Isolatie van Cognate RNA-eiwitcomplexen van cellen met behulp van oligonucleotide-gerichte Elution

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een aanpak om selectieve cognate RNP's te isoleren die in eukaryote cellen worden gevormd via een specifieke oligonucleotide-gestuurde verrijking. We tonen de toepasbaarheid van deze aanpak door een cognate RNP te isoleren die gebonden is aan het retrovirale 5' niet-vertaalde gebied dat is samengesteld uit DHX9/RNA-helicase A.

Samenvatting

Ribonucleoproteïnedeeltjes dirigeren de biogenese en post-transcriptionele regulatie van alle mRNA's door verschillende combinaties van RNA-bindende eiwitten. Ze bestaan uit positie-afhankelijke, cis-werkende RNA-elementen en unieke combinaties van RNA-bindende eiwitten. Het definiëren van de samenstelling van een specifiek RNP is essentieel om een fundamenteel begrip van gen-regulatie te bereiken. Het isoleren van een specifiek RNP is vergelijkbaar met het vinden van een naald in een hooiberg. Hier demonstreren we een aanpak om RNP's te isoleren die geassocieerd zijn met het 5' onvertaalde gebied van een geselecteerd mRNA in asynchrone, getransfecteerde cellen. Dit cognate RNP is aangetoond als noodzakelijk voor de translatie van geselecteerde virussen en celstress-responsgenen.

Het gedemonstreerde RNA-eiwit co-precipitatieprotocol is geschikt voor de downstream analyse van eiwitcomponenten door middel van proteomische analyses, immunoblots of geschikte biochemische identificatie-assays. Dit experimentele protocol toont aan dat DHX9/RNA-helicase A verrijkt is aan het 5'-uiteinde van cognate retrovirale RNA en geeft voorlopige informatie voor de identificatie van zijn associatie met celstress-geassocieerde huR en junD cognate mRNA's.

Inleiding

Post-transcriptionele genexpressie nauwkeurig geregeld, beginnend met DNA transcriptie in de kern. Gecontroleerd door RNA-bindende eiwitten (RBPs), mRNA biogenese en metabolisme optreden in hoogdynamische ribonucleoproteïnepartikels (RNP's), die associëren en dissociëren met een substraat precursor mRNA tijdens de progressie van RNA metabolisme ^1-3. Dynamische veranderingen in RNP componenten beïnvloeden de post-transcriptionele lot van een mRNA en zorgt voor kwaliteitsborging tijdens de bewerking van primaire transcripten hun nucleaire handel en lokalisatie, hun activiteit als mRNA sjablonen voor translatie en de uiteindelijke omzet van rijpe mRNA.

Talrijke proteïnen worden aangeduid als RBPs vanwege hun geconserveerde aminozuur domeinen, zoals de RNA herkenningsmotief (RRM), de dubbelstrengs RNA-bindende domein (RBD) en stukken van basische residuen (bijvoorbeeld arginine, lysine en glycine) ^4. RBPs zijn routinematiggeïsoleerd door immunoprecipitatie en strategieën worden gescreend om hun verwante RNAs identificeren. Sommige RBPs co-regulering pre-mRNA die functioneel gerelateerd, aangeduid als RNA regulonen ^5-8. Deze RBPs hun cognate mRNA en soms niet-coderende RNA vormen katalytische RNP dat in samenstelling variëren; hun uniciteit komt door verschillende combinaties van geassocieerde factoren, alsmede de chronologische volgorde, locatie, en de duur van hun interacties ^9.

RNA immunoprecipitatie (RIP) is een krachtige techniek om RNP's uit cellen te isoleren en geassocieerde transcripten middels sequentieanalyse ^10-13 identificeren. Verhuizen van kandidaat om genoombrede screening haalbaar is door middel van RIP in combinatie met een microarray-analyse ¹⁴ of high-throughput sequencing (RNAseq) ^15. Evenzo kan co precipiterende eiwitten worden geïdentificeerd door massaspectrometrie, of ze voldoende overvloedig en scheidbaar van de co-precipiterende antilichaam ^16,17. Hierbij gaan we in de methode voor het isoleren van RNP componenten van een specifieke verwante RNA uit gekweekte menselijke cellen, maar de benadering veranderbaar voor oplosbare lysaten van plantencellen, schimmels, virussen en bacteriën. Stroomafwaarts analyses van het materiaal zijn onder andere kandidaat identificatie en validatie door immunoblot, massaspectrometrie, biochemische enzymatische test, RT-qPCR, microarray en RNAseq, zoals samengevat in figuur 1.

