Zebravissen zijn een uitstekend model om spierfunctie en ziekte te bestuderen. Tijdens de vroege embryogenese beginnen zebravissen met regelmatige spiercontracties die een ritmisch zwemgedrag produceren, dat verandert wanneer de spier wordt verstoord. Hier beschrijven we een door aanraking veroorzaakte reactie en een locatiemeting om zwemprestaties te onderzoeken als maatstaf voor spierfunctie.
Methodenartikel
Met behulp van Touch-opgeroepen Response en Locomotion Testen om Muscle Prestaties en functie in zebravis Assess
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zebravis spierontwikkeling is sterk geconserveerd met zoogdier-systemen waardoor ze een uitstekend model om de spierfunctie en ziekte te bestuderen. Veel myopathieën beïnvloeden skeletspieren functie kan snel en eenvoudig worden beoordeeld in de zebravis gedurende de eerste paar dagen van de embryogenese. Door 24 uur na de bevruchting (HPF), wildtype zebravis spontaan samentrekken hun staart spieren en met 48 HPF, zebravis vertonen gecontroleerde zwemmen gedrag. Lagere frequentie van, of andere wijzigingen in kunnen deze bewegingen een skeletspier disfunctie geven. Zwemmen gedrag te analyseren en spier prestaties te beoordelen in de vroege ontwikkeling van de zebravis, maken we gebruik van zowel keer opgeroepen escape reactie en motoriek testen.
-Touch opgewekte ontsnapping respons assays kunnen worden gebruikt om de spier prestaties tijdens korte uitbarsting bewegingen als gevolg van inkrimping van de fast-twitch spiervezels te beoordelen. In reactie op een externe stimulus, die in dit geval is een tik ophet hoofd, wildkleur zebravis op 2 dagen na de bevruchting (DPF) vertonen typisch een krachtige uitbarsting zwemmen, begeleid door scherpe bochten. Onze methode kwantificeert skeletspierfunctie door meting van de maximale versnelling tijdens een burst zwembeweging, de versnelling die recht evenredig met de kracht die door spiercontractie.
In tegenstelling, zijn motoriek testen tijdens de vroege zebravis larvale ontwikkeling gebruikt om de spier prestaties te beoordelen tijdens langdurige periodes van spieractiviteit. Met een tracking systeem zwemgedrag volgen, verkrijgen wij een geautomatiseerde berekening van de frequentie van de activiteit en afstand in 6 dagen oude zebravis, reflecterende hun skeletspierfunctie. Metingen van het zwemmen uitvoering zijn waardevol voor fenotypische beoordeling van ziektemodellen en high-throughput screening van mutaties of chemische behandelingen beïnvloeden skeletspierfunctie.
Inleiding
In het afgelopen decennium zebravis zijn steeds meer gebruikt om spieren celbiologie en ziekte te bestuderen. De snelle ontwikkeling van de externe zebravis embryo, in combinatie met de optische helderheid, kan de directe visualisatie van de spier vorming, groei en functie. Het proces van spierontwikkeling is sterk geconserveerd in zebravis en dit heeft de succesvolle modellering van diverse spierziekten zoals spierdystrofie en congenitale myopathieën 1-8 toegestaan. Gedetailleerd onderzoek van de zebravis modellen niet alleen voorzien van nieuwe inzichten in de pathobiologie van deze voorwaarden, maar ook een platform voor het testen van geschikte therapieën 6,9-13.
De analyse van de zebravis modellen van spierziekten is gebaseerd op betrouwbare en reproduceerbare assays om spieren te meten. Eerdere studies zijn erin geslaagd de kracht genererende vermogen van de zebravis Rompspieractiviteit in vis tussen 3 en 7 DPF doorhet elektrisch stimuleren contractie van stilstaande vis bevestigd aan een kracht transductiesysteem 14. Dit kan gedetailleerde metingen van kracht verschaffen maar zijn niet ideaal voor hogere doorvoer experimenten en er voordelen aan het meten spierprestaties tijdens het zwemmen. Op 2 DPF zebravis spier is volledig functioneel en de vis kan burst zwembewegingen wekken in reactie op prikkels. Het aanraakgevoelige roepen escape response test wordt gebruikt om acceleratie tijdens een burst zwembeweging, die kan worden gebruikt als een maat van de contractiekracht.
