CUBIC Protocol Visualiseert Protein Expression op enkel cel resolutie in Whole Mount Skin Voorbereidingen

Summary

Dit rapport beschrijft een KUBIEKE protocol om de volledige dikte muis huid biopten te verduidelijken en te visualiseren eiwit expressie patronen, delende cellen, en sebocyten bij de enkele resolutie cel in 3D. Deze methode maakt een nauwkeurige evaluatie van de huid anatomie en pathologie, en abnormale epidermale fenotypes in genetisch gemodificeerde muis lijnen.

Abstract

De huid is essentieel voor overleving. De buitenste epidermale laag bestaat uit de interfolliculaire epidermis, wat een meerlagig plaveiselepitheel die het grootste deel van ons lichaam en epidermale aanhangsels zoals de haarfollikels en zweetklieren. De epidermis ondergaat regeneratie gedurende het hele leven en in reactie op letsel. Dit wordt mogelijk gemaakt door K14 expressie basale epidermale stamcellen / voorlopercellen cel populaties die strak worden gereguleerd door meerdere regulerende mechanismen actief binnen de epidermis en tussen de opperhuid en de lederhuid. Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode om de volledige dikte muis huid biopten te verduidelijken en te visualiseren K14 eiwit expressie patronen, Ki67 gelabeld delende cellen, Nile Red label sebocyten en DAPI nucleaire etikettering op één resolutie cel in 3D. Deze methode maakt een nauwkeurige evaluatie en kwantificering van de huid anatomie en pathologie, en abnormale epidermale fenotypes in genetisch gemodificeerde muis lijnen. De CUBIC protocol is the best beschikbare methode tot op heden de moleculaire en cellulaire interacties in de volledige dikte van de huid biopsieën bij enkele resolutie cel te onderzoeken.

Introduction

De huid is essentieel voor overleving. Het bestaat uit drie lagen van de buitenste epidermis, de dermis en de hypodermis. De epidermis is een zeer regeneratief weefsel. Het is een geschubde gelaagd epitheel, bestaat voornamelijk uit keratinocyten. Keratinocyten worden geboren in de basale laag, en omhoog bewegen door de suprabasale lagen terwijl differentiëren, en ze uiteindelijk worden afgeworpen in de buitenste laag verhoornde ongeveer een maand na hun geboorte. De epidermis ontwikkelt een aantal aanhangsels waaronder de haarfollikels en talgklieren. De haarzakjes ook regenereren op een cyclische manier gedurende het hele leven ^1. De regeneratieve capaciteit van de epidermis wordt mogelijk gemaakt door de aanwezigheid van stamcellen en cellen die zich bevinden in de basale laag van de epidermis en interfolliculaire haarfollikel ^2.

Veel signaalroutes zijn betrokken bij epidermale ontwikkeling en regeneratie. Sommige van deze optreden binnenalleen de epidermis, zoals de Hedgehog pathway. Andere signalering evenementen plaats tussen dermis en epidermis ^3. Zo worden Wnt signalen van de dermis belangrijk geacht voor haarfollikel ontwikkeling, en ze worden uitgescheiden door de dermale papilla bij het ​​begin van anagen activeren haarfollikel uitstulping stam / voorlopercellen celproliferatie en haarzakje groei ^4. Het is belangrijk om de cellulaire en moleculaire mechanismen die epidermale ontwikkeling en regeneratie controle beter te begrijpen hoe ze regeneratieve huidziekte kan worden verstoord zoals huidkanker begrijpen.

Dit artikel beschrijft een C Lear, U nobstructed B regen I maging cocktails en C omputational analyse (KUBIEKE) protocol ^5-7 op hele berg voorbereidingen huid te verduidelijken en te visualiseren eiwit expressie patronen in 3 dimensies op één resolutie cel door confocale microscopie. De KUBIEKE methode houdt onderdompelen van de huidweefsel in twee-aminoalcohol gebaseerde chemische cocktails. Deze oplossingen stellen de brekingsindex in de huid monster, waardoor het weefsel transparante en de eiwitten intact, waardoor immunodetectie op enkele resolutie cel.

