Soorten Bepaling en kwantificering in mengsels met behulp van MRM Massaspectrometrie van peptiden Applied to Meat Authentication

Samenvatting

We presenteren een protocol voor het identificeren en kwantificeren van de componenten in mengsels van soorten met vergelijkbare eiwitten. Massaspectrometrie detecteert peptiden voor identificatie en geeft relatieve kwantificering door middel van piekoppervlakteratio's. Als hulpmiddel voor voedsel om fraude te detecteren, kan de methode 1% paard detecteren in rundvlees.

Samenvatting

We beschrijven een eenvoudig protocol voor het identificeren en kwantificeren van de twee componenten in binaire mengsels van soorten met een of meer vergelijkbare eiwitten. Centraal in de methode staat de identificatie van 'overeenkomstige eiwitten' in de soorten van belang, met andere woorden eiwitten die nominaal hetzelfde zijn, maar soortspecifieke sequentieverschillee hebben. Wanneer ze worden onderworpen aan proteolyse, zullen overeenkomstige eiwitten enkele peptiden opleveren die eveneens vergelijkbaar zijn, maar met soortspecifieke varianten. Dit zijn 'overeenkomstige peptiden'. Soortspecifieke peptiden kunnen worden gebruikt als markers voor soortbepaling, terwijl paarsgewijze overeenkomstige peptiden relatieve kwantificering van twee soorten in een mengsel mogelijk maken. De peptiden worden gedetecteerd met behulp van massaspectrometrie met meerdere reactiebewaking (MRM), een zeer specifieke techniek die peptide-gebaseerde soortbepaling mogelijk maakt, zelfs in complexe systemen. Bovendien ondersteunt de verhouding van MRM-piekgebieden die afkomstig zijn van overeenkomstige peptiden relatieve kwantificering. Aangezien overeenkomstige eiwitten en peptiden zich in het algemeen vergelijkbaar gedragen bij zowel verwerking als bij experimentele extractie en monstervoorbereiding, zou de relatieve kwantificering relatief robuust moeten blijven. Bovendien heeft deze aanpak geen standaarden en kalibraties nodig die vereist zijn door absolute kwantificeringsmethoden. Het protocol wordt beschreven in de context van rood vlees, dat geschikte overeenkomstige eiwitten heeft in de vorm van hun respectieve myoglobinen. Deze toepassing is relevant voor de detectie van voedselfraude: de methode kan 1% gewicht voor gewicht paardenvlees in rundvlees detecteren. De relatieve kwantificering van overeenkomstig eiwit, overeenkomstig peptide (CPCP) met behulp van MRM-piekgebieden geeft goede schattingen van de gewicht voor gewicht samenstelling van een mengsel van paarden- en rundvlees.

Inleiding

Het Europese paardenvleesschandaal van 2013, waarbij onverklaard paardenvlees werd gevonden in een aantal rundergehaktproducten in de supermarkt¹, onderstreept de noodzaak van testmethoden die voedselfraude in vlees kunnen detecteren en meten. Er zijn verschillende technologieën onderzocht, met name enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) en DNA-gebaseerde methoden². Een alternatieve route, gebaseerd op massaspectrometrie, richt zich op soortspecifieke peptiden die op hun beurt voortkomen uit soortspecifieke eiwitten. Hier schetsen we een dergelijke peptide-gebaseerde benadering die zowel identificatie als relatieve kwantificering van de vervalsingssoort in een vleesmengsel biedt³.

Het protocol is geformuleerd in de context van rood vlees en de wens om de aanwezigheid van het ene in het andere te bepalen op het niveau van 1% per gewicht, het niveau dat door sommigen als frauduleuze voedselvervalsing wordt beschouwd in tegenstelling tot besmetting⁴. De methode berust in de eerste plaats op het identificeren van een eiwit dat nominaal 'het zelfde' is in alle doelvleessoorten. Myoglobine, het eiwit dat verantwoordelijk is voor de rode kleur van vlees, is een goede kandidaat omdat het overvloedig, relatief hittetolerant en wateroplosbaar is, en eerder is gebruikt voor soortbepaling van vlees^5,6. De myoglobinen voor rundvlees (Bos Taurus), varkensvlees (Sus scrofa), paardenvlees (Equus caballus) en lamsvlees (Ovis aries)³, bijvoorbeeld, zijn nominaal hetzelfde, zoals vereist, maar hun sequenties zijn niet identiek. Dergelijke groepen van'vergelijkbare maar verschillende' eiwitten, zoals deze vier myoglobinen, kunnen gemakkelijk worden beschreven als 'corresponderende eiwitten'. De sequentieverschille in deze vier myoglobinen zijn soortspecifiek: de volledige myoglobine-eiwitten voor rundvlees en paardenvlees, P02192 en P68082 respectievelijk, bestaan bijvoorbeeld elk uit 154 aminozuren met 18 sequentieverschille tussen de twee. Onderworpen aan proteolyse met behulp van trypsine produceren deze eiwitten twee sets peptiden, waarvan sommige identiek zijn en sommige een of meer soortspecifieke aminozuurverschillen vertonen: corresponderende eiwitten geven dus aanleiding tot corresponderende peptiden.

