een stel elektroden en verifiëren afwezigheid van kortsluiting tussen een van de elektroden. Controleren of alle gebruikte apparatuur, die verbonden is met de elektroden (zoals oscilloscopen, de versterkers, de signaalgeneratoren, etc.) zweeft ten opzichte van aarde door te controleren of alle apparatuur zweeft en dat geen van de referentie-elektroden raakt elke geaarde apparatuur.
    2. Om veldoriëntatie veranderen, veranderen de amplitude van de spanning toegevoerd aan de beide elektrodeparen met respect elkaar (zie figuur 7A). Bijvoorbeeld voor gebruik 0 ° ± 22 V op de elektrodepaar die loodrecht op het patroon en 0 V voor de andere elektrode. 45 ° Gebruik ± 15,6 V aan beide paren elektroden zonder faseverschuiving, een amplitude vectorsom van 15,6 2 15,6 2 2 = 22.
    3. Om op een roterend veld gebruiken één golfvorm van een sinusspanning puls en één enkele golfvorm van een cosinus spanningspuls aan beide paren elektroden een vaste amplitude roterende elektrische veld te produceren (zie figuur 6B).
      Opmerking: Zoals in figuur 6B, kan worden gezien bij gebruik van een cyclus van een sinusgolf met ± 22 V in een elektrode en een cyclus van een cosinusgolf met ± 22 V in de andere elektrode, de vectorsom een roterende elektrische veld met de cyclusduur gelijk aan de sinus en cosinus golven, en met een amplitude van ± 22 V.
  4. Voor het meten en berekenen KronAxie en rheobase van axonen in de neuronale cultuur vs dendrieten in dezelfde cultuur uitvoeren de volgende stappen.
    1. Gebruik een calciumgevoelige fluorescerende kleurstof voor calciumafbeelding zoals beschreven in de Tabel van Materialen / Reagentia en in 1.5) met een 1D-kweekpatroon op dunne (170 μm) lange (10 mm) lijnen. Calcium gevoelige kleurstof wordt toegepast op de cultuur en gedurende 45 minuten geïncubeerd. De kleurstof wordt gewassen door te vervangen door een nieuwe opnameoplossing.
    2. Ontkoppel het netwerk om populatiestatistieken van het directe antwoord op elektrische stimulatie te bereiken, zonder synaptische transmissie. Doe hiervoor een combinatie van 40 μM bicuculline, die de remmende werking van gamma-aminobutyrinezuur-A (GABA A ) receptoren blokkeert, 10 μM 6-cyaan-7-nitroquinoxaline-2,3-dion (CNQX) , Om de a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoolpropionische (AMPA) en kainaatreceptoren te blokkeren en 20 μM (2R) -amino-5-fosfonovaleric acid (APV), die blokkeert de N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptoren. De blokkers zal de opname-oplossing worden toegevoegd.
    3. Breng een rechthoekimpuls zoals beschreven in 2.1 en 2.3 met variërende tijdsduren tussen 100 us en 4 ms. Het signaal kan worden waargenomen op de oscilloscoop.
    4. Gebruik een fluorescentiemicroscoop met een beeldopname-programma (zie 1.5) aan de intensiteit van de calcium transiënten controleren op verschillende ROI, die elk een paar honderd neuronen. Het verwerven van beelden met behulp van een gevoelige EMCCD camera (zie Materials lijst), die in staat is een beeld verwerving van ten minste 20 frames per seconde. De verandering in lichtintensiteit evenredig met de hoeveelheid neuronen die werden gestimuleerd. Schat de fractie gestimuleerde neuronen met de relatieve verandering in intensiteit.
    5. Voor iedere pulsduur (100 us tot 4 ms), verandert de amplitude van de aan de elektroden vanaf een spanning waarbij geen verandering in intensiteit wordt waargenomen (enkele volt) spanning aan The spanning wanneer de veranderingen in intensiteit als gevolg van de aangelegde spanning is verzadigd (tot ± 22 V).
