Meten van Lactase enzymatische activiteit in het onderwijs Lab

Samenvatting

De enzymatische activiteit van lactase is essentieel voor de katabole verwerking van het disaccharide lactose. Hier is de activiteit van lactase gevonden in voedingssupplementen vehiculumcontrolegroep met behulp van een colorimetrische bepaling. Dit biedt studenten met een experimenteel platform voor het begrijpen van de activiteit van de lactase en enzym kinetiek.

Samenvatting

Begrijpen hoe enzymen werken, en dit in verband met voorbeelden uit het echte leven, is essentieel voor een groot aantal undergraduate graden in de biologische en Biomedische Wetenschappen. Dit makkelijk te volgen protocol werd ontwikkeld voor eerste jaar undergraduate apotheek studenten en een entry-level Inleiding tot enzym reacties en analytische procedures voorziet-enzym-analyse. Het enzym van keuze is lactase, aangezien dit een voorbeeld van een commercieel beschikbare enzyme relevant zijn voor de menselijke ziekte/farmaceutische praktijk vertegenwoordigt. Lactase wordt gewonnen uit voedingssupplement tabletten, en geschat aan de hand van een colorimetrische bepaling op basis van de hydrolyse van een kunstmatig substraat voor lactase (ortho-nitrofenol - -Dbeta-galactopyranoside, ONPG). Release van ortho-nitrofenol na de Hydrolytische splitsing van ONPG door lactase wordt gemeten door een verandering in de absorptie bij 420 nm, en het effect van de temperatuur op de enzymatische reactie wordt geëvalueerd door het uitvoeren van de reactie op het ijs, bij kamertemperatuur en 37 ° C. Meer geavanceerde analyse kan worden geïmplementeerd met behulp van dit protocol door beoordeling van de enzymactiviteit onder verschillende omstandigheden en met behulp van verschillende reagentia.

Inleiding

Enzymen zijn een speciale soort eiwit die fungeren als biologische katalysatoren voor chemische reacties in levende organismen¹. De werking van enzymen is essentieel voor leven, verstrekken van energie, afval en waardoor organismen functioneren. Begrip enzymen is dus cruciaal voor een volledig begrip van het leven. Dergelijke kennis is essentieel voor een breed scala van Universiteit niveau graadprogramma's, variërend van de medische wetenschappen biologie. Terwijl een gedetailleerde achtergrond variërend van principes van catalyse tot theoretische modellen van enzymactiviteit kan worden verstrekt aan studenten met behulp van lezingen en het lezen van materiaal, zijn de eigenschappen van enzym reacties best begrepen door de handen op de praktische ervaring van zoals eerder aangetoond enzymen in actie². Dit protocol biedt een eenvoudig te volgen van experimentele paradigma voor het meten van de enzymactiviteit onder laboratoriumomstandigheden, lactase gebruikt als een voorbeeld van een enzym met een activiteit die relevant zijn voor de menselijke voeding en gezondheid.

De glycosidic hydrolase lactase (EG 3.2.1.23/26) is een enzym voeding centraal voor zoogdieren³. De activiteit van lactase is zeer behouden door middel van evolutie, en vloeit voort uit de beta-galactosidase-familie van enzymen — een familie aanwezig van Escherichia coli via tot Homo sapiens (Figuur 1, VOB 1JZ8)⁴. Het cruciale belang van lactase in een menselijke voeding instelling komt voort uit haar rol bij het toestaan van de afbraak van lactose in zijn samenstellende monosaccharide-componenten, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor het genereren van energie in het lichaam. Lactase katalyseert de hydrolyse van de glycosidic binding in het disaccharide lactose, vrijgeven galactose en glucose (Figuur 2)⁵. Deze monosachariden zijn dan voornamelijk gebruikt voor de generatie van adenosine trifosfaat (ATP) via de citroenzuurcyclus en oxidatieve fosforylatie⁶. Tijdens de pasgeborene en zuigeling ontwikkeling, wordt lactase sterk uitgedrukt in het menselijke spijsverteringsstelsel, afbreken van lactose moedermelk die van welke lactose de primaire koolhydraten component, en een van de belangrijkste bronnen van voeding tijdens de eerste jaren ^{is ontvangen 7}. het medisch belang van lactase door aangeboren lactase deficiëntie (CLD), een zeldzame autosomale recessieve aandoening veroorzaakt door mutaties in het lactase-gen (LCT) codeert voor het enzym lactase⁸wordt benadrukt. Pasgeboren baby's met CLD vertonen weinig lactase-activiteit, waardoor ze niet geschikt voor vervoedering aan moedermelk, een ander type van melk of formule met lactose.