De CPCP-benadering probeert daarom eerst eiwitten van twee of meer soorten te identificeren waarbij deze eiwitten beperkte soortspecifieke sequentievarianten vertonen. Dit zijn corresponderende eiwitten. Na proteolyse geven corresponderende eiwitten aanleiding tot peptiden, waarvan sommige eveneens soortspecifieke sequentievarianten vertonen die zijn overgenomen van het ouder-eiwit. Dit zijn corresponderende peptiden. De CPCP-aanpak kan worden gebruikt om de niveaus van twee corresponderende eiwitten in een gemengde soort-monster te vergelijken door de niveaus van corresponderende peptiden te monitoren.

De natuurlijke technologie voor de detectie van bekende peptiden is meervoudige reactiemonitoring massaspectrometrie, of MRM-MS⁷. Soortspecifieke peptiden leveren precursor-ionen op, die samen met hun fragment-ionen uit de massaspectrometrie, gemakkelijk van tevoren worden opgesomd door softwaretools. Deze lijsten worden vervolgens gebruikt om de massaspectrometer te instrueren om alleen specifieke precursor- plus fragment-ionenparen, zogenaamde overgangen, op te nemen. Een bepaald doelpeptide wordt daarom niet alleen geïdentificeerd door zijn retentietijd in de chromatografie voorafgaand aan de massaspectrometer, maar ook door een set overgangen die een gemeenschappelijk precursor-ion delen. Dit is een zeer selectieve manier om bekende peptiden te detecteren die efficiënt gebruik maakt van het massaspectrometer-middel.

Andere auteurs hebben massaspectrometrie gebruikt om vleesvervalsing te testen via peptidemarkers maar van verschillende eiwitten^8-14. Het gebruik van de corresponderende eiwitten, corresponderende peptiden (CPCP) schema betekent echter dat experimentele omstandigheden kunnen worden geoptimaliseerd, wat de identificatie van de soort in het mengsel uit bekende soortspecifieke overgangen helpt. Bovendien zullen corresponderende eiwitten en peptiden zich over het algemeen vergelijkbaar gedragen in de extractie-, proteolyse- en detectiefasen. Omdat de piekgebieden van de overgangen kwantitatief en reproduceerbaar zijn, bieden verhoudingen van piekgebieden afkomstig van paren van corresponderende peptiden van verschillende soorten een directe schatting van de relatieve hoeveelheden van twee vleessoorten in een mengsel. In tegenstelling daarmee exploiteren meer traditionele kwantificatieroutes kalibraties op basis van referentiematerialen om absolute kwantificering vast te stellen^14,15.

Hoewel het protocol wordt geschetst in de context van myoglobine en vlees, kunnen andere eiwitten dan myoglobine worden gebruikt voor identificatie en relatieve kwantificering via de CPCP-strategie in vleesmengsels, hoewel mogelijk met wijzigingen in het protocol. Bovendien is de strategie ook toepasbaar op binaire mengsels van andere soorten die een of meer corresponderende eiwitten delen.

Het startpunt voor het protocol is gezuiverd 'referentie' myoglobine, dat voor sommige soorten kan worden gekocht, maar voor andere moet worden bereid door conventionele chromatografie met uitsluiting van grootte. De procedure voor het bereiden van referentiemyoglobine is niet opgenomen in het protocol, maar wordt elders beschreven³. Softwaretools¹⁶ worden gebruikt om kandidatenpeptiden en overgangen op te sommen die afkomstig zijn van myoglobines van belang. Elk referentiemyoglobine wordt onderworpen aan proteolyse en de resulterende peptiden worden geanalyseerd door vloeistofchromatografie elektrospray ionisatie tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS/MS) om te ontdekken welke van de kandidaat-precursor-ionen en overgangen het meest nuttig zijn en om de overeenkomende peptideretentietijden te bepalen. Het resultaat van deze fase is een herziene lijst van doelpeptiden met hun overgangen, geschikt voor