Gezien de fundamentele rol van RNP's in het reguleren van genexpressie op post-transcriptioneel niveau, veranderingen in de expressie van component RBPs of de toegang voor verwante RNA's kunnen schadelijk voor de cellen en zijn geassocieerd met verschillende soorten aandoeningen, waaronder neurologische ziekten ^18. DHX9 / RNA helicase A (RHA) nodig voor de vertaling van bepaalde mRNAs van cellulaire en retrovirale oorsprong ^6. Deze verwante RNA's vertonen structureel verwante cis-werkende elementen binnen hun5 'UTR, die wordt aangeduid als de post-transcriptionele controle element (PCE) ^19. RHA-PCE activiteit voor de doeltreffende cap-afhankelijke translatie van vele retrovirussen, zoals HIV-1, en groeiregulerende genen, waaronder JUND ^6,20,21. Gecodeerd door een essentieel gen (dhx9), RHA is essentieel voor celproliferatie en de neerwaartse regulatie elimineert cellevensvatbaarheid ^22. De moleculaire analyse van RHA-PCE RNP is een essentiële stap voor het begrijpen waarom RHA-PCE activiteit noodzakelijk om celproliferatie te regelen.

De precieze karakterisering van de RHA-PCE RNP componenten bij steady state of bij fysiologische verstoring van de cel vereist de selectieve verrijking en de vangst van de RHA-PCE RNP's in voldoende overvloed voor downstream-analyse. Hier PCEgag retroviraal RNA werd gelabeld met 6 kopieën van de cis-werkende RNA-bindingsplaats voor het MS2 manteleiwit (CP) in het open leesraam. De MS2 manteleiwit werd exogenously co-uitgedrukt PCEgag RNA door plasmide transfectie aan de RNP assemblage in groeiende cellen te vergemakkelijken. RNP die het MS2 manteleiwit met cognate MS2-tag PCEgag RNA werden immunogeprecipiteerd uit het celextract en vastgelegd op magnetische korrels (Fig 2a). Selectief vangen de RNP componenten gebonden aan de PCE, werd het geïmmobiliseerde RNP geïncubeerd met een oligonucleotide complementair aan sequenties distaal van de PCE, die een RNA-DNA-hybride dat het substraat voor RNase H activiteit. Aangezien PCE is gelegen in het 5 'uiteinde van de 5' onvertaalde gebied, het oligonucleotide complementair is aan het RNA-sequenties naast de retrovirale translatie startplaats (gag startcodon). RNase H klieving bij de gag startcodon bezit de 5 'UTR van het geïmmobiliseerde complex RNP, die was verkregen als elutiemiddel. Daarna werd het monster geëvalueerd door RT-PCR voor de daarbij PCEgag en door SDS PAGE en immunoblot bevestigt het captu bevestigenre van de doelgroep MS2 manteleiwit. Een validatie van de PCE-geassocieerde RNA bindend eiwit, DHX9 / RNA helicase A, werd vervolgens uitgevoerd.

Protocol

buffer Samenstellingen

Wash Buffer:

50 mM Tris-HCl, pH 7,4

150 mM NaCl

3 mM MgCl2

Buffer met laag zoutgehalte:

20 mM Tris-HCl, pH 7,5

10 mM NaCl

3 mM MgCl2

2 mM DTT

1x proteaseremmer cocktail EDTA-vrij

RNase out 5 pl / ml (RNase-remmer)

Cytoplasma Lysis Buffer:

0,2 M sucrose

1,2% Triton X-100

NETN-150 Wash Buffer:

20 mM Tris-HCl, pH 7,4

150 mMNaCl

0,5% NP-40

3 mM MgCl2

10% Glycerol

Binding Buffer:

10 mM HEPES pH 7,6

40 mM KCl

3 mM MgCl2

2 mM DTT

5% glycerol

Tabel 2: Buffer samenstellingen.