Gebruik van deze CUBIC protocol, de basale prolifererende keratinocyten in de populaties interfolliculaire epidermis en in haarfollikels werden afgebeeld in volledige dikte huid biopten van wildtype muizen met behulp van anti-Keratin14 (K14) en anti-Ki67-antilichamen. Talgklieren in wild-type huid biopten werden ook gevisualiseerd met behulp van Nile Red kleuring. Ten slotte is de basale keratinocyten bevolking in wild-type en hyperplastische YAP2-5SA-ΔC huid biopsieën werden vergeleken ^8.

Dit CUBIC protocol maakt visuele beoordeling van eiwitexpressie in volledige dikte van de huid biopsieën bij enkele resolutie cel, en is een belangrijk instrument om epidermale anatomie en morfologische gebreken in de huid van genetisch gemodificeerde waarderenmuizen, en de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen epidermale ontwikkeling en regeneratie te onderzoeken.

Protocol

Ethiek Verklaring: Alle procedures waarbij proefdieren volgen de richtlijnen van de Animal Care en Ethische Commissie (ACEC) bij UNSW Australië onder goedgekeurde ACEC protocol 13 / 64B.

1. Bereiding van de transparante muis huidweefsel

Opmerking: Alle muizen die in deze studie werden op een C57BL / 6 genetische achtergrond

1. Het verzamelen van de muis huidweefsel.
   1. Humaan euthanaseren de muizen door cervicale dislocatie.
   2. Verwijder haren voorzichtig uit de betreffende huid met een trimmer verzorgen van de huid niet te verwonden.
   3. Was de huid te ontsmetten met 70% ethanol in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
   4. Til dorsale nekvel met een pincet en maak incisie met een schaar.
   5. Ontleden een groot gebied van de dorsale huid van muizen (ongeveer 1,5 x 4 cm).
   6. Plat huid dermis naar beneden op een filter papier en noteer de anterior-posterior oriëntatie van het monster.
   7. Trim filterpapier rond de ontleed huid, en plaats in een 15 ml buis gevuld met vers bereide 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing in PBS.
   8. Oplossing voor 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht in de koelkast bij 4 ° C.
   9. Was de huid 2 x 5 minuten in PBS in een 15 ml buis.
      Opmerking: de volgende (1.1.10 - 1.1.12) zijn optionele stappen voor langdurige opslag van weefsel termijn.
   10. Uitdrogen huid ontleed in PBS met toenemende concentratie ethanol (25%, 50% 70%) in een 15 ml buis gedurende 1 uur-wasstappen bij kamertemperatuur.
   11. WINKEL vochtarme huid in 70% ethanol in PBS in een 15 ml buis bij 4 ° C tot verder gebruik.
   12. 4 uur voor clearing, hydrateren huidweefsel in PBS met afnemende concentratie aan ethanol (70%, 50%, 25%, 0%) in een 15 ml buis gedurende 1 uur-wasstappen bij kamertemperatuur.
2. Wissen van de muis huid biopsieën
   1. Bereid de CUBIC1 clearingoplossing door het oplossen van 3,85 g ureum en 3,85 g N, N, N ', N'tetrakis (2-hydroxypropyl) ethyleendiamine in 5,38 ml gedestilleerd water op een verwarmer ingesteld op 60 - 70 ° C. Gebruik een hot roerder.
   2. Voeg 2,31 g polyethyleenglycol-mono-p-isooctylfenylether / Triton X-100 aan de oplossing zodra duidelijk is en heeft tot kamertemperatuur afgekoeld.
   3. Snijd de muis huid met een scherp scheermesje in biopten van ongeveer de afmetingen 0,2 x 0,5 cm, en dompel in 5 ml CUBIC1 clearing oplossing in een buis van 15 ml. Om de visualisatie van haarfollikels optimaliseren zorgen dat de langste zijde van de biopsie langs de antero-posterieure richting van het monster wordt gesneden.
   4. Plaats op een roterend platform in een hybridisatie oven bij 37 ° C.
   5. Verander de clearing oplossing na 7 dagen. Bereid verse CUBIC1 oplossing voor gebruik.
   6. Controleer de transparantie van het weefsel na 7 dagen. Eventueel laat biopten in CUBIC1 clearingoplossing totdat het weefsel volledig transparant.
   7. Zodra de huidbiopsie transparant,Verwijder de CUBIC1 oplossing en voeg 4 ml van 1 x PBS om het weefsel 4 keer wassen gedurende 6 uur bij 37 ° C.
   8. Was het huidweefsel in 20% w / v sucrose in PBS in een 15 ml buis gedurende 4 uur bij 37 ° C.
   9. Freeze het weefsel in montage medium Optimal Cutting Temperatuur (LGO) verbinding in een 15 ml buis 's nachts in een -80 ° C vriezer.
      Opmerking: Deze stap zal de permeabiliteit van de biopsie voor antilichaam penetratie in de volgende stappen te verhogen.