Protocol

1. Proteolyse en analyse of Reference Myoglobins

1. Proteolyse referentie myoglobins
   1. Worden de oplossingen van de gezuiverde referentie myoglobins (bereik 0,2-0,5 mg / ml in 25 mM ammoniumbicarbonaat) ^3.
   2. Breng 1 ml van elk monster 2 ml centrifugebuizen.
   3. Thermisch denatureren de geëxtraheerde eiwitten door verwarmen van het monster in een hete blok bij 95 ° C gedurende 30 minuten. Koel het monster gedurende ongeveer 15 minuten totdat het kamertemperatuur bereikt. Voeg 30 mg ureum (eindconcentratie 0,5 M) bij de vertering verbeteren, meng.
2. Tryptic proteolyse
   1. Maak een 1 mg / ml oplossing trypsine in 25 mM ammonium bicarbonaat en bewaar op ijs naar behoefte. Voeg een voldoende hoeveelheid trypsine zodat de uiteindelijke enzymactiviteit 420 BAEE (N-benzoyl-L-arginine-ethylester hydrochloride) eenheden / mg eiwit geëxtraheerd en meng door voorzichtig vortexen en laat overnacht bij 3 proteolyze7 ° C.
   2. Voer natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) ¹⁷ van de volledigheid van de proteolyse te tonen.
3. Ontzouten van de post-proteolyse sample
   1. Verdun het monster 1: 2 v: v met water.
   2. Activeren een polymere omgekeerde fase (RP) patroon gevuld met 30 mg RP materiaal door toevoeging van 1 ml methanol, vervolgens de cartridge evenwicht door toevoeging van 1 ml van 1% mierenzuur.
   3. Laad het monster op de cartridge onder zwaartekracht.
   4. Wassen met 1 ml van 5% methanol / 1% mierenzuur onder zwaartekracht.
   5. Elueer de peptiden met 1 ml acetonitril / water (90:10 v: v, 0,1% mierenzuur) onder zwaartekracht in 2 ml microcentrifugebuizen voorgevuld met 5 gl dimethylsulfoxide (DMSO).
   6. Verwijder het oplosmiddel onder vacuum bij 50 ° C onder toepassing van een centrifugale verdamper 120 minuten, vervolgens los het residu op in 250 ui acetonitril / water (3:97 v: v, 0,1% mierenzuur).
   7. Overdrachtde oplossing tot een klein volume autosampler flesje.
      Noot: De monsters kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C tot klaar voor chromatografie massaspectrometrie vloeistofanalyse (LC / MS).
4. Generatie van de overgang lijsten voor MRM
   1. Zoek de myoglobine sequenties voor de verschillende vleeswaren uit de UniProt database.
   2. Voer de myoglobine sequenties in het vak 'Target' van het peptide en de overgang voorspelling software (bv, Skyline). Indien nodig, de muisaanwijzer op een peptide om haar fragment lijst te openbaren.
   3. Klik op 'Instellingen' en selecteer 'Peptide Settings'. Voer de voorkeuren voor de vertering (dwz trypsine) en het aantal gemiste splitsingen (0). Gewenst selectie voor bijkomende parameters, in het bijzonder de lengte peptide (6-25), N-terminale uitsluitingen (0) en veronderstelden dat aminozuurmodificaties (geen).
   4. Klik op 'Instellingen' en selecteer 'Transition Settings'. Selecteer de voorkeur voorhet type apparaat gebruikt voor de LC / MS analyse.
   5. Klik op 'Export' en selecteer 'Overgang List' om een ​​spreadsheet met de gegenereerde MRM overgangen en parameters te creëren.
5. Analyse door LC / MS
   1. Het opzetten van een systeem van binaire gradiënt (water (A) en acetonitril (B), elk met 0,1% mierenzuur v: v) high performance liquid chromatografie (HPLC) met auto sampler, C18 kern shell HPLC-kolom (10 cm x 2,1 mm , 2,6 micrometer deeltjesgrootte) is verbonden met een triple quadrupool massaspectrometer gebruikt in positieve elektrospray mode met MRM detectie.
   2. In het verzamelen van gegevens software (bv Analyst), selecteer 'Bestand' en 'Nieuw' en klik op 'Acquisition Method' in het pop-up box en klik vervolgens op 'OK'.
      Opmerking: Dit opent het instrument-editor, die een lijst van de aangesloten apparaten die het opzetten van een nieuwe LC / MS methode in staat zal stellen bevat.
   3. Klik op 'Binary Pump' en input de debietwaarde (300 pl / min) en het verloop keer in de tabel, het instellen van een binaire gradiënt profiel van 3% B tot 30% B gedurende 22 min, oplopend tot 100% B in 23 min bij 5 minuten uitspoelen alvorens terug beginwaarden en opnieuw equilibreren gedurende nog eens 6 min.
   4. Klik op 'Autosampler' en steek de injectie volume (5 pi). Schakel de 'Needle Wash Cycle' en voer de 'Wash Time' (30 sec) en selecteer 'Flush Port'.
   5. Klik op 'gethermostateerd Column Controller' en in 'Column Oven Eigenschappen' zet de 'Links Temperatuur' en 'juiste temperatuur' (40 ° C).
   6. Klik op 'Mass Spectrometer' en vervolgens op 'Bewerken parameters' om de bron van gas voorwaarden in te voeren. Selecteer de 'Scan Type' als 'MRM (MRM)' en de 'polariteit' als 'positief'. Ga naar 'Period Samenvatting' en voer de 'Duration Time', de totale tijd voor de LC-analyse eend equilibratie (35 min).
   7. In de tabel klik met de rechtermuisknop en kies 'Declustering Potential (DP)' en 'Collision Energy (CP) om deze kolommen toe te voegen aan de tafel. Voer de Q1, Q3, Time (msec), ID, DP en CE-waarden voor alle overgangen, voor een enkele soort vlees, gemaakt in de overgang lijst (zie stap 1.4.5).