Een van de meest gebruikte maatregelen van spierfunctie in myopathie patiënten de 6 minuten looptest, die registreert de totale afstand gelopen op een hard vlak oppervlak 15,16. We hebben een vergelijkbare test om spierfunctie te meten toegepast in 6 DPF zebravis larven, waarbij we toezicht op de totale afstand gezwommen, en het totale aantal bewegingen van elke larve gedurende een periode van 10 min. Dit gebeurtbehulp van een geautomatiseerd volgsysteem, dat betrouwbaar en zeer snelle metingen van spierprestaties bepaalt. Beide spiertests zijn zeer reproduceerbaar en zijn gebruikt om verschillen in spierprestaties in zebravis myopathie modellen 8 kwantificeren.
Protocol
1.-Touch opgeroepen Response Assay
- Bereiding van 2 DPF embryo's voor-Touch opgeroepen Response Assay
- Zorg ervoor dat de tijd van de dag waarop de test is uitgevoerd in overeenstemming is tussen de experimenten, omdat de activiteit dramatisch gedurende de dag 17,18 kan variëren.
Opmerking: Het experiment moet worden uitgevoerd verblind en de volgorde van het testen gerandomiseerd experimentele artefacten te minimaliseren. - Wijs de vis stammen een nummer dat onbekend is aan de individuele uitvoering van het experiment. Vervolgens via vrij beschikbare online tools genereren willekeurige lijst die de volgorde van het testen dicteert.
- Ten minste een uur voorafgaand aan de test, dechorionate embryo's door scheuren een gat in de chorion en voorzichtig het chorion los te trekken met een paar fijne pincet. Verwijder eventueel vuil uit de petrischaal alvorens terug te keren naar de 28 ° C incubator.
- Zorg ervoor dat de tijd van de dag waarop de test is uitgevoerd in overeenstemming is tussen de experimenten, omdat de activiteit dramatisch gedurende de dag 17,18 kan variëren.
- Het uitvoeren-Touch opgeroepen Response Assay
- Heat stage tot 28 ° C ten minste 15 minuten voor het begin van de test.
LET OP: Deze fase wordt de temperatuur gecontroleerd en zal op 28 blijven ° C voor de duur van de test. Temperatuur activiteit beïnvloeden en daarom is het belangrijk om een constante temperatuur te handhaven. Als een verwarmde stadium niet beschikbaar is, moet de temperatuur van het water worden bewaakt en alle experimenten moeten bij dezelfde temperatuur uitgevoerd. - Plaats een petrischaal gevuld met embryo medium (5 mM NaCl, 0.17mm KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 in water) op een verlicht podium en monteer de high-speed camera over de petrischaal.
- Start de video-camera-opname software (zoals stroom Pix 5, hier beschreven) en onder het tabblad "workspace" te selecteren 1000 frames per seconde (1000 fps) als de opnamesnelheid om dat snel zwemmen werking van de vis wordt opgenomen waarborgen.
- Werken met één embryo per keer, plaats het embryo in midle van de petrischaal met de zebravis duidelijk zichtbaar in het zichtveld.
LET OP: Als het embryo zwemt weg voor aanvang van het experiment vervangen door een ander, als heroveren en positionering van het embryo kan resulteren in deze steeds ongevoelig voor de stimulus en herhaalde uitbarsting reacties kunnen spierzwakte in een aantal ziektemodellen te promoten. - Begin met opnemen door te klikken op de "record" knop en leveren de mechanosensorische stimulans voor het embryo door zachtjes aan te raken met een stompe naald op de bovenkant van het hoofd.