Tijdens de kindertijd, wordt lactase expressie normaal verminderd; Deze vermindering na spenen varieert echter geografisch, met ongeveer 35% van de volwassenen wereldwijd blijven de enzym⁹express. Aanhoudende uitdrukking van lactase, bekend als lactase persistentie, kan personen blijven om te verteren melk en zuivel producten uit allerlei bronnen. Omgekeerd, het verlies van lactase expressie kan leiden tot lactose-intolerantie, ook bekend als volwassene-type hypolactasia (ATH), als gevolg van een onvermogen om te breken lactose in de darm. ATH wordt gekenmerkt door een build up van lactose in de dikke darm na inname van lactose bevattende voedingsmiddelen. In de dikke darm, is de geaccumuleerde lactose gefermenteerd door gut microbiële flora, het vrijgeven van gassen met inbegrip van waterstof, methaan en koolstofdioxide. De productie van deze gassen bij personen met lactase enzym tekortkomingen bevorderen buik opgeblazen gevoel, verhoogde winderigheid, pijn, misselijkheid en borborygmi (gerommel van de maag)⁷. Verhoogde niveaus van lactose in het spijsverteringskanaal kunnen ook leiden tot dunne ontlasting.

De controle op de genexpressie LCT gemoduleerd door polymorfismen gelegen in introns van het nabijgelegen MCM6 gen. Individuen met aanhoudende uitdrukking van lactase voeren polymorfismen die als sterke distale versterkers voor LCT genexpressie, dus de normale neer regulering van LCT transcriptie functioneren tijdens het spenen, compensatie en bijgevolg onderhoudende lactase expressie in volwassenheid³. Versterker polymorfismen hebben gesuggereerd te zijn positief geselecteerd na de domesticatie van vee en kamelen in het Midden-Oosten meer dan vijfduizend jaar geleden^9,10.

De symptomen die als gevolg van ATH kunnen worden beheerd door het verminderen van lactose inname, bijvoorbeeld door het verwijderen van zuivelproducten uit de voeding. Een alternatieve benadering voor ATH, en de benadering van keuze voor CLD, is het gebruik van lactase supplementen, verkrijgbaar in de apotheek. Deze supplementen bieden lactase geïsoleerd uit een verscheidenheid van bronnen, met inbegrip van gisten en bacteriën, in een vloeibare of pil gebaseerde vorm die kan worden genomen met of toegevoegd aan lactose levensmiddel bevatten. Het supplement zal een deel van de lactose in het levensmiddel aanwezig op glucose en galactose producten, aldus toelaat hun absorptie en voorkoming van accumulatie van onverteerde lactose substraat in de darm hydrolyseren.

Gebaseerd op het gebruik van lactase supplementen als een dieet steun, hebben we een eenvoudige enzymologie laboratorium experiment geschikt voor eerste jaar Biomedische Wetenschappen of apotheek studenten. Dit laboratorium experiment profiteert van verkrijgbare lactase supplementen, en gebruikt ortho-nitrofenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) om een colorimetrische eindpunt voor het meten van de splitsing van glycosidebindingen door lactase ( Figuur 3)¹¹. ONPG fungeert een kunstmatig substraat voor lactase, die wanneer onderworpen aan hydrolyse door dit enzym produceert D-galactose en ortho-nitrofenol. Het laatste product heeft een gele kleur, het absorberen van licht met een golflengte van 420 nm. Door het kwantificeren van de wijzigingen in de absorptie bij 420 nm na de blootstelling van ONPG aan lactase, het is mogelijk om de schatten van de activiteit van dit enzym. Dit laboratorium experiment geeft een demonstratie van enzymatische hydrolase activiteit. Door te bouwen in extra wordt gerepliceerd en uitvoeren van tests in verschillende omstandigheden, is het mogelijk om meer geavanceerde analyses van Enzymkinetiek, een waardevolle levensechte voorbeeld van enzymen in actie die relevant zijn voor de gezondheid van de mens.