      OPMERKING: De intensiteit wijziging wordt verspreid als een cumulatief 5 Gauss ten opzichte van de aangelegde spanning voor stimulatie voor elke tijdsduur van de spanningspuls.
    6. Breng een cumulatieve Gauss-verdeling van de intensiteit versus de aangelegde spanning voor elke duur en extraheer de Gauss gemiddelde van deze fit.
      LET OP: Dit gemiddelde is de vertegenwoordiger van de spanning waarop de neuronen gereageerd.
    7. Aan het einde van dit proces ontvangt voor elke duur stimulatie een gemiddelde spanning waaraan de neuronen gereageerd. Gebruik deze paren duur en sterke punten van de Strength-Duration curves plotten (zie figuur 7).

3. Magnetische Stimulatie van Cultures

Opmerking: de basisinstellingen voor magnetische stimulatie is getoond in figuur 2. Op de top rechts wordt getoondeen omgekeerde fluorescentiemicroscoop die wordt gebruikt om het calcium gevoelige kleurstoffen in de neuronen. Magneetspoel (blauwe cirkels) zich ongeveer 5 mm concentrisch boven een neuronale kweek ring, (blauw overzicht). Een opneemspoel (rode cirkel) op de omtrek van de petrischaal bewaakt de spanning geïnduceerd door de magnetische puls. Linksboven weergegeven de gemeten dynamica van de magnetische stimulator (MS) spoel met een condensatorspanning belasting van 5000 kV, zoals opgenomen vanaf de opneemspoel. Het geïnduceerde elektrische veld (berekend voor een ring radius van 14 mm) wordt getoond in groen als de magneetveld wordt weergegeven in blauw. Op de bodem worden weergegeven beelden van de neuronale cultuur. Linksonder is een lichtveld beeld van een patroon voorziene 24 mm dekglaasje. De witte gebieden zijn de neuronen. De gefotografeerde patroon bestaat uit concentrische ringen kweken met verschillende stralen. Rechtsonder is een zoom op een kort segment van de ringen, met individuele neuronen. Een schaal wid de ringenste ongeveer 200 urn.

  1. Groeien de neuronen in een cirkelvormige ring patroon (geëtst zoals in 1.2.5) voor 1D kweek stimulatie. Gebruik een calcium gevoelige fluorescerende kleurstof voor calcium beeldvorming (zie hoofdstuk 1.5) met een 1D cultuur patroon op dunne (170 pm), lange (10 mm) lijnen.
    1. Gebruik een cirkelvormige magneetspoel en plaats een Petrischaal en onder concentrische ongeveer 5 mm met de spoel. Een aangepaste spoel van ongeveer 30 mm (binnendiameter 46 mm buitendiameter) spoel met een inductantie L = 90 mH aangedreven door een zelfgemaakte of commerciële MS geladen met een maximale spanning van 5 kV.
    2. Ontladen een hoge spanning en stroom door een geleidende spoel moet met een snel lopende hoogspanningsschakelaar magnetisch stimuleert neuronale culturen. De magnetische stimulator (MS) kan worden opgebouwd zoals beschreven in 21 gebruiken grote condensatoren, in de orde van 100 mF, een hoogspanning van 1 te verkrijgen - 5 kV. Als alternatief een in de handelbeschikbaar MS (zie Table of Materials / reagentia).
      OPMERKING: Gebruik een 0,254 mm dik en 6,35 mm breed polyestergecoat rechthoekige koperdraad met een zelfgemaakte spoel 21 te vervaardigen. Zet draden op maat gemaakte lijsten, geïsoleerd met glasvezels en gegoten in epoxy (zie tabel of Materials / reagentia). Alternatief commercieel verkrijgbaar spoelen (zie Tabel Materialen / Reagentia).