      Noot: Tijd (msec) verwijst naar de verblijftijd, het moment dat de massaspectrometer besteedt scannen elke overgang, de som die niet meer dan 3 seconden.
   8. Sla het Acquisition Method bestand (bestandsextensie .dam).
      Opmerking: Stappen 1.5.2 - 1.5.8 moet worden herhaald voor elk soort vlees. Dit zal een enkele methode bestand voor elke vlees soorten in schermmodus te creëren ter voorbereiding op onderstaande analyse.
   9. In het verzamelen van gegevens software, klik op 'Acquire' en selecteer 'evenwicht'. In het venster dat wordt geopend, selecteert de gewenste Acquisitie Methode om het instrument equilibratie beginnen.
   10. Leg het monster flacons in arack in de autosampler.
   11. Klik op 'Bestand' en selecteer 'Nieuw' en vervolgens 'Acquisition Batch'. In het tabblad 'Sample' te selecteren 'Add Set' en vervolgens 'Samples toevoegen'. Steek het aantal monsters worden geanalyseerd en klik op 'OK'. In de 'Acquisitie' selectievakje de methode-bestand dat zal worden gebruikt voor de analyse van het drop down menu.
   12. In de tabel, selecteer 'Plate Code' en kies de juiste lade configuratie uit het drop down menu. Klik met de linkermuisknop in de 'Plate Code' kolomkop dan klik met de rechtermuisknop en kies 'Fill Down'. In 'Vial Position' in te voeren van de positie van elk monster in de auto-sampler in de rijen.
   13. In 'Data File' voer de bestandsnaam voor de verwerving, dan links klik in de kolom header, gevolgd door klik met de rechtermuisknop en kies 'Fill Down'. In 'Sample Name' plaatst de identiteit van elk van de monsters worden geanalyseerd. Opslaan als een overname batch-bestand (file eXTension .dab).
   14. Klik op het tabblad 'Verzenden' licht dan de monsters die moeten worden geanalyseerd op de LC / MS. Klik op 'Verzenden'. Klik op 'Acquire' en 'Start Sample' om de analyse te beginnen.
       Opmerking: Elke acquisitiemethode scant de MRM overgangen over de gehele lengte van de chromatograaf voor een enkele soort vlees. Massaspectrometer instellingen voor een MRM overname is afhankelijk van het type instrument en peptide.
   15. Bekijk de gegenereerde data bestanden met behulp van data viewing software. Klik op XIC (gewonnen ionen) en in de drop down lijst van alle fragmenten (Q3 waarden) voor een enkele precursor (Q1) te markeren. Een nieuw venster zal openen dat toont alleen de geselecteerde overgangen.
   16. Noteer de retentietijd (R _t) voor groepen van gelijktijdige overgangen aangezien deze overeenkomen met een enkel peptide.
   17. Herhaal de vorige twee stappen voor elke set overgangen teneinde de pieken toewijzen aan de respectieve peptiden pervan de soorten vlees.
   18. Noteer de marker peptiden die geschikt zijn voor het verstrekken van soortidentificatie zijn (bijvoorbeeld peptide HPGDFGADAQGAMTK, voorloper m / z = 752, R _t = 12,0 min, voor paard), samen met hun retentietijden en noteren welke formulier overeenkomstige paren die geschikt zijn voor de relatieve kwantificatie .
       Noot: Bijvoorbeeld, het paard marker peptide (precursor m / z = 752) heeft een overeenkomstige peptide rundvlees, HPSDFGADAQAAMSK (precursor m / z = 767, _Rt = 13,2 min).
   19. Om een ​​dynamische methode die alle soorten van het vlees maken, in de gegevens bekijken software voor elke soort vlees beurt, opent de XIC overgang voor elke precursor (toegewezen aan een bepaald peptide in 1.5.8).
   20. Zoom in op de piek cluster op de geselecteerde retentietijd door met de linkermuisknop te klikken en de cursor te slepen onder het cluster. Identificeer de meest intense overgangen (door rechts te klikken op de piek label).
   21. de overgangen handmatig op te nemenen retentietijden in een spreadsheet.
   22. Om de parameters als een nieuwe dynamische methode op de LC / MS-software in te voeren, klikt u op 'Mass Spectrometer' en vervolgens op 'Bewerken parameters' om de bron van gas voorwaarden in te voeren. Selecteer de 'Scan Type' als 'MRM (MRM)' en de 'polariteit' als 'positief'.
   23. Ga naar 'Period Samenvatting' en voer de tijdsduur (ingesteld als de totale tijd voor de LC-analyse en verevening). In de tabel klik met de rechtermuisknop en kies 'Declustering Potential (DP)' en 'Collision Energy (CP) om deze kolommen toe te voegen aan de tafel.
       Opmerking: De kolom 'Time' verwijst nu naar de verwachte retentietijd (min) voor elke overgang.
   24. In de sectie 'Edit Parameters' van de LC / MS het verzamelen van gegevens software, controleer dan de 'Geplande MRM' box. Voer de Q1, Q3, Time (min), ID, DP en CE-waarden voor de overgangen gemaakt in de spreadsheet (1.5.21) en sla de Acquisition Method (file extensie .dam).
       Opmerking: Dit reduceert typisch het aantal MRM overgangen aan de 4 meest intense voor elk peptide en scans over de retentietijd venster voor elk peptide piek, waardoor verbeterde gevoeligheid en kwaliteit van de gegevens. Een "dynamische" methode is een 'begeleide retentietijd windowing' methode, ook wel plannen.