- Stop de opname na het embryo uit het gezichtsveld heeft gezwommen of teruggekeerd naar rust.
LET OP: De versnelling pieken binnen de eerste 0,2 sec van de burst ontsnapping respons na de mechanische stimulus. Daarom zorgen dat ten minste gedurende de eerste 0,2 seconden van de escape response opnemen van de vis in het gezichtsveld. Gebruik van de software in stap 1.2.3 beschreven, worden de gegevens automatisch opgeslagenals .avi videobestand. Alternatieve video capture software zoals Free Video Capture of Softonic, die beide zijn vrij beschikbaar om te downloaden, kunnen ook worden gebruikt. - Breng de embryo naar een nieuwe petrischaal en selecteer een andere embryo voor het testen. Voer testen op een minimum van 15 vissen.
- Heat stage tot 28 ° C ten minste 15 minuten voor het begin van de test.
- Kwantificering van het Zwemmen Behavior
- Om het zwembad gedrag te kwantificeren, start de software en selecteer de "Single Larven Locomotion zonder achtergrond aftrekken" module om de opgeslagen .avi video-bestand te openen.
- Met behulp van de "vrije hand" of "veelhoek" tool in de menubalk stalling van de film moet worden gebruikt voor de analyse. Zorg ervoor dat het gebied omvat zowel de oorspronkelijke positie van de vis en het gebied dat de vis zal zwemmen in. Zorg ervoor dat de sonde wordt uitgesloten van het gebied dat moet worden geanalyseerd. De software automatisch volgen de baan van de vis in het gewenste gebied.
- Om t te voerenHij analyse, klik op "experiment" in de menubalk en selecteer "uitvoeren". Wanneer u wordt gevraagd op te slaan van de ruwe data-analyse file (.phr formaat) op de gewenste plaats. Eenmaal opgeslagen, klik op "start" om de analyse te beginnen. Einde van de analyse door te klikken op "stop" in het "experiment" drop down menu. Een venster met de resultaten worden weergegeven.
- Scroll naar rechts om de "maximale versnelling" waarde te verkrijgen. Indien gewenst, exporteren van deze gegevens door het sluiten van het raam resultaten en te klikken op de "export onmiddellijke resultaten" knop onder de "resultaten" drop-down menu. Selecteer de juiste ruwe data-analyse en klik op open. Een tekstbestand dat kan worden geopend in een spreadsheet programma zal in de doelmap worden opgeslagen.
- Herhaal deze procedure voor elke vis en gemiddeld om de gemiddelde maximale versnelling voor elke stam te verkrijgen (zie figuur 1).
Opmerking: Als alternatief voor using de software beschreven dergelijke verpakkingsmiddelen zoals de vrij beschikbare ImageJ software kan worden gebruikt om de relevante gegevens te extraheren beweging. De 3D Particle Tracker plugin kan worden gebruikt om te zwemmen trajecten volgen.
2. Locomotion Assay - 10-min Swim Test
- Bereiding van 6 DPF embryo's voor zwemmen Analyse
- Desgewenst soort embryo gedurende de vereiste genotype, bijvoorbeeld door het onderzoeken van expressie van een fluorescerend eiwit of fenotype, en plaats in een afzonderlijke petrischaal (25-30 embryo's per plaat). Als alternatief kan het genotype bepaald worden na voltooiing van de motoriek test.
- Op 3 DPF, opnieuw te onderzoeken petrischaaltjes en verwijder unhatched embryo's en puin. Terug petrischaaltjes tot 28 ° C incubator tot 6 dpf.
- Voer testen van alle stammen 9:00-12:00, dat het tijdstip waarop zebravis larven zijn het meest actief. Willekeurig de volgorde van het testen en positie in de peind van wildtype en mutante monsters naar de effecten van circadiane verschillen en andere experimentele vertekening te minimaliseren.