  2. Gebruik Draaiveld 2D culturen stimuleren.
  3. Gebruik nu de Draaiveld 2D culturen stimuleren. Vuur de TMS met geen enkele cultuur in de schaal, met verschillende intensiteiten, de lineaire correlatie van de spoel lezen met de intensiteiten tonen.
  4. Vervolgens, tijdens het opnemen calcium transiënten met een neuronale kweek, starten vuren TMS bij toenemende intensiteit tijdens het opnemen van zowel calcium transiënten en de spoel. In eerste instantie netwerk uitbarstingen waargenomen als grote calcium transiënten, should niet synchroniseren met pick-up spoel TMS spikes. Doorgaan met de intensiteit te verhogen, op een bepaald punt, het calcium transiënten beginnen te worden gesynchroniseerd met de TMS spikes. Alternatief, of daarnaast, na het bereiken van een gesynchroniseerde reactie beginnen te dalen de intensiteiten totdat synchronisatie wordt opgeheven, de TMS drempel te bepalen.
    Opmerking: de voorwaarden moeten worden gehandhaafd strikt vast voor elk van de instellingen, met behulp van de exacte volume elke keer, dezelfde schepen en identificatie spoel posities en oriëntaties.
    1. Monteer de opneemspoel op basis van de opname schotel, zodat het in een vlak evenwijdig aan de neuronale kweek en in een vaste positie ten opzichte van de kweek.
      Opmerking: Dit zorgt ervoor dat de afhankelijkheid van de positionering van de opneemspoel ten opzichte van de magneet trouw aan de positie van de kweek en dat verschillen in de positionering verwaarloosbare op de opneemspoel metingen zullen zijn.
      1. Met twee onafhankelijke wikkelingen dieloodrecht op elkaar (figuur 8B) een roterend magnetisch en geïnduceerde elektrische veld te genereren. Sluit elke spoel zijn eigen MS. Waarborgen dat de stimulatoren ontladen gelijke stromen aan een fasevertraging van 90 graden (figuur 10A), wat resulteert in een roterend magnetisch veld die 270 graden van de werkelijke ruimte scant maximaal gebied van ~ 270 V / m (Figuur 10B).
      2. Positioneer de neuronale kweek in een bolvormige glazen bak met de externe opnameoplossing (EM).
      3. Monitoren stimulatie (verandering in fluorescentie-intensiteit van de neuronen) met de camera zoals beschreven in stap 2.4.4.
      4. Bij het kruis spoelen (figuur 8B), plaatst de opneemspoel evenwijdig en op een bepaalde afstand onder het neuronale kweek. onderhouden van deze configuratie gedurende de experimenten voorzichtig.
  5. Bereken analytisch het elektrische veld voor 1D configuratiesTIE Emax = k1 Br, waarbij Emax de maximale amplitude van de geïnduceerde elektrische veld en wordt langs de raaklijn van de ringen met radius r. B is de amplitude van de magnetische puls en k 1 is een dimensionaal evenredigheidsconstante die kunnen worden gemeten met de opneemspoel (Figuur 8A).
