Het doel van dit protocol is om het protocol te laten zien voor het herprogrammeren van in melanoom geïnfiltreerde tumorlymfocyten in geïnduceerde pluripotente stamcellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke Melanoom-Tumor-infiltrerende lymfocyten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Adoptieve overdracht van ex vivo geëxpandeerde autologe tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's) kunnen duurzaam en volledige reacties bij belangrijke subgroepen van patiënten met metastatische melanoom bemiddelen. Grootste obstakels van deze aanpak zijn de verminderde levensvatbaarheid van de overgedragen T-cellen, veroorzaakt door telomeerverkorting, en het beperkte aantal van TIL's verkregen van patiënten. Minder gedifferentieerde T-cellen met lange telomeren zou een ideale T cel subsets voor adoptieve T-celtherapie, maar genereren van grote aantallen van deze minder gedifferentieerde T-cellen is problematisch. Deze beperking van adoptieve T cel therapie kan in theorie worden overwonnen door het gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), die zichzelf vernieuwen, te behouden pluripotentie, hebben langwerpige telomeren, en zorgen voor een onbeperkte bron van autologe T-cellen voor immunotherapie. Hier presenteren we een protocol om iPSCs behulp van Sendai-virus vectoren voor de transductie van herprogrammering factoren in TIL te genereren. Dit protocol genererens volledig geherprogrammeerd, vector-vrije klonen. Deze TIL-afgeleide iPSCs zou kunnen minder gedifferentieerde patiënt- en tumor-specifieke T-cellen voor adoptieve T-celtherapie te genereren.
Inleiding
Cellulaire herprogrammering technologie die generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) maakt het mogelijk via overexpressie van een gedefinieerde set van transcriptiefactoren houdt grote belofte in het gebied van cel-gebaseerde therapieën 1,2. Deze iPSCs vertonen transcriptie en epigenetische kenmerken en hebben de capaciteit voor zelf-vernieuwing en pluripotentie, net als embryonale stamcellen (SER) 3-5. Opmerkelijke vooruitgang geboekt bij het herprogrammeren technologie de afgelopen tien jaar heeft ons toegelaten om de menselijke iPSCs zelfs van terminaal gedifferentieerde cellen, zoals T-cellen 6-8 te genereren. T-....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
LET OP: Patiënten moeten geïnformeerde toestemming om deel te nemen in de Institutional Review Board en menselijke pluripotente stamcellen zijn goedgekeurd studie geven.
1. Isolatie en cultuur van de TIL
- Verkrijgen tumor materiaal dat niet nodig is voor histopathologische diagnose van de pathologie dienst / weefselverkrijging kern. Plaats 20-100 g tumor specimens in een 50 ml buis met 30 ml tumor verzamelen media (tabel 1).
- Ontleden solide, stevig, normaal weefsel van de tumor specimen van fragiel en / of bloederig necrotische gebieden met een schaar. Na het verwijderen van het necrotische weefsel Geb....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 toont een overzicht van de procedure dat de aanvankelijke groei van melanoom TIL met rhIL-2, gevolgd door activatie met anti-CD3 / CD28 en gentransfer van Oct3 / 4, KLF4, SOX2, en c-MYC om TIL impliceert voor het genereren van iPSCs. Meestal TIL op de cultuur met rhIL-2 start om bolletjes te vormen 21-28 dagen na het begin van de cultuur. Op dit moment TIL gereed zijn geactiveerd met anti-CD3 / CD28. Figuur 2A toont TIL op kweek met rhIL-2 op da.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier hebben we aangetoond een protocol voor het herprogrammeren van melanoom TIL te iPSCs door SeV gemedieerde transductie van de vier transcriptiefactoren Oct3 / 4, SOX2, KLF4, en c-MYC. Deze benadering, met een SeV systeem om T-cellen te herprogrammeren, biedt het voordeel van een niet-integratiemethode 7.
Een eerdere studie toonde aan dat SeV herprogrammering systeem is zeer efficiënt en betrouwbaar niet alleen fibroblasten maar ook perifeer bloed T-cellen 7,17 herpr.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
We bedanken mevrouw Deborah Postiff en mevrouw Jackline Barikdar in de Tissue Procurement Core en Dr. Cindy DeLong in het Pluripotent Stem Cell Core Laboratory aan de Universiteit van Michigan voor haar technische assistentie. Dit onderzoek werd ondersteund door opstartfinanciering van de Universiteit van Michigan en subsidies van de Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance en NIH/NCI (1K08CA197966-01) aan F. Ito.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
| L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
| recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
| Sendai virus vector | DNAVEC | ||
| SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomycin C | SIGMA | M4287 | oplosbaar in water (0,5 mg/ml) |
| gelatin | SIGMA | G1890 | |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 |
Referenties
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibrobl....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