Opmerking: Het is belangrijk dat de testtijd consistent tussen experimenten omdat activiteit dramatisch gedurende de dag variëren. - Minstens 30 minuten voorafgaand aan de test, plaats larven in een 48-wells plaat met één larve per putje. Na overdracht, vul de putjes zodat het water net onder de top van de put, zodat er geen luchtbellen. Platen terug naar 28 ° C incubator.
- Neem de platen uit de incubator en acclimatiseren in het licht voor vijf minuten voorafgaand aan het testen.
- Het uitvoeren van Locomotion Assay
- Plaats de 48-wells plaat in de opname kamer, die is uitgerust met een infrarood camera, vastleggen tot 60 frames / sec, waardoor larven in het donker kan worden gedetecteerd. Controleer of alle putjes in de cirkelnet geplaatst de voortbeweging software en dat alle larven clearly detecteerbaar.
- Start de software en selecteer de "volgen" module. Onder "file" klik op "het genereren van nieuwe protocol" en het aantal putten worden gebruikt voor het experiment te bewerken. Stel zowel de duur van het experiment en de integratie periode tot en met 10 min door te klikken op de "parameters" drop down menu en het selecteren van de "protocol parameters" en vervolgens op het tabblad "tijd". Op dezelfde 'protocol parameters "dialoogvenster klikt u op het tabblad" opties "en zorgen voor de checkbox" Numeriscope "wordt geklikt, waarna de' protocol parameters" dialoogvenster kan worden gesloten.
- Voor het instellen van de opname gebieden te markeren het hele net en dubbelklik op een van de putten. Klik op de "tekenen gebieden" knop en trekken rond de top links, boven rechts en links onder putten en klik op "bouwen", die het mogelijk maakt de software om de positie van elk automatisch te bepalen goed. Ook trekken in een schaalbar en klik op "van toepassing op de groep". Eenmaal voltooid, klikt u op de "tekenen gebieden" knop.
- Visueel bepalen de detectiedrempel door er met de "detectiegrens" bar tot een niveau waarbij alleen de vis bewegingen worden gemarkeerd zonder achtergrondsignalen.
OPMERKING: De detectiedrempel varieert tussen stammen en zo de drempel te bepalen wanneer een nieuwe stam getest. In de representatieve gegevens presenteerde een detectiedrempel van 25 mm / sec werd gebruikt. - Voordat u begint met het testen in te voeren beweging drempels voor de detectie van inactiviteit, en kleine en grote bewegingen.
LET OP: In de representatieve gegevens presenteerde een inactiviteit drempel van 6 mm / sec en een activiteit uitbarsting drempel van 30 mm / sec werd gebruikt. De drempels bepalen de minimale beweging actief te worden beschouwd en het vereiste niveau burst activiteit worden beschouwd en laat de indeling van de activiteit in kleine (actief, maar hieronder uitbarsting activity drempels) en grote (groter dan de burst activiteit drempel) bewegingen. De drempelwaarden kunnen worden gewijzigd afhankelijk van de activiteit van de bepaalde vis stammen geanalyseerd.
LET OP: Hoewel de test kan worden uitgevoerd in zowel lichte of donkere omstandigheden, hebben de zebravis larven is aangetoond dat meer actief te zijn in het donker 18. - Stel de lichtintensiteit in de kamer te zijn bij 0% door te klikken op de knop "light rij-instellingen" onder de "parameters" drop down menu. Op het resulterende dialoogvenster, voegt u de benodigde licht instellingen.
LET OP: De lichtintensiteit binnen de kamer kan worden geactiveerd om in- en uit te schakelen tijdens het testen tijd om larvale activiteit te stimuleren - Sluit de deur van de opname kamer en start video-opname.
- Kwantificering van het Zwemmen Behavior
- Na het experiment is voltooid, klik op "stop" in het "experiment" drop down menu. Een dialoog box met alle resultaten worden weergegeven.