  6. Gebruik een numerieke simulatie pakket (zie Material lijst) numeriek simuleren van het elektrische veld 21.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gepresenteerde protocol maakt een eenvoudige patroonvorming van neuronale kweken. Wanneer het wordt gecombineerd met een aantal methoden die we ontwikkeld stimulatie, het stelt de metingen van enige intrinsieke neuron eigenschappen zoals Chronaxie en Rheobase 5 maken de eigenschappen van gezonde en zieke neuronen 27 vergelijken optimale manieren om kweken te stimuleren afhankelijk van voorbeeld hun structuur en vele andere nieuwe ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1D patroon is een belangrijk instrument dat kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan toepassingen. Zo hebben we 1D patroonvorming gebruikt voor het maken logische poorten van neuronale kweken 29 en recenter in Chronaxie en Rheobase rat hippocampale neuronen 5 gemeten en de vertraging van het signaal voortplantingssnelheid schietbanen activiteit Downsyndroom hippocampale neuronen vergeleken met de wildtype (WT) hippocampale neuronen 27. De vo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Ofer Feinerman, Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef en Eitan Reuveny voor zeer goede discussies. De auteurs bedanken Ilan Breskin en Jordi Soriano voor het ontwikkelen van vroege versies van de technologie. De auteurs bedanken Tsvi Tlusty en Jean-Pierre Eckmann voor hulp met de theoretische concepten. Dit onderzoek werd ondersteund door de Stichting Minerva, het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Israël, en door de Israëlische Wetenschapsstichting 1320/09 en de Bi-National Science Foundation Grant 2008331.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
APVSigma-AldrichA8054Onderbreek het netwerk. Genoemd in Sectie 2.4.2
B27 suppGibco17504-044Plating medium. Genoemd in Sectie 1.1.1
bicucullineSigma-Aldrich14343Onderbreek het netwerk. Genoemd in Sectie 2.4.2
Borax (natriumtetraboraat decahydraat)Sigma-AldrichS9640Borate buffer. Genoemd in Sectie 1.1.2
BoorzuurFrutarom LTD5550710Borate buffer. Genoemd in Sectie 1.1.2
CaCl2, 1 MFluka 21098Extracellulaire opnameoplossing. Genoemd in Sectie 1.5.2
CNQXSigma-AldrichC239Onderbreek het netwerk. Genoemd in Sectie 2.4.2
COMSOLCOMSOL IncMultiphysics 3.5Numerieke simulatie. Genoemd in Sectie 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1 MSigma-Aldrich65146Plating medium, Extracellulaire opnameoplossing. Genoemd in Secties 1.1.1 en 1.5.2
D-PBSSigma-AldrichD8537Celcultures. Genoemd in Secties 1.2.4 en 1.2.6
FCS (FBS)Gibco12657-029Plating medium. Genoemd in Sectie 1.1.1
FibronectineSigma-AldrichF1141Bio Coating. Genoemd in Sectie 1.2.6
Fluo4AMLife technologiesF14201Beeldvorming van spontane of opgewekte activiteit. Genoemd in Secties 1.5.1, 1.5.3 en 1.5.5
FUDRSigma-AldrichF0503Medium veranderen. Genoemd in Sectie 1.4.1
GentamycineSigma-AldrichG1272Plating medium, Medium veranderen, Eindmedium. Genoemd in Sectie 1.1.1
GlutaMAX 100xGibco35050-038Plating medium, Medium veranderen, Eindmedium. Genoemd in Sectie 1.1.1
Hepes, 1 MSigma-AldrichH0887Extracellulaire opnameoplossing. Genoemd in Sectie 1.5.2
HI HSBI04-124-1APlating medium, Medium veranderen, Eindmedium. Genoemd in Secties 1.1.1, 1.4.1 en 1.4.2
KCl,  3 MMerck1049361000Extracellulaire opnameoplossing. Genoemd in Sectie 1.5.2
Laminine Sigma-AldrichL2020Bio Coating. Genoemd in Sectie 1.2.6
MEM x 1Gibco21090-022Plating medium, Medium veranderen, Eindmedium. Genoemd in Sectie 1.4.1    1.4.2
MgCl2, 1 MSigma-AldrichM1028Extracellulaire opnameoplossing. Genoemd in Sectie 1.5.2
NaCl, 4 MBio-Lab19030591Extracellulaire opnameoplossing. Genoemd in Sectie 1.5.2
OctadecaanthioolSigma-Aldrich01858Reiniging Cr-Au gecoate deksels (1D culturen). Genoemd in Sectie 1.2.3
Pluracare F108 NF PrillBASF Corparation 50475278Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Genoemd in Secties 1.2.4 en 1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% oplossing Sigma-Aldrich P47075Celdeling bevorderen. Genoemd in Sectie 1.1.4
Sucrose, 1 MSigma-AldrichS1888Extracellulaire opnameoplossing. Genoemd in Sectie 1.5.2
Thiol Sigma-Aldrich1858Bio-Rejection Coating. Genoemd in Sectie 1.2.3
URIDINESigma-AldrichU3750Medium veranderen. Genoemd in Sectie 1.4.1