Protocol

Opmerking: Het onderstaande protocol werd ontwikkeld om te worden gehouden in de loop van twee uur (inclusief de voltooiing van de in-klassiaale werkbladen) in een speciaal gebouwde onderwijs-laboratorium. De experimentele stappen werden bewust zetten samen uit te sluiten van meer gedetailleerde analyse van de enzymkinetiek (uitgevoerd in het kader van deze cursus met behulp van modelgegevens;) echter, zoals opgemerkt in de discussie — voorziet het protocol een sjabloon meer geavanceerde analyses afhankelijk van tijd, voorzieningen en student onderwijsniveau.

VEILIGHEID: De deze praktische moet worden uitgevoerd volgens de regels van goede chemische laboratorium praktijk (GCLP) — persoonlijke beschermingsmiddelen, met inbegrip van eigendom laboratorium jas, wegwerp handschoenen en veiligheidsbril moet gedragen worden in alle tijden in het laboratorium .

1. het extraheren van het enzym

1. Crush een lactase-tablet, met 200 mg van enzym, tot een zelfs poeder met behulp van een mortier en een stamper.
2. Plaats het resulterende poeder in een tube van 15 mL "opschorting" geëtiketteerd en resuspendeer in 10 mL 100 mM fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
3. Vortex voor 1 min om te maximaliseren extractie van het enzym.
4. Breng 1 mL van de schorsing in een centrifugebuis 1,5 mL en centrifuge voor 1 min bij 10.000 x g sediment vaste deeltjes.
5. Breng 500 µL van het supernatans dat tot een schone 1,5 mL koker geëtiketteerd "Lactase uittreksel".

2. het observeren van de colorimetrische reactie

1. Plaats 390 µL van 100 mM PBS in een buis 1,5 mL geëtiketteerd "Reactie A".
2. Voeg 100 µL 5 mM ONPG oplossing en meng goed door vortexing.
   Let op: Deze praktische gebruikt ortho-nitrofenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) als een substituut voor lactose. Aangezien ONPG een fenolische verbinding is, moet het met de nodige voorzichtigheid worden behandeld. In geval van contact met de huid met ONPG, moet de blootgestelde huid onmiddellijk worden gewassen. Lekkages moeten worden geveegd omhoog onmiddellijk met papieren handdoeken te wikkelen in de passende afvalstroom terecht.
3. Voeg 10 µL van extract in de reactiebuis A en meng goed door vortexing.
4. Het reactiemengsel observeren gedurende 5 minuten en noteer elke colorimetrische wijziging aan de oplossing.

3. meting van de enzymactiviteit

1. Twee 1,5 mL buizen ingesteld: een etiket "Reactie B", een gelabelde "Control".
2. 390 µL van 100 mM PBS toevoegen aan de reactie B buis, 400 µL van 100 mM PBS aan de controle-buis en voeg vervolgens aan elke buis toe 100 µL van 5 mM ONPG.
3. Meng de inhoud door vortexing.
4. 10 µL van lactase extract toevoegen aan de reactiebuis B, Meng door vortexing en laat de reactie om door te gaan voor 1 minuut bij kamertemperatuur.
5. Zodra 1 minuut is verstreken, voeg 500 µL van 1 M natriumcarbonaat beide buizen voor de remming van het enzym lactase door het verhogen van de pH, waardoor tot beëindiging van de reactie.
6. 500 µL van elke buis overboeken naar schone spectrofotometer cuvettes en meten van de absorptie bij 420 nm met behulp van de spectrofotometer valt.
7. Opmerking absorptie voor reactie B en controlemonsters, en dan aftrekken van de waarde van het besturingselement van de reactie-waarde voor het afleiden van de verandering in de absorptie door de hydrolyse van ONPG in de aanwezigheid van actieve enzym.

4. effect van temperatuur op enzymactiviteit

1. Drie controle buizen en drie reactie buizen instellen zoals beschreven in sectie 3 en label deze "4 ° C", "Room Temp" en "37 ° C".
2. Na toevoeging van het enzym extract, incubeer één buis op ijs, één bij kamertemperatuur, en één bij 37 ° C (in een voorverwarmd waterbad).
3. Laat de reacties wilt doorgaan voor 1 min en vervolgens het beëindigen van de reactie door 500 µL van 1 M natriumcarbonaat aan elke buis toe te voegen.
4. Meet de extinctie op 420 nm voor elke buis zoals beschreven in sectie 3. Noteer de waarden, af te trekken van de waarde van de reactie in elk geval de waarde van het besturingselement.