- Om "te openen met folder" toegang tot deze resultaten in excel klik en het Excel-bestand dat in de resulterende map verschijnt openen. De belangrijkste parameters zijn "smlct" (kleine beweging count), "larct" (grote beweging count), "smldist" (totale afstand die de vis in kleine bewegingen) en "lardist" (totale afstand die de vis in grote bewegingen ).
NB: Na de opname, de software geeft ook twee extra output-bestanden in de vorm van een AVI-bestand (met een video van de 10 min opname) en een afbeelding .png bestand (met een visuele weergave van de motoriek tijdens de 10- min experiment, zie figuur 2). - Zodra de motoriek waarden worden berekend, speel de .avi en .png-bestanden om te beoordelen of de motoriek waarden nauwkeurig berekend verbeelden de zwembewegingen van de vis (zie figuur3).
Opmerking: Als alternatief voor de software beschreven, kunnen pakketten zoals de vrij beschikbare ImageJ software worden gebruikt om het motorisch gedrag volgen.
Resultaten
Contact opgewekte reacties test kan worden gebruikt om de snelheid en versnelling van zwembewegingen die disproportioneel van spierkracht bepalen. In antwoord op een mechanische stimulus, zoals een klein tikje op de kop 2 dpf wild type zebravis vertonen een snelle zwemmen actie. 's Werden opgevangen en geanalyseerd op twee verschillende zebravis myopathie modellen: Tg (ACTA1 D286G -eGFP), een model van Nemaline myopathie is aangetoond dat aanzienlijke spierzwakte en een model van Duchenne spierdystrofie waarin ernstige spier defecten zijn beschreven 5 dpf 19,20. Beelden uit een video van een karakteristiek vleugje opgeroepen test zijn weergegeven in figuur 1A. Versnelling van de zebravis werd onderzocht en vastgesteld dat de piek in de eerste 0,2 sec van de burst zwemmen ontsnapping respons (Figuur 1B). Deze piek maximale acceleratie een maat die evenredig is met de kracht generating capaciteit van de skeletspier. De maximale versnelling waarden werden gemiddeld om een gemiddelde maximale versnellingswaarde (± standaardfout van het gemiddelde) voor elke stam verkregen: Tg (ACTA1 D286G -eGFP): gemiddelde = 276,0 ± 28,8 m / s 2, n = 3 onafhankelijke replicaatexperimenten omvattende 15 exemplaren; wildkleur controle: gemiddelde = 500,8 ± 50,28 m / s 2, n = 3 onafhankelijke repliceren experimenten bestaande uit 15 exemplaren; dmd PC2 - / - mutant: gemiddelde = 249,9 ± 19,1 m / sec 2, n = 3 onafhankelijke repliceren experimenten omvattende 12-19 exemplaren; dmd PC2 +/- heterozygoten: gemiddelde = 235,9 ± 8,7 m / s 2, n = 3 onafhankelijke repliceren experimenten omvattende 16-27 exemplaren; DMD PC2 + / + wildtype homozygotes: gemiddelde = 230,9 ± 8,7 m / s 2, n = 3 onafhankelijke repliceren experimenten bestaande uit 8-27 afzonderlijke vissen (figuur 1C). Zoals verwacht, de Tg (ACTA1 D286G -eGFP) vis bleken een significante daling van de maximale acceleratie, geeft de verminderde spierfunctie, die in overeenstemming is met de muis modellen en patiëntgegevens 8,21,22 hebben. DMD PC2 - / - mutante vis toonde echter geen verschil in maximale acceleratie op 2 dpf, in overeenstemming met de detectie van defecten spier van 3 dpf 20 (figuur 1D).
Voortbeweging assays werden uitgevoerd bij 6 dpf de activiteit en afstand gezwommen door zebravis stammen bepaald als een indicatie van spierprestaties. Na het testen, een schematische weergave van de zwembewegingen over de tien minuten testperiode werd gegenereerd, met rode en groene lijnen respectievelijk vertegenwoordigen perioden van langzame en snelle bewegingen en zwarte lijnen die perioden van inactiviteit (figuur 2). Individuele wildkleur zebravis vertonen een hoge activiteit met een relatief zonder periodes van inactiviteit als opposed te Tg (ACTA1 D286G -eGFP) vis, die minder actief waren in de testperiode (Figuur 2B) zijn.