Sputtering machineAJA International, IncATC Orion-5Series Bekleden van glas met dunne metaallaagjes. Genoemd in Sectie 1.2.2
Pen plotter Hewlett Packard HP 7475AEtsen van patroon op het gecoate deksel. Genoemd in Sectie 1.2.5
Elektrodedraad A-M Systems, Carlsborg WA767000Elektrische stimulatie van neuronale culturen. Genoemd in Secties 2.1, 2.2, 2.3 en 2.4.5
SignaalversterkerBKPrecision4079Vormgeving van het elektrische signaal. Genoemd in Sectie 2.3
VersterkerZelfgemaaktSpanningsversterking van het signaal van de signaalversterker naar de elektroden. Genoemd in Sectie 2.3
VoedingMatrix MPS-3005 LK-3 Voeding voor de sputtering machine. Genoemd in Sectie 1.2.2.3
Transcraniële magnetische stimulatieMagstim, Spring Gardens, UKRapid 2Magnetische stimulatie van neuronale cultuur. Genoemd in Secties 3.1, 3.3 en 3.4
EpoxyCognisVersamid 140Gieten van zelfgemaakte spoelen. Genoemd in Sectie 3.4
EpoxyShellEPON 815 Gieten van zelfgemaakte spoelen. Genoemd in Sectie 3.4
Platinum draden 0.005'' dik; A-M Systems,  Carlsborg WA 767000Elektrische stimulatie van neuronale culturen. Genoemd in Sectie 2.1
Circulaire magnetische spoelZelfgemaaktMagnetische stimulatie van neuronale cultuur. Genoemd

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (11), 1175-1188 (1993).
  2. Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118 (4), 489-500 (1998).
  3. Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98 (3), 417-440 (1975).
  4. Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89 (2), 335-346 (1999).
  5. Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10 (7), e0132577(2015).
  6. Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169 (7), 719-724 (2012).
  7. Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14 (9), 952-970 (2007).
  8. Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, Suppl 1. S44-S53 (2009).
  9. Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16 (1), 35-42 (2012).
  10. Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19 (1), 10-16 (2003).
  11. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4 (8), 1954-1965 (1984).
  12. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4 (8), 1944-1953 (1984).
  13. Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23 (35), 11167-11177 (2003).
  14. Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97 (18), (2006).
  15. Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26 (17), 4526-4534 (2006).
  16. Soriano, J., Rodriguez Martinez,, Tlusty, M., T,, Moses, E. Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (37), 13758-13763 (2008).
  17. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  18. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  19. Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16287(2013).
  20. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (3), 414-420 (2006).
  21. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94 (12), 5065-5078 (2008).
  22. Feinerman, O., Moses, E. A picoliter 'fountain-pen' using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127 (1), 75-84 (2003).
  23. Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94 (5), 3406-3416 (2005).
  24. Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 1-11 (1995).
  25. Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557 (1), 175-190 (2004).
  26. Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591 (10), 2563-2578 (2013).
  27. Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2 (9), 1048-1062 (2015).
  28. Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9 (2), e86794(2014).
  29. Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4 (12), 967-973 (2008).
  30. Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
  31. Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30 (15), 4441-4449 (2014).
  32. Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8 (5), 671-675 (2012).
  33. Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
  34. Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10 (4), e0120680(2015).
  35. Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37 (6), 588-597 (1990).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Neuronale culturenelektrische stimulatiemagnetische stimulatieeendimensionale culturengepatroneerde neuronale netwerkenextern elektrisch veldelektrodeconfiguratiegeneratie van magnetische pulsensterkte duurcurve

Gerelateerde artikelen