2. Voorbereiding en analyse van Calibration Samples

1. Winning van vlees mengsels
   1. Met behulp van vlees eerder bevroren vervolgens vermalen tot een poeder, voor te bereiden een reeks van vlees mengsels door weging respectieve hoeveelheden vlees (totale massa van ongeveer 300 mg) in 15 ml plastic centrifugebuizen.
   2. Voeg 4 ml extractiebuffer (0,15 M kaliumchloride + 0,15 M fosfaatbuffer bij pH 6,5). Vortex gedurende 30 sec. Extract op een lab shaker bij kamertemperatuur gedurende 2 uur bij 250 cycli / min.
      Opmerking: Cycles / min verwijst naar een oscillerende beweging.
   3. Transfer 2 ml van deextract in een 2 ml microcentrifugebuis. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 ° C bij 17.000 x g.
   4. Transfer 200 ul porties van de bovenstaande vloeistof (reserveren van een klein bedrag voor eiwitanalyse, zie 2.2) in 2 ml centrifugebuizen en droog met behulp van een centrifugale verdamper (pre-set programma: 50 ° C, zonder ventilatie en 120 min duur).
2. eiwitbepaling
   1. Overdracht 7 gl aliquots van de gereserveerde supernatant (zie 2.1.4) in drievoud in de putjes van een plaat met 96.
   2. Overdracht 7 ul aliquots reeks eiwitstandaarden in drievoud, 0 - 1,0 mg / ml runderserumalbumine (BSA) in dezelfde 96 putjes.
   3. Voeg 200 ul van Coomassie eiwit plus reagens aan elke well.
   4. Visuele vergelijking van de kleur van de monsterputjes met het eiwit normen controleren de monsters in het gebied van de kalibratiestandaarden. Indien nodig, herhaal met verdunde monster dus het wordt in range.
   5. Laat de plaat sten 3 min.
   6. Burst eventuele luchtbellen die zijn gevormd met een injectienaald.
   7. Analyseer de plaat op de plaatlezer gebruik van een standaard protocol eindpunt bij een golflengte van 595 nm.
   8. Bepaal de eiwitconcentratie van de monsters met behulp kalibratiegegevens van de proteïnestandaarden.
      Opmerking: Dit is nodig voor het berekenen van de hoeveelheid trypsine wordt gebruikt in het tryptische digest.
3. Proteolyse vlees mengsels
   1. Los het droge residu van stap 2.1.4 in 1 ml 25 mM ammonium bicarbonaat oplossing. Meng goed op een rotamixer.
   2. Volg het protocol van stap 1.1.3 naar 1.3.7.
4. Analyse door LC / MS
   1. Stel de LC / MS zoals eerder (stap 1.5.1).
   2. Een nieuwe aanwinst batch bovengenoemde punten (stappen 1.5.9 - 1.5.14), het selecteren van de overnamemethode gemaakt bij stap 1.5.24 dat een dynamische LC / MS methode combineren van al het vlees species gebruikt, en de gegevens te verkrijgen de Digested vleesmonsters.
   3. Toon de volledige chromatogram in de data viewing software. Geef het XIC voor elke set op zijn beurt de overgang. Bevestig visueel elke cluster bevat het vereiste aantal klokvormige pieken bij de verwachte retentietijd, waardoor het bestaan ​​van het geselecteerde peptide bevestigd.
   4. Voer kwantificatie met behulp van de gegevens bekijken van software om pieken te integreren voor elk van de overgangen van rente door te dubbelklikken op 'Build Kwantificering methode' in de navigatiebalk.
   5. In de 'Select Sample' pane selecteert u de 'Data File' en de 'Sample' te worden geanalyseerd om een ​​tafel 'Analytes' te genereren.
   6. Klik op het tabblad 'Integratie' om te laten zien de eerste van de overgangen (analyten) worden geïntegreerd.
   7. Klik op 'Analyt' vakje om de keuzelijst van overgangen weer te geven. Selecteer elke overgang op zijn beurt weer te geven en visueel te controleren of de juiste piek is geselecteerd voor de integratie. om mnog aangepast of kracht van de integratie, de linker muisknop en sleep de cursor over het doel piek (dit zal worden gemarkeerd in het groen). Klik op de 'Select Peak' knop en klik op 'Toepassen'.
   8. Sla de werkruimte als methode bestand (.qmf).
      Let op: Dit creëert een kwantificering methode bestand voor nacalculatie van het monster piek gebieden.
   9. Dubbelklik op 'Kwantificering Wizard' in de navigatiebalk. In het venster 'Select Samples' te creëren 'Kwantificering Set' door het selecteren van een single 'Data File' en vervolgens één of meer 'beschikbaar Samples'. Selecteer 'Next' om te laten zien 'Selecteer Instellingen en Query' box. Laat met standaardinstellingen, selecteert u 'Next' om 'Select Method' weer te geven. Uit het drop down 'Method' vak 'Integration Method' bestand gemaakt in stap 2.4.8 selecteren, selecteer vervolgens 'Finish'.
      Let op: Dit creëert een 'Resultaten Tabel', met inbegrip van de overgang piekoppervlakken die voortvloeien uit vlees mengsels.
   10. Save the 'Results Table' (bestandsextensie .rdb), exporteren als een tekstbestand (.txt) en open het in spreadsheet om de gegevens te bekijken.
   11. Plot grafieken van het percentage (van overgang piekoppervlak) van één vlees elkaar versus gemeten percentage (w / w) van de twee vlees voor de geselecteerde MRM voor geselecteerde overgangen van overeenkomstige peptiden, waarbij vooral de gevallen waarin de twee fragmenten bevatten hetzelfde aantal aminozuren zoals geteld vanaf het C-terminale uiteinde.
       Opmerking: Identieke fragmenten met identieke fragmentatie sites geven een optimaal resultaat.
   12. Onderzoek de percelen van 2.4.11 hierboven. Hetzij visueel, of met behulp van een trend line tool in het plotten pakket, identificeren van een groep van percelen die zowel lineaire en van dergelijke gradiënt zijn. Met één of meer van deze CPCP plus fragmentcombinaties kalibratie in real vleesmonsters.
       Opmerking: Een grafiek die een ongewone gradiënt kan ofwel peptide of fragment onderdrukking met als gevolg een vermindering van het signaal te geven strength. Niet-lineaire plots kan een slechte piek detectie of andere problemen aan te geven.

