Latente Groei Remming Assay aan de kwantificering van bacteriën afgeleide Antimicrobials over het mededingingsbeleid

Samenvatting

De uitgestelde groeiremtest kan worden gebruikt om het competitie-effect door één bacterieel isolaat op een ander te beoordelen. Remmen wordt gekwantificeerd door de zone van opruiming rond het remmer-producerende isolaat te meten, of kwalitatief beoordeeld door de zichtbare mate van remming te bepalen.

Samenvatting

Competitieve uitsluiting kan optreden in microbiële gemeenschappen wanneer, bijvoorbeeld, een remmer-producerende stam zijn concurrent overwint voor een essentieel voedingsmiddel of antimicrobiële verbindingen produceert waartegen zijn concurrent niet resistent is. Hier beschrijven we een uitgestelde groeiremmingstest, een methode voor het beoordelen van het vermogen van een bacterie om de groei van een andere te remmen door de productie van antimicrobiële verbindingen of door concurrentie om voedingsstoffen. Deze techniek is gebruikt om de correlatie van nasale isolaten met de uitsluiting van bepaalde soorten uit een gemeenschap te onderzoeken. Deze techniek kan ook worden gebruikt om te screenen op lantibioticumproducenten of mogelijk nieuwe antimicrobiële middelen. De test wordt uitgevoerd door eerst de te testen remmer-producerende stam een nacht te kweken op een agarplaat, vervolgens de testconcurrentiestam te besproeien en opnieuw te incuberen. Na incubatie kan de mate van remming kwantitatief worden gemeten, door de grootte van de opruimingszone rond de remmer-producerende stam, en kwalitatief, door de helderheid van de remmingszone te beoordelen. Hier presenteren we het protocol voor de uitgestelde remmingstest, beschrijven we manieren om variatie tussen experimenten te minimaliseren en definiëren we een helderheidsschaal die kan worden gebruikt om de mate van remming kwalitatief te beoordelen.

Inleiding

Bacteriën die in gemeenschappen leven, concurreren op interspecifiek en intraspecifiek niveau om ruimte en voedingsstoffen ⁶. Concurrentie tussen microben kan vaak leiden tot uitsluiting van bepaalde soorten of stammen binnen een gemeenschap. Uitsluiting kan te wijten zijn aan concurrentie om een specifieke receptor of voedingsstof, of de productie van een antimicrobiële verbinding door een lid van de gemeenschap ⁶.

Studies die competitieve uitsluiting onderzoeken, bekijken vaak de aanwezigheid en afwezigheid van soorten met behulp van 16S rRNA-sequencing ^3,4,13. Intraspecifieke eigenschapsvariatie, bijvoorbeeld de aanwezigheid of afwezigheid van antimicrobiële peptidenproductie, kan echter een enorme impact hebben op het vermogen van een soort om een andere te remmen ¹. Aangezien 16S rRNA-sequencing niet kan onderscheiden tussen stammen van dezelfde soort, kan intraspecifieke eigenschapsvariatie niet worden beoordeeld. De hier beschreven techniek kan worden gebruikt om het potentieel van individuele stammen om andere bacteriën uit te sluiten te beoordelen. Deze methode is eerder gebruikt om een positieve correlatie te tonen tussen de aanwezigheid van Staphylococcus aureus remmende bacteriën en de afwezigheid van S. aureus in een nasale gemeenschap ⁷.

De uitgestelde groeiremming (concurrentie) test kan de productie van antimicrobiële verbindingen of voedingsconcurrentie door de remmende stam identificeren. Het kan ook positieve interacties detecteren, waarbij de aanwezigheid van de remmende stam de groei van de concurrerende stam daadwerkelijk verbetert. Deze test kan worden gebruikt om kwantitatieve gegevens (grootte van de opruimingszone) en kwalitatieve gegevens (graad van remming) te creëren, die beide kunnen worden gecombineerd met gegevens over de aanwezigheid of afwezigheid van een soort binnen een gemeenschap om correlaties te vinden tussen fenotype (eigenschap) en competitieve uitsluiting ⁷.

Protocol

De volgende werkwijze is aangepast aan ^7,8 concurrent stammen testen met inhibitor producerende stammen.