The swimming gedrag werd gekwantificeerd door het gemiddelde van de afzonderlijke waarden van het aantal bewegingen en de afstand gezwommen door elke vis (figuur 3). Zowel Tg (ACTA1 D286G -eGFP) vis (figuur 3A en 3B) en DMD PC2 - / - mutante vis (Figuur 3C en 3D) bleken een significante toename van het gemiddelde aantal bewegingen en afstanden gezwommen vergelijking met hun respectieve controls: Tg (ACTA1 D286G -eGFP) vis: gemiddeld aantal bewegingen = 94,3 ± 13,6, betekent afstand gezwommen = 112,9 ± 18,4 mm, n = 3 onafhankelijke repliceren experimenten bestaande uit 45 vissen; wild type controles: gemiddeld aantal bewegingen = 177,4 ± 14,0, betekent afstand gezwommen = 300,2 ± 22,8 mm, n = 3 onafhankelijke replicate experimenten bestaande uit 45 vissen; dmd PC2 - / - mutant: gemiddeld aantal bewegingen = 163,3 ± 30,0, betekent afstand gezwommen: 298,4 ± 60,37 mm, n = 3 onafhankelijke repliceren experimenten omvat 12-20 vis; dmd PC2 +/- heterozygoten: gemiddelde aantal bewegingen = 362,3 ± 38,8, betekent afstand gezwommen: 660,3 ± 86.1mm n = 3 onafhankelijke repliceren experimenten omvat 17-27 vis; DMD PC2 + / + wildtype homozygotes: gemiddeld aantal bewegingen = 341,9 ± 91,6, betekent afstand gezwommen = 574,3 ± 170.9mm n = 3 onafhankelijke repliceren experimenten bestaande uit 8-25 vis.
Figuur 1:. Kwantificering van touch-roepen respons test voor 2 DPF zebravis embryo's (A) Momentopname beelden van een controle zebravis tijdens touch-oproepen assays op 2 dpf. (B) Profiel versnelling voor de eerste 0,2 seconden van eenenkele Tg (ACTA1 D286G -eGFP) (rood) en enkele controle (blauw) zebravis na het aanbrengen van het touch stimulus. De maximale versnelling wordt weergegeven door de stippellijnen. (C, D) Kwantificering van de maximale versnelling (m / sec2) opgenomen met keer opgewekte reacties testen van (C) Tg (ACTA1 D286G -eGFP) en zebravis (D) DMD PC2 - / - mutant vis in vergelijking met zebravis controle op 2 dpf. Error bars vertegenwoordigt ± SEM voor 3 repliceren experimenten, * p <0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Vertegenwoordiging van beweging assays voor zebravis embryo (A) Zebravis embryo's in 48-well platen geplaatst en voortbeweging wordt met behulp van boven via een infrarood camera. (B) Schematische voorstelling van de zebravis beweging tijdens de testperiode met rode lijnen beeltenis van snelle bewegingen, groene lijnen beeltenis van langzame bewegingen en zwarte lijnen beeltenis van inactiviteit (zoals bepaald door de detectie drempels in de software ingevoerd). Klik hier om een grotere versie te bekijken dit figuur.