1. Bereiding van de cellen en de affiniteitsmatrix

1. Cultuur een cellijn van belang sub- confluentie (80%) in een 10 cm schaal. Gebruik 10 cm platen voor onafhankelijke immunoprecipitaties (IP) van een FLAG-tag NLS-MS2 manteleiwit. Voer de IP met behulp van antisera aan het FLAG-epitooplabel. Als uiting van de FLAG-tag MS2 manteleiwit plasmide, transfecteren cellen 24-48 uur voorafgaand aan de oogst ^20.
   LET OP: Een bijzondere RNP kan worden verrijkt uit kernenergie of cytoplasmaic lysaten of een biochemisch-gefractioneerde voorbereiding, zoals een fractie van een sucrosegradiënt. Aanbevolen wordt het lysaat van niet-getransfecteerde cellen te oogsten parallel een extra negatieve controle instellen.
2. Transfer 60 pi per IP-proteïne G magnetische kraal slurry naar een 1,7 ml microcentrifugebuis.
3. Plaats de buis op een magneet rek voor reactievaatjes de korrels te scheiden van de opslagoplossing.
4. Verwijder de storage oplossing door voorzichtig de opstelling ervan met een micropipet.
5. Haal de buis uit de magneet rack.
6. Wassen en equilibreren de bolletjes met 600 pi (10 maal het gebruikte volume van korrels) van 1 x wasbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 3 mM _MgCl2 en 150 mM NaCl) en eind-over-eind rotatie van 3 min bij kamertemperatuur.
7. Plaats de buis op de magneet rek en verwijder de wasbuffer.
8. Voeg 10 volumes (600 pl) van 1 x wasbuffer en immunoprecipitatie FLAG antilichaam aan het evenwicht gebracht protein G magnetische korrels (volgens de door de fabrikant voor een immunoprecipitatie hoeveelheid) en roteren end-over-end bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 min aan de immunoprecipitatie antilichaam te conjugeren. Gebruik de overeenkomstige isotype IgG als geschikte antilichaam negatieve controle.
9. Plaats de buis op de magneet rek aan de parels te verzamelen en de supernatant te verwijderen.
10. Haal de buis uit de magneet rek en was de antilichaam-geconjugeerde kralen met 10 volumina (600 ui) van 1 x wasbuffer en rotatie gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap twee keer.
11. Plaats de buis op de magneet rek en verwijder de wasbuffer.

2. Oogsten de RNP

NB: Bereid de RNP's tijdens de incubatietijd na stap 1.8.

1. Verwijderen cultuurmedium uit de cellen door aspiratie en was de cellen tweemaal met 1-5 ml ijskoude 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Gebruik een cel schraper om nat te verjagen,hechtende cellen vóór de winning door centrifugeren bij 226 g gedurende 4 min bij 4 ° C.
2. Voeg 375 ul ijskoude, low-salt buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 mM _MgCl2, 10 mM NaCl, 2 mM DTT, 1 x protease-inhibitor cocktail, EDTA-vrij, en 5 ul / ml RNase Inhibitor) aan de celpellet en laat zwellen door het op ijs gedurende 5 minuten.
   OPMERKING: Pas de hoeveelheid zoutarme buffer volgens de grootte van de celpellet. Voor 1,2 x 10 ⁶ cellen van een 10 cm plaat, 375 ul buffer voldoende.
3. Om de cytoplasmatische cellysaat verzamelen, voeg 125 ul ijskoude lysisbuffer (0,2 M sucrose / 1,2% Triton X-100), en voer vervolgens 10 slagen met een Dounce homogenisator dat was pre-gekoeld in een ijsemmer.
   OPMERKING: Om de totale cel extract verzamelen, wordt standaard RIPA lysisbuffer aanbevolen voor oplossen van de nucleoplasm / chromatine.
4. Spin in een microfuge op topsnelheid (16.000 x g) gedurende 1 minuut; dit zal de supernatant van puin een duidelijknd kernen.
5. Breng de supernatant naar een nieuwe 1,7 ml microcentrifuge buis die op ijs is. Bepaal de totale eiwitconcentratie door een standaard laboratorium voorkeursmethode, zoals de Bradford assay ^23. Reserveren een hoeveelheid van ten minste 10% bij een Western blot analyse, worden gebruikt als input control. Gebruik de geoogste cellysaat onmiddellijk voor immunoprecipitatie of bewaard worden bij -80 ° C voor latere analyse.
   LET OP: In onze ervaring, kunnen deze monsters worden opgeslagen en enkele maanden later gebruikt voor immunoprecipitatie analyse, zonder een compromis van integriteit.