3. vleesmonsters

1. Extractie van eiwitten uit doel vleesmonsters
   1. Indien van toepassing, accijnzen vreemde niet-vlees materiaal uit het monster met behulp van een spatel. Bijvoorbeeld, schraap saus en pasta uit een gekoelde lasagne.
   2. Weeg 20 gram van het vlees in een metalen beker.
   3. Voeg 100 ml 0,15 M kaliumchloride / 0,15 M kalium-monofosfaat buffer bij pH 6,5.
   4. Extraheer de eiwitten door het mengen van het vlees in een homogeniseerinrichting met hoge snelheid gedurende 1 minuut.
   5. Volg het protocol uit stap 2.1.4 - 2.3.2.
2. Analyse van monsters met LC / MS
   1. Herhaal stap 2.4.2 om gegevens te verwerven met behulp van de dynamische LC / MS methode.
   2. Identificeer de peptiden uit elke vlees myoglobine zoals uitgevoerd in stap 2.4.3.
   3. Voor kwantificering, gebruiken kwantificering software om de piek gebieden te integreren voor elke overgang van belang,zoals in stap 2.4.9.
   4. Voor de identificatie van soorten in een mengsel, nemen deze marker peptiden voldoen overeengekomen criteria voor aantal overgangen en signaal-ruis voor deze overgangen.
   5. Voor kwantificering Gebruik geïntegreerde overgang piek gebieden zoals overeengekomen vanaf stap 2.4.12 en, met behulp van het percentage van de overgang piekoppervlak, bereken het percentage van myoglobine van de twee soorten in het mengsel.
   6. Gebruik voorkennis uit de literatuur ¹⁸ van waarschijnlijke myoglobinespiegels in het vlees om de relatieve w / w hoeveelheden twee vlees in het monster te schatten.

Resultaten

In een enkele dynamische modus MRM experiment wordt elk geprogrammeerd overgang apart geregistreerd (als detector tellingen per seconde, CPS) over een bepaalde retentietijd venster. Daarom is vanuit alle gegevens die zijn verzameld in een experiment, de piek intensiteit voor elke overgang kan individueel worden onttrokken. Dan is de enige eindige signaal voor de retentietijd venster in te stellen voor die overgang. Buiten het raam, de nul is per definitie. Het signaal voor één overgangsmetaal, bijvoorbeeld 752 → 1269 van paarden (peptide mono-isotopische massa 1,501.66 dalton, precursorion m / z 751,84 dalton, laadtoestand = 2, fragmention y ¹³⁾ heeft meestal alleen concurreren met metingsruis en niet de andere overgang pieken die misschien blijken uit andere species. De output is dan ook een set van schone pieken, één per overgang, tot een gemeenschappelijke retentietijd voor die overgangen met een gemeenschappelijke precursor ion.

Figuur 1 toont de output voor de set van vier transities 752 → (1269, 706, 248, 1366) voor een mengsel van 1% w / w paard in rundvlees. Aangezien de vier transities getoond geassocieerd met paard en afwezig in monsters van pure rund, lam of varkensvlees, deze pieken betekent de aanwezigheid van het paard. Afhankelijk van de robuustheid criteria, een set van twee of meer overgangen elk meer dan sommige specifieke signaal-ruis niveau vaststelt identificatie. Deze figuur maakt aldus de aanwezigheid van het paard in het mengsel van 1% w / w paard rundvlees.