2. immunofluorescentiekleuring

1. Ontdooien weefsel van 1.2.9) tot kamertemperatuur gedurende 2-3 uur.
2. Wassen weefsel in de 15 ml buis met 5 ml PBS gedurende 8 uur bij kamertemperatuur LGO Verbinding verwijderen.
3. Overdracht biopten een 2 ml buisje en incubeer weefsel in 1 ml konijnen-anti-Keratin14 of konijn anti-Ki67 antilichamen, zowel verdund 1: 100 in PBST (PBS + 0,1% Triton-X100) gedurende 3 dagen op een schudinrichting in een 37 ° C oven.
4. Overdracht biopten een 15 ml buis, eennd wassen weefsel 4 keer gedurende 6 uur in 5 ml PBST op een schudinrichting in een 37 ° C oven.
5. Overdracht biopten een 2 ml buisje, voeg 1 ml anti-konijn alexa594 secundair antilichaam verdund 1: 100 in PBST en incubeer 3 dagen op een schudinrichting in een 37 ° C oven.
6. Overdracht biopten een 15 ml buis en was 4 keer weefsel 6 uur in 5 ml PBST op een schudinrichting in een 37 ° C oven.
7. Overdracht biopten een 2 ml buisje, voeg 1 ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tegenkleuring nucleaire oplossing (1: 1000) in PBST en overnacht incuberen op een schudinrichting in een 37 ° C oven.
8. Verwijderen DAPI tegenkleuring oplossing en voeg 1 ml PBST naar 2 ml buis weefsel 4 keer gedurende 6 uur was op een schudinrichting in een 37 ° C oven.
   Opmerking: Optionele stap: Biopsieën kunnen in het donker worden opgeslagen in 1x PBS met 0,02% natriumazide gedurende minstens 3 weken.

3. Nile Red kleuring

1. Lossen Nile Red poeder in dimethylsulfoxide (DMSO) tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg / ml
2. Voeg 1 ul Nile Red oplossing van 1 ml PBS tot een eindconcentratie van 1 ug / ml.
3. Ontdooien weefsel van 1.2.9) tot kamertemperatuur gedurende 2-3 uur, en was met 5 ml PBS gedurende 8 uur bij kamertemperatuur geroerd.
4. Transfer biopten een 2 ml buisje en dompel weefsel in 1 ml Nile Red kleuroplossing gedurende 2,5 uur bij kamertemperatuur geroerd.
5. Was de huid biopten in 2 ml buis met 1 ml PBST 4 keer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
6. Verwijderen PBST oplossing van 2 ml buis, voeg 1 ml DAPI tegenkleuring nucleaire oplossing (1: 1000) in PBST en incubeer overnacht bij kamertemperatuur.
7. Verwijderen DAPI tegenkleuring oplossing en voeg 1 ml PBST in 2 ml buis het huidweefsel 4 keer wassen gedurende 6 uur bij kamertemperatuur geroerd.
   Opmerking: Optionele stap: Biopsieën kunnen in het donker worden opgeslagen in 1x PBS met 0,02% natriumazide gedurende minstens 3 weken.