3. Immunoprecipitatie

1. Voeg het gewenste volume van de geoogste cellysaat, gebaseerd op de eiwitconcentratie bepaald in stap 2,5, de beoogde antilichaam-geconjugeerde kralen. Gebruik 1x wasbuffer, komt het totale volume op 600 pl en draai end-over-end voor 90 min bij kamertemperatuur.
   LET OP: Deze periode is voldoende om te generereneen robuuste isolatie van hoge affiniteit RNP-complexen met minimale niet-specifieke binding. Verdun RNP alternatieve bronnen, zoals fracties van een sucrosegradiënt, ten minste 1: 1 met 1 x wasbuffer en vervolgens incubeer ze met eerder bereide bead-antilichaam complexen, zoals hierboven vermeld.
2. Na 90 min incubatie, plaatst het IP buis op de magneet rek om de kralen te verzamelen. Behouden het supernatant doorstroming.
   LET OP: Deze eerste flow-through is een belangrijke controle monster naar IP-efficiëntie te meten. Een immunoblot bepaling een indicatie van IP efficiëntie en de specificiteit van de onderzochte interacties. Het wordt aanbevolen om deze supernatant voor downstream-analyse te houden.
3. Was het RNP gebonden antilichaam-geconjugeerde kralen met 10 volumina (600 ui) ijskoude NETN-150 wasbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM _MgCl2, 0,5% NP40, en 10% glycerol) onder rotatie gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal stap 3 keer.
   LET OP: Deze buffer verschilt van de lysis buffer en vermindert effectief zwakke of niet-specifieke verenigingen.
4. Na de laatste maal wassen, resuspendeer de geïmmobiliseerde RNP-complexen in 60 ul ijskoude 1x bindingsbuffer (10 mM HEPES, pH 7,6, 40 mM KCl, 3 mM _MgCl2, 5% glycerol en 2 mM DTT) en reserve 10% van het geïmmobiliseerde complex kralen voor Western blot en 20% voor RNA-isolatie.

4. Elutie

1. Pas het resterende volume op 100 pi met ijskoude bindingsbuffer 1x en verwarm de buis bij 70 ° C gedurende 3 min.
2. Om cognate RNA-eiwitcomplexen isoleren voeg een ~ 30-nt DNA-oligonucleotide dat complementair is aan het 3'-sequentie grens van het RNA van belang en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder zacht schommelen (100 nM oligonucleotide is voldoende).
   OPMERKING: De oligonucleotide antisense is met de nucleotide residuen naast de translatie start plaats van de PCE construct gebruikt als example in dit protocol. Geschikte sequentie complementariteit wordt gevormd door de ~ 40% GC-gehalte. Ontwerp de antisense oligonucleotide efficiënte hybridisatie aan de minimum complementaire gebied van het doel-RNA.
3. Voeg 5-10 eenheden RNase H aan de buis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur om het RNA van de RNA splitsen: DNA hybride. Breng het supernatant in een steriele 1,7 ml microcentrifugebuis; dit monster bevat de gevangen RNP complexen van belang.
   Opmerking: Afhankelijk van de toegankelijkheid van de verwante RNA, kunnen twee of meer ronden van RNase H behandeling nuttig zijn om het monster overvloed van de stroomafwaartse analyses toe.
4. Gebruik 20% van het eluaat in een Western blot voor bekende geassocieerde eiwitten en 20% van het eluaat voor RNA-isolatie gevolgd door RT qPCR. De resterende 60% kan worden gebruikt voor massaspectrometrie of eiwitcomponenten identificeren.
5. Tegelijkertijd patiënt van een hoeveelheid van de gereserveerde cellysaat RNA isolatie en RT-PCR analyse. dit assessment geeft een indicatie van de verrijking van RNA in een RNP complex.
   OPMERKING: Gebruik het geïsoleerde eiwitpreparaat in een controlegroep western blot om vast te stellen dat de RNase H splitsing was effectief in het vrijgeven van de RNP uit het immunuoprecipitated complex.