Soms wordt een enkele geïsoleerde transitie gedetecteerd. Dit geeft kans spel precursorion en één fragment, misschien van een vreemde eiwit met de verwachte uit het systeem en geprogrammeerd in de massaspectrometer. De bijzondere aard van de piek en het optreden van een onverwachte retentietijd is de signature van een toevallige overgang die kunnen worden genegeerd.

Het gebied onder elke overgang piek kan afzonderlijk worden berekend. Op basis van een geschikt fragment, de verhouding paard rundvlees overgang piekoppervlakken bijvoorbeeld 752 → 1269 (paard) tot 767 → 1299 (rund), evenredig met de verhouding tussen werkelijke vlees in het mengsel. Figuur 2 toont een plot van percentage piekoppervlak voor deze twee overgangen versus het percentage van gewicht van het paard in een mengsel van paard met rundvlees. Indien deze overgang piekoppervlakken overeenkomt met de procentuele gewichtsbasis vlees dan de helling 1. De helling van deze grafiek is 1,03, wat aangeeft dat deze overgangen en CPCP paar, de overgang pieken te geven een betrouwbare maat voor de relatieve hoeveelheden van de twee vlees in het mengsel. Als de paardenvlees in het monster was tweemaal zo rijk aan myoglobine als rundvlees dan met andere factoren gelijk, de helling van de lijn zou groter dan één zijn.

Figuur 1. MRM overgang intensiteiten versus retentietijd voor 1% w / w paard in rundvlees. De overgangen zijn 752 → (1269, 706, 248, 1366), getoond in oranje, zwart, blauw en groen, respectievelijk. De marker peptide is HPGDFGADAQGAMTK. De vier fragmenten overgang kan worden aangegeven met y ^{13, 7} y, y y ² en ^14, respectievelijk, waarbij ^yn zit je tellen in n aminozuren van het peptide C-terminale uiteinde. De signaalruisverhouding varieert 23-53 via vier transities. Een extra rode lijn geeft de 752 → 1.269 overgang voor 0% paard, 100% rundvlees ter vergelijking. Alleen de niet-nul regio van de retentietijd wordt weergegeven. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Watson et al. ^3.es / ftp_upload / 54420 / 54420fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Perceel van paard in rundvlees, als percentage gewicht voor gewicht, versus paard in rundvlees als percentage overgang piek omgeving. Het perceel maakt gebruik van het paar van peptiden rundvlees (767) en paard (752) en de y ¹³ fragment ion voor beide. Als A betekent piekoppervlak dan de ordinaat 100 A _H / (A + _H A _B). De helling van de best passende lijn (R ² = 0,99) is 1,03. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Watson et al. ^3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De keuze van een geschikt doelwit eiwit is belangrijk. Een goede doeleiwit moet overeenkomstige vormen in species van belang, voldoende species-afhankelijke sequentie variatie, species specificiteit hebben en bestaan ​​in toegankelijke hoeveelheden binnen de organismen. Voor controle mengsels die veredeld (bijvoorbeeld warmtebehandeling), een eiwit met een sequentie relatief immuun voor dat de verwerking gewenst. Myoglobine is een goede kandidaat voor rood vlees, zoals gekookte rood vlees, maar is niet de enige mogelijkheid. Zodra het doeleiwit wordt besloten het meest kritische deel van het protocol is het eiwit proteolyse. Een eiwit verschillend van myoglobine misschien wel vragen om een ​​alternatief proteolyse protocol.

Het protocol zoals beschreven omvat een segment gebaseerd op verwijzing gezuiverde eiwit. Dit heeft tot doel retentietijd ramen en geschikte precursor en fragment-ionen te ontdekken. Dit segment is zeer nuttig, maar niet essentieel.

Hoewel overeenkomstige peptide paren van twee van belang zijnde species kan worden toegevoegd, zelfs zonder experiment is het soms zo dat een sequentieverschil heeft dramatische gevolgen voor de vertering profiel. Bijvoorbeeld het peptide pair VLGFHG (rundvlees) en ELGFQG (paard) geven een afwijkend resultaat kwantificering (manifesteren als een helling kleiner dan in figuur 2). Dit komt doordat deze peptide ontstaat uit een relatief onderdrukt KE splitsing leidt tot een onderschatting van het niveau van het paard in het mengsel. Overeenkomstige peptiden beginnend met verschillende aminozuren worden daarom best vermeden. Vaak zijn de fragmenten uit twee overeenkomstige peptiden identieke aminozuursequenties en zijn goed gedragen, maar dit is niet altijd het geval en moet tijdens methodenontwikkeling te controleren. Soortidentificatie is veel minder gevoelig voor deze problemen dan kwantificatie.