4. Imaging

1. Bereid de CUBIC2 clearing oplossing, die 50 bevat% (W / v) sucrose, 25% (w / v) ureum, 10% (w / v) 2,2 ', 2' '- nitrilotriethanol en 0,1% (v / v) Triton X-100.
2. Incubeer het huidweefsel in 1 ml CUBIC2 oplossing in een 2 ml buis op een schudder gedurende 24 uur in een 37 ° C oven. Deze stap wordt de brekingsindex van het weefsel gelijk te.
3. Controleer de helderheid van het weefsel. Zodra duidelijk is, plaatst de gehele huid biopsie (0,2 x 0,5 cm) aan de lange zijde op een glazen dekglaasje, zodat de richting van de lengte van de haarfollikels evenwijdig aan de dekglaasje oppervlak (# 1 24 x 60 mm)
   Opmerking: Optionele stap: Antilichaam-bevlekte biopsieën kunnen CUBIC2 oplossing bewaard gedurende ongeveer 7 dagen. Nile rood gekleurde biopten kunnen alleen worden opgeslagen in CUBIC2 oplossing tot 1 dag, en zo spoedig mogelijk worden afgebeeld.
4. Bereid beeldvorming kamer (figuur 1)
   Opmerking: verbruiksartikelen die nodig zijn voor de voorbereiding van de beeldvorming kamer zijn: blauwe tack, spelen deeg of vergelijkbaar, en 2 dekglaasjes (24 x 50 mm) (FIGUUR 1A).
   1. Bereid twee dunne stroken blauwe tack (diameter van ongeveer 1 mm x 2 cm), en twee dekglaasjes (Figuur 1B).
   2. Plaats blauwe tack strips op een dekglas, zodat voldoende ruimte voor de huid biopsie (figuur 1C). 4.4.3)
   3. Plaats huidbiopsie tussen strips op het dekglaasje in een druppel CUBIC2 oplossing (figuur 1C).
   4. Bedek de huid biopsie met de tweede dekglaasje (figuur 1D).
5. Plaats de beeldvorming kamer met gemonteerde huidbiopsie op het podium van een confocale microscoop en zet het weefsel in het licht pad.
6. Scan de monster met behulp van een kwik of halogeen lichtbron en standaard epifluorescentie filters (bijvoorbeeld DAPI / GFP / CY3 / CY5) aan fluorescerend gebrandschilderde regio's van belang te identificeren.
7. Afbeelding regio's van belang met behulp van een 10x en 20x objectief (NA 0,75) en standaard confocale fluorescentie beeldvormende technieken (bv. Met DAPI gekleurd monsters verlichten met een 405 nm laser en het verzamelen van fluorescentie-signaal tussen 425-475 nm, en met Alexa Fluor 594 of Nile Red-gekleurd monsters verlichten met een 561 nm laser en het verzamelen van fluorescentie-signaal tussen 570-620 nm).
8. Genereer afbeelding Z-stacks van elke regio van belang met behulp van microscoop Z-stack beeldacquisitie software (bijv., Met behulp van NIS elementen imagingsoftware 4.13 zoals hieronder beschreven).
   1. Zorgen voor een optimale laservermogen en de PMT HV / Offset instellingen zijn geselecteerd om te proeven fluorescentie te verzamelen.
   2. Open de "ND Acquisition" toolbar van "Acquisition Controls".
   3. Selecteer het tabblad "Z-serie Setup" (ervoor zorgen dat alle andere tabbladen zijn niet geselecteerd).
   4. Terwijl levende scannen focus naar de bovenzijde van het monster en de "top" knop.
   5. Focus op de onderkant van het monster en druk op de "Bottom" knop.
   6. Input verplichte stap grootte (of druk geoptimaliseerd stapgrootte knop).
   7. Press de "Run nu" knop.
   8. Spaar resulterende Z-stacks als individuele Tiff beeld stacks (1 fluorochroom per beeld Z-stack).
9. Gebruik beeld Z-stacks 3D volume interessante gebieden gebruiken 3D analysesoftware reconstrueren (bv., Middels Imaris x64 7.2.3 zoals hieronder beschreven).
   1. Start analysesoftware.
   2. Kies "Overtref" knop in toolbar voor 3D volume generatie.
   3. Open de eerste afbeelding in kleur Z-stack (bijv., DAPI).
   4. Gebruik de 'add channel' hulpmiddel om extra kleur kanalen, één kanaal per fluorochroom toe te voegen. Zo een monster dat zowel DAPI en Alexa Fluor 594 fluorochromen zullen twee kanalen nodig.
   5. Gebruik de "Eigenschappen afbeelding" tool om de juiste pixel (voxel) afmetingen set (XYZ), zoals bepaald in 4.7 hierboven.
   6. Gebruik "weergaveaanpassing" tool om het kanaal kleuren te veranderen als dat nodig is (bijvoorbeeld, ingesteld DAPI kanaal naar blauw, Alexa Fluor 594 kanaal naar rood).
   7. om poPositioneer het 3D-volume in het venster beeld, gebruik maken van de computer muis te klikken en het volume te slepen, zoals vereist.
   8. Gebruik de "Snapshot" tool in de werkbalk om screenshots van het 3D-beeld te genereren.
   9. Gebruik de "Animation" tool in de toolbar om films van 3D monster rotatie te genereren.