5. Eiwit Elektroforese en Western Blot Analyse

1. Betreft ongeveer 10-20% van het totale monster aan SDS-PAGE en immunoblot analyse volgens standaard laboratoriumprotocol.
   LET OP: Deze stap dient om IP-efficiëntie en specificiteit voorafgaand valideren aan downstream RNA-analyse. Het kan ook worden gebruikt om de eiwitsamenstelling van het geïsoleerde RNP complex beoordelen.

6. Collectie van de immunogeprecipiteerd RNA

OPMERKING: RNA-isolatie kan door Trizol methode of volgens de methode beschreven protocol.

1. Resuspendeer de helft van het totale monster in 750 pl zuur guanidinium thiocyanaat reagens en incubeer bij kamertemperatuur temperature gedurende 5 minuten voor het extraheren van het RNA van de gevangen PCE-RNP-complexen.
2. Voeg 200 pl chloroform aan de buis, schud krachtig gedurende 10 seconden, en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 3 min.
3. Na centrifugatie bij 16.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C, verzamel de waterfase opnieuw in buis en een gelijk volume isopropanol. Goed mengen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 10 min. Voeg 1 pl glycol blauw aan het monster en het op -20 ° C in de vriezer efficiënte precipitatie of verwerking op een later tijdstip.
4. Centrifugeer de buis bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verzamel zorgvuldig Verwijder de bovenstaande vloeistof teneinde de RNA pellet niet verstoren; het gebruik van een p-200 micropipet tip wordt aanbevolen om dit proces te vergemakkelijken.
5. Voeg 500 pl 75% ethanol aan elke buis, vortex en gecentrifugeerd buizen bij 16.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Zorgvuldig te verzamelen en gooi het supernatant zoals in stap 6.4. Lucht-droog de pellet gedurende 2-3 min en resuspendeer in 100 gl RNase-vrij water.
   LET OP: Wees niet te verlengen de tijd dat de pellet lucht droogt om een ​​probleem met de resuspensie te voorkomen.
6. Breng 100 pl RNA monster een RNA clean-up kolom. Verwerken behulp protocol van de fabrikant. Elueer het RNA in 30 gl RNase-vrij water en bewaar bij -80 ° C maximaal 3 maanden.
   LET OP: Deze geïsoleerde RNA is geschikt voor downstream-analyse door middel van RT-real-time PCR (qPCR), microarray en RNA sequencing. Afhankelijk van de overvloed van de RNP en de efficiëntie waarmee de RNP van belang wordt geïsoleerd, kan hetzelfde lysaat worden onderworpen aan twee of meer ronden van IP voldoende RNA toepasbaar voor de stroomafwaartse analyses genereren.