LET OP: Dit protocol houdt aerosol generatie met bacteriële culturen. Dit kan alleen worden uitgevoerd in een ingeperkte ruimte bij de uitvoering van lokaal goedgekeurde veiligheidsoverwegingen. Sproeien van de kweek op de agar platen bij een niveau 2 veiligheidskast wordt vervuiling van de agarplaten en het omringende milieu te minimaliseren. Dit zal ook de onderzoeker van aerosol inhalatie van de bespoten bacteriën te beschermen, is dit een belangrijk punt van zorg als de onderzoeker is het gebruik van containment level 2 organismen. Geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen moeten worden gedragen. De omgeving van de petrischaal wordt best bedekt met wegwerp absorberend weefsel. Post-nevel ontsmetting met behulp van UV-licht wordt geadviseerd.

1. Voorbereiding van de Agar Plates

1. Bereid je hersenen het hart infusie (BHI) agar in overeenstemming met de manubrikant's instructies.
2. Autoclaaf de BHI agar bij 121 ° C, 15 psi gedurende 20 min, of volgens de aanbevelingen autoclaaf fabrikant te steriliseren.
3. Giet 15 ml porties van gesteriliseerde BHI agar in steriele Petrischalen en laten stellen.
   OPMERKING: elke agarplaat voor gebruik in de assay afkomstig uit dezelfde voorraad agar en dat er evenveel agar in elke plaat. Dit beperkt de variatie in beschikbare nutriënten en remmer diffusie tussen platen waardoor vergelijkbaarheid.

2. Voorbereiden Steriele Bouillon

1. BHI bouillon bereiden volgens de instructies van de fabrikant.
2. Voeg 10 ml porties van 28 ml BHI tot universele glazen flessen.
3. Autoclaaf de BHI bouillon bij 121 ° C, 15 psi gedurende 20 min, of volgens de aanbevelingen autoclaaf fabrikant te steriliseren.
   LET OP: Zorg ervoor dat alle bouillon gebruikt in de test is afkomstig van dezelfde partij bouillon autoclaved tegelijkertijd de variatie in voedingsstoffen die variatie in resultaten kunnen leiden beperken.

3. Het voorbereiden Steriel Vaporizer Bottle (s)

1. Demonteer de vapourizer fles.
2. Spray 5% oppervlakte-actieve reinigingsmiddel door de vapourizer interne verontreinigingen te elimineren, genieten van de vapourizer fles, deksel en vapourizer in de 5% oppervlakte-actieve reinigingsmiddel 's nachts.
   LET OP: Handschoenen en geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen moeten worden gebruikt bij de behandeling van oppervlakte-actieve reinigingsmiddel.
3. Droog de verdamper, deksel en flessen onder steriele luchtstroom kap.
4. Vul de fles met 70% ethanol, bevestig vapourizer en spuit een deel van de ethanol door de vapourizer.
5. Doe het deksel op de verdamper en bewaren met de ethanol tot gebruik binnen.
6. Direct voorafgaand aan het gebruik, aseptisch spoel de fles met steriele BHI bouillon en spuit de bouillon door de vapourizer.
   LET OP: Dit voorkomt dat de ethanol affecterende het inoculum aan de fles toegevoegd in paragraaf 6.3.

4. Voorbereiding van de Bacteriële Overnight Culture (s)

1. Streak de deelnemer en remmer stammen op een steriele BHI agar plaat en incubeer bij 37 ° C aëroob gedurende ongeveer 18 uur (overnacht).
   Opmerking: Deze plaat vormt een voorraad van bacteriën die kunnen worden gebruikt voor meerdere herhalingen binnen dezelfde week indien bewaard bij 4 ° C.
2. Inoculeer 10 ml steriel BHI bouillon met een enkele kolonie van de gewenste deelnemer bacteriestam in een 28 ml flesje universeel.
3. Incubeer de universele fles bij 37 ° C aëroob gedurende de nacht door schudden bij 250 rpm in een rondschudapparaat.