Figuur 3:. Kwantificering van voortbeweging assays voor 6 DPF zebravis larven kwantificering van de (A) aantal bewegingen en (B) afgelegde afstand van Tg (ACTA1 D286G -eGFP) zebravis vergeleken met zebravis controle op 6 dpf.Kwantificering van de (C) aantal bewegingen en (D) afstand die DMD PC2 - / - mutant vis tegenover zebravis controle op 6 dpf. Error bars vertegenwoordigt ± SEM voor 3 repliceren experimenten, * p <0,05, ** p <0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussie
Veel verschillende diermodellen zoals muizen, honden, zebravis, vliegen en wormen hebben bijgedragen aan ons begrip van de genetische en moleculaire basis van spierziekten en geholpen bij de ontwikkeling van therapeutische benaderingen te bestrijden. De zebravis biedt een aantal voordelen bij de bestudering van spierziekte. De zebravis biedt een genetisch manipuleerbaar systeem complexe patronen spier beoordelen in een geschikte fysiologische omgeving, die in vitro kweeksystemen onmogelijk is. In tegenstelling tot andere gewervelde diermodellen, het grote aantal vissen, tezamen met zijn optische helderheid, maakt snelle, hoge verwerkingscapaciteit in vivo chemische en genetische screening.
Hier beschrijven wij de ontwikkeling bij de zebravis beweging assays een hoge doorvoer en geautomatiseerde methode om spierprestaties beoordelen tijdens zebravis embryogenese verschaffen. Voor beide tests moet worden erkend dat circadiane ritmes enexterne prikkels uit de omgeving zal significante invloed op de zebravis zwemgedrag 17,18. Herhaalde tests van dezelfde zebravis zal ook leiden tot gewenning hetgeen voor een reactie op de tactiele stimulus 23. Daarom, om reproduceerbare resultaten te bereiken tussen experimenten elk zebravisembryo mag slechts eenmaal getest, het tijdstip van de dag en lichtomstandigheden worden gestandaardiseerd en watertemperatuur moet strak gereguleerd.
Het aanraakscherm opgeroepen analyse op 2 dpf we direct de maximale versnelling van een burst zwemactie, dat evenredig is met spierkracht kan meten. Previous technieken zebravis hebben spierkracht onderzocht door binden de beide uiteinden van de embryo experimentele apparatuur waarna spiercontractie gestimuleerde gebruikt een elektrisch veld en de kracht genererende vermogen van de spier 14 wordt gemeten. Hoewel deze methode meet de kracht genererende capaciteit van tHij larvale spier, is het niet meten van de werkelijke kracht die door de larvale spieren tijdens het zwemmen. We ontwikkelden ook een werkwijze om indirect beoordelen van de kracht die tijdens de normale larvale zwembeweging een algehele mate van gezondheid spier verschaffen. De high-speed video-systeem, geschikt voor het opnemen afzonderlijke zebravis bewegingen een framesnelheid van 1000 frames / sec kan worden gebruikt om kleine maar significante verschillen in spierfunctie, die niet direct te onderscheiden met het blote oog te identificeren. Het zal interessant zijn om te zien hoe eerder gerapporteerde wijzigingen in de elektrisch gestimuleerde kracht generatie correleren met veranderingen in het zwemmen prestaties.
Bovendien opgewekte TOUCH op assays kunnen ook worden gebruikt om zwemmen kinematica, zoals de vorm en de snelheid van het lichaam golf tijdens de zwembeweging 24 beoordelen, een kwantitatieve meting van het motorisch gedrag.
Door de spontane beweging van zebrafish larven na 3 DPF, waren we niet in staat om de touch-oproepen testen uit te voeren om de spierfunctie te meten. Omgekeerd, meten we de spier prestaties over een langere periode door het bepalen van de afstand gezwommen door zebravis larven op 6 dpf. Deze test Hoewel een indirecte maat voor spierfunctie, kan worden gebruikt om vis te tonen verminderde spierfunctie 8 of neurodegeneratie 25,26 identificeren. Deze test geeft niet alleen een meting analoog aan de 6 minuten looptest maar is ook geschikt voor geautomatiseerde high-throughput drug in vivo mutagenese of schermen.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken Viewpoint voor hun vriendelijke sponsoring van dit manuscript. Dit werk werd gefinancierd door een Project Grant (APP1010110) van de Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC).