7. RNA reverse transcriptie en amplificatie van cDNA door PCR

1. Het aldus geïsoleerde RNA transcriptie keren door een willekeurige primer met een hoogwaardige reverse transcriptase (RT) volgens de manufacturer's instructies.
2. Om het RNA van belang te versterken, het ontwerpen van een gen-specifieke antisense primer binnen de RNase H splitsing volgorde. Met vergelijkbare hoeveelheden van de antisense oligonucleotide, een willekeurige primer of een oligo-dT primer (zie tabel Materials).
   OPMERKING: De oligo-dT primer en poly-geadenyleerde mRNA leveren positieve controle reacties voor de RT-PCR reacties.
3. Reserve 5% van de RT-reactie (1 ui) van een preparatieve qPCR gedaan in combinatie met negatieve controle lysaat IP en positieve controle-DNA monsters de cutoff definiëren en produceren een standaardcurve. Als de CT waarde van de preparatieve qPCR ligt buiten het gebied van de standaardkromme Verdun de RT-reactie in stappen 1: 5 verdunningen en herhaal stap 7,2.
   LET OP: Voor een RNA-sequencing en massaspectrometrie techniek, zie de aanvullende methode bestand. Klik hier to bekijk deze aanvullende methode bestand. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Resultaten

Voorafgaand RIP resultaten geïdentificeerd retrovirale gag RNA's en geselecteerde cellulaire RNA's die samen met neerslag DHX9 / RHA, waaronder HIV-1 ^6, JUND ⁶ en Hur (Fritz en Boris-Lawrie, niet gepubliceerd). De retrovirale 5 'UTR is aangetoond dat co-precipiteren met DHX9 / RHA in de kern en samen te isoleren in het cytoplasma op polyribosomen. Het is uniek gedefinieerd als de cis-werkende post-transcriptie controle element (PCE) ^6.

Discussie

De RNP isolatie en verwante RNA identificatiestrategie hier beschreven selectieve middel van onderzoek van een specifiek RNA-eiwit interactie en ontdekken kandidaateiwitten co-regulering een bepaald RNP in cellen.

Het voordeel van het gebruik van oligonucleotide-gerichte RNase H klieving om RNP te isoleren is de mogelijkheid te vangen en specifiek wat de RNP-cis- werkende RNA-element over heterogene RNP stroomafwaarts gebonden aan het cis-werkende RNA-element plaats. Vanwege de overvloed van...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dynabeads Protein A	Invitrogen	10002D
Dynabeads Protein G	Invitrogen	10004D
Anti-FLAG antilichaam	Sigma	F3165
Anti-FLAG antilichaam	Sigma	F7425
Anti-RHA antilichaam	Vaxron	PA-001
TRizol LS reagent	Life technology	10296-028
RNase H	Ambion	AM2292
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1
Isopropanol	Fisher Scientific	BP26184
RNaeasy opruimkolom	Qiagen	74204
Omniscript reverse transcriptase	Qiagen	205113
RNase Out	Invitrogen	10777-019
Protease remmercocktail	Roche	5056489001
Triton X-100	Sigma	X100
NP-40	Sigma	98379
Glycerol	Fisher Scientific	17904
Random hexamer primers	Invitrogen	N8080127
Oligo-dT primers	Invitrogen	AM5730G
PCR primers	IDT		Gen specifieke primers voor  PCR versterking
Oligonucleotide voor RNase H gemedieerde splitsing	IDT		Anti-sense primer voor doelwit RNA
Trypsine	Gibco Life technology	25300-054
DMEM weefselkweekmedium	Gibco Life technology	11965-092
Foetaal bovien serum	Gibco Life technology	10082-147
Tris base	Fisher Scientific	BP152-5
Natriumchloride	Fisher Scientific	S642-212
Magnesiumchloride	Fisher Scientific	BP214
DTT	Fisher Scientific	R0862
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-212
Nitrocellulose membraan	Bio-Rad	1620112
Magnetische standaard			1,7 ml micro-centrifugebuisje vasthouden
Laminaire kap			Voor dierlijke weefselkweek
CO2 incubator			Voor dierlijke weefselkweek
Eiwitgelapparaat			Eiwitsteekproefscheiding
Eiwitoverdrachtsapparaat			Eiwitsteekproefoverdracht
Klaar voor gebruik eiwitgelen (4-15%)			Eiwitsteekproefscheiding
Centrifuge op tafel			Pellet de steekproef naar beneden
Rotator op tafel			Meng de steekproef van begin tot eind
Vortex			Meng de steekproeven