5. Spot Cultuur van de Inhibitor-producerende Isoleren

1. Bereid de kweek van een nacht (s) zoals beschreven in paragraaf 4.
2. Zorg ervoor agarplaten helemaal droog zijn, zonder condensatie op het deksel, voorafgaand aan de inenting (bijvoorbeeld door incubatie plate gedurende 60 minuten bij 37 ° C); dit voorkomt dat het inoculum zich verspreidt over de plaat van de inoculatie plaats.
3. Pipetteer 25 ul van de overnachtkweek op het midden van de agar platen. Vermijd het volledig indrukken van de pipet zuiger om luchtbellen die cultuur spuiten over de agar te voorkomen.
4. Laat de kweek gedroogd bij kamertemperatuur om de verspreiding van de kweek beperken. Incubeer de agar platen bij 37 ° C aëroob gedurende de nacht.

6. Voorbereiding van de Spray Inoculum van de Test Concurrent Strain (s)

1. Bereid de overnacht cultuur zoals beschreven in paragraaf 4. Verdun de kweek gedurende de nacht 10-voudige in BHI bouillon tot ongeveer 4 x 10 ⁶ CFU ml ^-1 geven, en een opschorting van de OD ₆₀₀ 0,3 ± 0,05.
   LET OP: Een 10-voudige verdunning zal niet opgeven 4 x 10 ⁶ CFU ml ^-1 voor alle soorten bacteriën, het berekenen van de benodigde verdunningsfactor door spread plating seriële verdunningen tussen 1 x 10 ^{-1 -1 x 10 -6.}
2. Giet de verdunde cultuur in een steriele plastic parfum verstuiver fles.
   Opmerking: Het totale volume moet meer dan nodig is om het aantal agarplaten spuit. Ongeveer 250 ul per plaat is geschikt voor een 9 cm diameter Petrischaal.

7. Uitgestelde Groeiremming Assay

1. Spuit de cultuur door elk van de verdamper flessen dat de cultuur in de sproeimechanisme geladen vóór sproeien op de agar.
2. Van een afstand van ongeveer 15 cm boven de agar, spuit ongeveer 250 gl verdunde kweek (3 sprays van een typische 50 ml vaporizer) over het gehele oppervlak agar. Incubeer de agar platen bij 37 ° C aëroob gedurende de nacht. Herhalen voor andere platen met hetzelfde aantal sprays.

8. Interpretatie Uitgestelde groeiremming testresultaten

1. Meet de groeiremming zone van de gespoten concurtor stam (Figuur 1A - C, "X" aan "X") in millimeter, aftrekken van de diameter van de centrale vlek van de remmer-producent (Figuur 1A - C, "Y" naar "Y").
   LET OP: Figuur 1E laat zien hoe deze gegevens kunnen worden gepresenteerd
2. Noteer de duidelijkheid score voor remmingszones.
   LET OP: Dit geeft de mate van remming waargenomen. Voorbeelden zijn getoond in Figuur 1A - D, stammen die kunnen worden gebruikt voor standaardisering zijn in de resultaten representatief gedeelte voorgesteld. De volgende schaal kan worden gebruikt voor de duidelijkheid scoring: een helderheid score van 0 tot een zone van volledige groeiremming van de concurrent stam beschrijven. Een score van 1 tot een zone van bijna volledige groeiremming beschrijven slechts individuele kolonies in de zone van clearing. Een score van 2 tot en met een zichtbare zone van verminderde groei te beschrijven, groei binnen deze zone is convloeiend of nabij samenvloeiing maar verminderde dichtheid met> 50%. Een score van 3 tot slechts minimale groeireductie beschrijven confluente groei en verminderd met minder dan 50%, een zone is nog steeds zichtbaar en meetbaar. Een score van 4 tot en met geen zichtbare remming van de groei te beschrijven. Een score van 5 beschrijven dat de groei van de deelnemer stam werd verhoogd in de nabijheid van de test-inhibitor producerende stam. Zie Figuur 1 voor voorbeelden. Deze scores zijn subjectief aan de experimentator.

9. repliceert

1. Herhaalde tests althans biologische drievoud om de reproduceerbaarheid van de verkregen resultaten te bepalen.
   LET OP: Als herhalingen worden uitgevoerd op verschillende dagen, nemen metingen en scoren platen onmiddellijk na verwijdering uit de incubatie, vervolgens winkel platen bij 4 ° C of neem hoge kwaliteit foto's van de platen voordat u ze weggooien. Opslag of foto's van platen maakt een eenvoudige vergelijking van de resultaten tussen de verschillende dagen, tzijn van bijzonder belang voor het bevestigen reproduceerbare scoren in dagen / experimenten. Wees ervan bewust dat de opslag van de platen heeft de potentie om resultaten te veranderen.
   LET OP: Voor duidelijke foto's plaats platen rechtop zonder hun deksel op een mat zwarte achtergrond in een gebied van diffuus licht, maken gebruik van een hoge resolutie camera (≥8 MP) die in staat zich te concentreren op voorwerpen dicht bij de lens (macromodus). Als alternatief kunnen sommige gel imagers met trans-hulplicht ingesteld op wit licht van hoge kwaliteit, zeer reproduceerbare beelden te produceren.