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 21 G x 1' Blunt Needle | Terumo/Admiral Medical Supplies | TE2125 | |
| 48-well plates | Sigma | M8937 | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S90001 | |
| High Speed Camera | Baumer | HXC20 | |
| http://www.randomization.com | N/A | Stappen 1.1.2, 2.1.3 | |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic Pipette | VWR | 16001-188 | |
| StreamPix5 | NorPix | Stap 1.2.3 | |
| Temperature Control Unit | Viewpoint | ||
| Tweezers, style 8 | ProSciTech | T04-821 | |
| Zebrabox System | Viewpoint | ||
| Zebralab | Viewpoint | Stappen 1.3.1, 2.2.1 |
Referenties
- Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).
- Gupta, V. A., Kawahara, G., et al. A splice site mutation in laminin-α2 results in a severe muscular dystrophy and growth abnormalities in zebrafish. PLoS ONE. 7 (8), e43794(2012).
- Gupta, V., Kawahara, G., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).
- Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci. 108 (13), 5331-5336 (2011).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model & Mech. 5 (3), 389-396 (2012).
- Ruparelia, A. A., Oorschot, V., Vaz, R., Ramm, G., Bryson-Richardson, R. J. Zebrafish models of BAG3 myofibrillar myopathy suggest a toxic gain of function leading to BAG3 insufficiency. Acta Neuropathol. 128 (6), 821-833 (2014).
- Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle. Hum Mol Genet. 21 (21), 4718-4731 (2012).
- Sztal, T. E., Zhao, M., et al. Zebrafish models for nemaline myopathy reveal a spectrum of nemaline bodies contributing to reduced muscle function. Acta Neuropathol. 130 (3), 389-406 (2015).
- Pichler, F. B., Laurenson, S., Williams, L. C., Dodd, A., Copp, B. R., Love, D. R. Chemical discovery and global gene expression analysis in zebrafish. Nat Biotechnol. 21 (8), 879-883 (2003).
- Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nat Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).
- Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown. Biochem Bioph Res Co. 413 (2), 358-363 (2011).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat Rev Drug Discov. , (2005).
- Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. (82), e50925(2013).
- Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae. J Vis Exp. (77), (2013).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 41 (4), 500-510 (2010).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test and other clinical endpoints in duchenne muscular dystrophy: reliability, concurrent validity, and minimal clinically important differences from a multicenter study. Muscle Nerve. 48 (3), 357-368 (2013).
- Hurd, M. W., Debruyne, J., Straume, M., Cahill, G. M. Circadian rhythms of locomotor activity in zebrafish. Physiol Behav. 65 (3), 465-472 (1998).
- MacPhail, R. C., Brooks, J., Hunter, D. L., Padnos, B., Irons, T. D., Padilla, S. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
- Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish. J Cell Mol Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem Bioph Res Co. 423 (4), 785-788 (2012).
- Ravenscroft, G., Jackaman, C., et al. Mouse models of dominant ACTA1 disease recapitulate human disease and provide insight into therapies. Brain. 134 (4), 1101-1115 (2011).
- Ravenscroft, G., Wilmshurst, J. M., et al. A novel ACTA1 mutation resulting in a severe congenital myopathy with nemaline bodies, intranuclear rods and type I fibre predominance. Neuromuscular Disord. 21 (1), 31-36 (2011).
- Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci. 108 (37), 15468-15473 (2011).
- Müller, U. K., van Leeuwen, J. L. Swimming of larval zebrafish: ontogeny of body waves and implications for locomotory development. J Exp Biol. 207 (Pt 5), 853-868 (2004).
- Cheng, W., Tian, J., Burgunder, J. M., Hunziker, W., Eng, H. L. Myotonia congenita-associated mutations in chloride channel-1 affect zebrafish body wave swimming kinematics. PLoS ONE. 9 (8), e103445(2014).
- Moggio, M., Colombo, I., et al. Mitochondrial disease heterogeneity: a prognostic challenge. Acta Myol. 33 (2), 86-93 (2014).
Herprints en machtigingen