Het protocol is aangetoond voor vier rood vleess ^3. Extra vlees soorten kunnen worden opgenomen, hoewel de kwaliteit van de transitie vorm van de piek als er te veel marker peptiden co-elueren verslechteren en de verblijftijd effectieve vermindering en uiteindelijk degraderen relatieve kwantificatie schattingen. Verbeterde instrumentatie, al beschikbaar is, zal dit verbeteren. Een verwant probleem is dat niet alle vlees verschillende myoglobins. Bijvoorbeeld, paard, ezel en zebra myoglobins zijn identiek en dus strikt genomen de methode is alleen voor het opsporen van het paard of ezel of zebra in rundvlees. In sommige gevallen, hoewel myoglobins niet identiek, een aantal belangrijke peptides zijn. Bijvoorbeeld, sommige lam myoglobinehoudende afgeleid marker peptiden ook in geit.

Een complicatie tegenover deze en andere op eiwit gebaseerde kwantificatie methode is dat het eiwitgehalte constant voor alle soorten moeten worden aangenomen, wanneer het proteïne of peptide hoeveelheden moeten trivially gelijk aan niveaus van vlees in een mengsel. Voor myoglobine en de vier rode meet, dit is niet universeel waar. De niveaus in het algemeen soorten afhankelijk zijn, met varkensvlees vertoont het laagste niveau van de vier. Bovendien, het myoglobine varieert met vleesdeel en dierlijke leeftijd. Dus hoewel verhoudingen van overgang piekoppervlakken kaart betrouwbare verhoudingen myoglobine, kartering verhouding van werkelijke vlees een schatting trekken op veronderstellingen omtrent waarschijnlijke bronnen van het vlees in het mengsel.

De aanpak die in dit werk verschilt in een aantal opzichten van andere gepubliceerde bijdragen. Een typisch traject is proteomics methoden om verschillende ongelijksoortige soortafhankelijke marker peptiden, waarbij de merkers voor verschillende soorten bezitten willekeurige onderlinge betrekkingen ^8-12,14,19 identificeren. Daarentegen hebben we eiwitten voor alle soorten van belang gekozen tot species-afhankelijke sequentievarianten ^3. Behalve dat centraal aan de relatieve kwantificatie strategie heeft dit het voordeel dat monsterbereiding strategieën kunnen worden geoptimaliseerd. Bovendien zou een dergelijke overeenkomstige eiwitten naar verwachting eveneens gedragen, bijvoorbeeld in extractie of commerciële verwerking van monsters zoals koken of inblikken. Soortidentificatie dan normaal verloopt via detectie van ongelijksoortige marker peptiden, terwijl in de CPCP aanpak soort identificatie verloopt via de detectie van nauw verwante peptiden bezitten meestal een of twee sequentie verschillen. Tenslotte kwantificering van eiwitten aan het percentage schatten gewichtsdelen van een soort in elkaar kunnen verlopen via conventionele absolute kwantificering van elk eiwit afzonderlijk op basis van bekende standaarden ^7,14,15. Echter met de CPCP methode behoeft kalibratie werkwijzen. In plaats daarvan worden de relatieve niveaus geschat door de signaalsterkte van twee overeenkomstige peptiden van de twee soorten, het omzeilen van de absolute meting fase geheel. Aangezien het uiteindelijke doel is een percentage van het gewicht van één soort in another, een relatieve kwantificering, dan is de CPCP is zowel directer en eenvoudiger dan het vergelijken van twee absolute kwantificering metingen. Deze kenmerken vertalen in experimentele korte tijd, naar verwachting ongeveer twee uur met geraffineerde protocollen, waardoor de techniek bruikbaar als een snelle toezichthulpmiddel op het gebied van voedsel detectie van fraude.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Uniprot database	www.uniprot.org		Vrij toegankelijke database van eiwitsequenties
Skyline software	www.skyline.gs.washington.edu		Gratis software om te downloaden die de creatie van gerichte methoden voor proteomische studies, peptide- en fragmentvoorspelling mogelijk maakt
Ammoniumbicarbonaat	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com	O9830
Methanol, HPLC-kwaliteit	Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk	10674922
Acetonitril, HPLC-kwaliteit	Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk	10010010
Urea	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com	U5378
Trypsine (van runderpancreas behandeld met TPCK)	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com	T1426
Mierenzuur	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com	F0507
Coomassie Plus Eiwit Assay Reagens	Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com	1856210
Eiwitstandaard	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com	P0914
Ultra Turrax homogenisator T25	Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk	13190693
Edmund en Buhler KS10 lab shaker
Heraeus Fresco 17 Centrifuge	Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com	75002420
Vacuum centrifuge RC 1022	Jouan
Plate Reader
Strata-X 33u polymere omgekeerde fase cartridges 60 mg/3 ml buizen	Phenomenex, Macclesfield, UK	8B-S100-UBJ
4000 QTrap triple-quadrupool massaspectrometer	AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com
1200 rapid resolution LC systeem	Agilent, Stockport, UK
XB C18 omgekeerde fase capillaire kolom (100 mm x 2,1 mm, 2,6 µm deeltjesgrootte)	Phenomenex, Macclesfield, UK www.phenomenex.com
Analyst 1.6.2 software	AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com		QTrap dataverzameling en analyse, inclusief piekgebiedintegratie
Autosampler vials