Results

Volledige dikte dorsale huid biopten van volwassen wildtype muizen werden opgehelderd, gekleurd met een antilichaam bindend basale keratinocyten marker Keratin14 (K14), en de kernen werden tegengekleurd met DAPI kleuring oplossing (figuur 2 en Film 1).

DAPI-positieve kernen werden zichtbaar in het monster (Figuur 2A, C) en K14 kleuring zichtbaar uitsluitend in één cel dikke basale laag van de interfolliculaire epidermis, en waarin de talgkli...

Discussion

De regulerende mechanismen die de ontwikkeling en homeostase huid worden meestal bestudeerd in 2D behulp van weefsel snijden en histologische kleuring of merken met antilichamen, die slechts een beperkte appreciatie huid morfologie, celpopulaties of eiwitexpressie mogelijk maakt. Een aantal werkwijzen zijn ontwikkeld om visualisatie van de ruimtelijke organisatie van cellen en eiwitten op één resolutiecel verbeteren 3 dimensies epidermale whole mounts ^10-13. Sommige van deze echter gescheiden van de epidermis...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6418
Ethanol 96% (undenaturated)	Chem-supply	UN1170
Nile Red	Sigma-Aldrich	72485-100MG
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Roche	10236276001
N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethyleendiamine	Merck Millipore	821940
Polyethyleenglycol mono-p-isooctylfenylether	Merck Millipore	648462
Triton X-100	Merck Millipore	648462
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	Tissue-Tek	4583
anti-Keratin14 antilichaam	Covance	PRB-155P
anti-Ki67 antilichaam	Abcam	ab16667
Donkey anti-konijn Alexa 594	Life Technologies	A21207
Dimethylsulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Urea	Merck Millipore	66612
2,2′,2′’-nitrilotriethanol	Merck Millipore	137002
Confocale microscoop	Nikon Instruments Inc	Nikon A1 - Confocale microscoop
cruZer6 Gezichtstrimmer	Braun	Braun cruZer6 Gezicht
Natriumazied	Sigma-Aldrich	438456