Resultaten

Representatieve resultaten voor deel 2 van het protocol worden weergegeven in figuur 4A. De reactie van de controle, bij gebrek aan lactase enzym, blijft het duidelijk, terwijl de reactie-oplossing, uittreksel uit de lactase-tablet, met kleur omslaat naar geel als ONPG is gehydrolyseerd vrijgeven ortho- nitrofenol. Figuur 4B toont kwantificering met behulp van willekeurige eenheden van sectie 4 van het protocol, de volgende analyse van monsters met behulp van de spectrofotometer valt. Productie van ortho-nitrofenol is laagste wanneer de reactie is geïncubeerd op ijs, en de hoogste wanneer de reactie wordt uitgevoerd bij 37 ° C.

Figuur 1 : E. coli beta-galactosidase. (A) kristalstructuur van beta-galactosidase van Escherichia coli, waaruit blijkt dat het tetramere structuur van het actieve complex. (B) Allolactose (rood weergegeven) gekoppeld aan de actieve site van beta-galactosidase. Afbeeldingen gegenereerd op basis van VOB 1JZ8⁴. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Enzymatische actie van lactase. Hydrolyse van lactose door lactase beta-D-galactose en beta-D-glucose te produceren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Hydrolyse van ortho-nitrofenol - bèta -D-galactopyranoside. ONPG hydrolyse door lactase productie van beta-D-galactose en ortho-nitrofenol (dat is gele in kleur), waardoor de schatting van lactase-activiteit door meting van de absorptie bij 420 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figuur 4 : ONPG hydrolyse. Representatieve resultaten van hydrolyse van de ONPG, met controle en reactie buizen (A) en representatieve gegevens van punt 4 van het protocol opgenomen op in zijn klasse werkbladen, ruwe extinctie in willekeurige eenheden op 420 tonen nm, gecorrigeerd voor de achtergrond en bij drie verschillende temperaturen (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Experimentele conditie	Experimentele variabelen
Temperatuur	0 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 50 ° C
Substraat concentratie	0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG
Competitieve remming	5 mM ONPG plus 0 mM, 1 mM, 5 mM of 10 mM lactose
Tijdafhankelijkheid	0 s, 15 s 30 s, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min
Warmte denaturatie	Lactase extract verwarmd tot 100 ° C gedurende 10 minuten voorafgaand aan de assay

Tabel 1: potentieel uitgebreid experimentele conditie. Voorgesteld uitgebreide experimenten, in drievoud, onderzoek naar specifieke aspecten van lactase biologie uit te voeren.

Discussie

Een gedetailleerde kennis en begrip van enzymen, enzymatische reacties en Enzymkinetiek is vereist voor een breed scala aan onderwerpen, variërend van biologie, biologie en farmacologie. Lactase in het protocol beschreven gebruikt als een voorbeeld van een enzym die relevant zijn voor de gezondheid van de mens voor het aantonen van enzymatische reacties, het verstrekken van essentiële vaardigheden die kunnen worden gebruikt in meer geavanceerde laboratorium gebaseerde experimenten.

Dit protocol is bewust ontworpen om worden zo robuust als mogelijk, waardoor studenten met weinig of geen natte laboratorium ervaring interpreteerbaar resultaten in een korte tijd. Een totaal van 144 studenten, onderverdeeld in groepen van 3, uitgevoerd in het schooljaar 2014/2015 aan de Universiteit van Reading School of Pharmacy het experiment "meten lactase", met alle fracties kundig voor speurder zekere mate van enzymatische activiteit van lactase tablet extracten.

Er zijn een aantal essentiële stappen in dit protocol. Eerste, is het essentieel dat de oorspronkelijke extractie efficiënt is, zodat solubilisatie van genoeg actieve enzym voor latere analyses. In onze ervaring, eerstejaars studenten kunnen dit bereiken door het protocol te volgen zoals uiteengezet; echter sommige begeleiding van laboratorium demonstranten nodig was op dit punt. Hoewel het lijkt een vanzelfsprekend punt, is een belangrijke factor in het succes van dit protocol de mogelijkheid om het zorgvuldig meten van volumes, correct label buizen en volg instructies. Terwijl een zekere mate van vaardigheid worden aangenomen voor veel studenten dat kan, nauwlettend te worden gevolgd en een duidelijk verzoek voor studenten om te vragen om hulp, in het geval dat zij twijfelt over biedt wat te doen volgende de grootste kans op een succesvolle test.

Student evaluatie kan worden uitgevoerd door het in-klasse werkblad (beschikbaar als aanvullend materiaal), vraagt studenten om op te merken van de gegevens van de experimenten, commentaar op hun resultaten en de link naar achtergrond informatie/van de lezing van Hoorcollege materiaal, of door meer gedetailleerde, uit de beoordeling van de klasse met verstrekte modelgegevens toestaan voor kinetische analyses te proberen en te evalueren.

Het protocol gepresenteerd hierin is een eenvoudig voorbeeld van een lactase-activiteit assay onder laboratoriumomstandigheden onderwijzen, en er is voldoende gelegenheid om het verhogen van de complexiteit van het experiment om geavanceerdere analyses. Met name het voorgestelde protocol geeft een inleiding op het concept van de enzymkinetiek maar niet mogelijk voor kinetische analyse van experimentele gegevens. Zo zouden wij adviseren het beschreven protocol bekijken als een eerste sjabloon voor klassen, met de precieze details aangepast aan de specifieke doelstellingen ervan en de talenten van de student cohort onderneming van de experimenten. Voorbeelden van uitgebreide experimenten: herhaalde metingen op verschillende temperaturen, met behulp van verschillende substraat concentraties dat statistische analyse, analyse van de kinetische gegevens (geschikt voor Biochemie studenten/majors), beginnend met verscheidene verschillende tabletten en waardoor de studenten om te evalueren van de verschillende activiteiten van enzym in elk (met de toevoeging van controle tabletten, geschikt voor forensische wetenschap studenten/majors), beoordeling van het effect van warmte denaturatie of uitvoeren van competitie experimenten door toevoeging van lactose of remmers van lactase (tabel 1). Een gedetailleerd protocol voor kinetische analyse van lactase geweest eerder gepubliceerde¹².

Een belangrijke kracht van dit protocol is dat het een basiscursus volgen betreffende enzymologie en enzym kinetiek met een real-life case study van enzymologie in de geneeskunde combineert. Dit maakt dit laboratorium experiment van bijzonder belang zijn voor studenten geneeskunde, farmacie, Biomedische Wetenschappen en aanverwante onderwerpen. Nog belangrijker is, biedt het feit dat er een ernstige medische aandoening én een uitgebreider dieet probleem gekoppeld aan lactose katabolisme de mogelijkheid om een breed scala van medische en ethische kwesties met de studenten. Dit kan onder meer de kwesties rond genetische testen voor medische aandoeningen, en bijbehorende discussies met betrekking tot therapie van het gen en genetische counseling, evenals het gebruik en de verkoop van medicinale supplementen. Een belangrijke beperking is dat het protocol niet voor precieze schatting van de concentratie van enzym, als gevolg van de grondstof gebruikt voor de extractie toelaat. Een wijziging ter verantwoording hiervoor echter zou moeten gebruiken reagens rang enzym voor de assay. Nog belangrijker is, zou dit ook toestaan voor meer nauwkeurige berekening van kinetiek voor het lactase-enzym.

Kortom, het analyseren van de activiteit van lactase in een onderwijs-lab omgeving biedt een robuuste, boeiende en interessante inleiding naar het veld van enzym biologie voor vroeg stadium universitaire studenten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Lactase tablet	Lamberts	8511-60
Phosphate buffered saline (poedervormig)	Sigma	P3813	Opgelost in gedeïoniseerd water tot een uiteindelijke concentratie van 100 mM
ONPG	Sigma	N1127	Opgelost in gedeïoniseerd water tot een uiteindelijke concentratie van 5 mM
Sodium Carbonaat	Sigma	451614	Opgelost in gedeïoniseerd water tot een uiteindelijke concentratie van 1 M
Gedeïoniseerd water	NA	NA
Stamper en vijzel	VWR
Spectrofotometer	Jenway 6315
Pipetten	Gilson
15 mL buisjes	VWR
1,5 mL buisjes	Eppendorf
Spectrofotometer cuvetten	Jenway
Vortex	Vortex genie 2
Centrifuge	Beckman
IJsemmer	VWR
Waterbad	Thermo-Scientific
Weegschalen	Thermo-Scientific