Resultaten

De testresultaten moet waarneembaar als een verschil in de overlappende concurrent stam nabij het ​​centraal spotted inhibitor producerende stam (figuur 1). Deze verschillen kunnen worden geïnterpreteerd als volledige remming (figuur 1A), gedeeltelijke remming (figuur 1B en 1C), geen remming (figuur 1D) of positieve associatie. Het op grote schaal beschikbaar lab stammen S. epidermidis Tü3298 en S. epidermidis Rp62A en S. epidermidis Rp62A en S. aureus Newman werden in Figuren 1B en 1D respectievelijk. Wij suggereren dat deze stammen kunnen worden gebruikt om dit testprotocol.

Afhankelijk geteste soorten, volledige remming en gedeeltelijke remming hoogstwaarschijnlijk het gevolg van antimicrobiële peptiden, antibiotica of andere diffundeerbare groei inhibitors door de inhibitor producerende stam. Gedeeltelijke remming is ook gekoppeld aan verminderde beschikbaarheid van voedingsstoffen voor de deelnemer stam door opname of sekwestreren van nutriënten door de remmer stam ^6.

Vergelijking van de grootte van de zone van remming tussen verschillende inhibitor producerende isolaten getest tegen dezelfde concurrent stam geeft de verschillen in elk van de volgende: de hoeveelheid antimicrobiële door de inhibitor producerende stam; het vermogen van de remmer te diffunderen via de media; het type remmer geproduceerd en de weerstand van de deelnemer stam de remmers geproduceerd. Vergelijking van de grootte van de zone van remming tussen verschillende stammen concurrent getoetst aan dezelfde-inhibitor producerende stam is indicatief voor de weerstanden van de deelnemer stammen de remmer geproduceerd.

De resultaten zijn afhankelijk van de remmende gebruikte stam en de deelnemer gebruikte stam. Herhalingen met dezelfde remmende en concurrent stam Idealiter moet dezelfde duidelijkheid score (beschreven in paragraaf 8.2), duidt dit op een goede techniek is gebruikt in.

Als inconsequente toepassing van bacteriën is opgetreden de platen niet gebruiken. Bijvoorbeeld, als de test deelnemer cultuur te verdunnen de remmingszone groter zal verschijnen met een minder duidelijke rand dan typisch waargenomen (Figuur 2A); dit zou de betrouwbaarheid van elke vergelijkende zone metingen beïnvloeden. Als de-inhibitor producerende stam spot was niet volledig voor de incubatie overnacht gedroogd, de remmer stam is waarschijnlijk te verspreiden en een duidelijk omschreven plek (Figuur 2B), die doorgaans van invloed zone metingen, maar kan ook van invloed op de helderheid scoren niet vormen. Als de deelnemer stamniet gespoten gelijkmatig kan dit leiden tot een ongelijke spreiding van bacteriën (figuur 2C). Als de deelnemer stam te geconcentreerd is het mogelijk dat de deelnemer stam kan groeien bovenop de remmer stam (figuur 2C), in extreme gevallen kan leiden tot een omkering van competitief / inhibitor stam rollen.

Figuur 1:. Het bereik van de kwalitatieve en kwantitatieve resultaten die kunnen worden verkregen van de uitgestelde groeiremming test resultaten voor de remming van de groei kan variëren van (A) volledige inhibitie (score van 0), (B) een gedeeltelijke inhibitie (score van 1) (C) een gedeeltelijke inhibitie (score van 2) tot (D) geen remming (score van 4). Etiket de randen van de groei van de remmer stammen (Y) en de buitenste rand van de remmingzones (X). De grootte van de zone van remming bereik van 0 mm tot meer dan 10 mm, zoals in (E), waarbij de metingen van de platen gefotografeerd in A toont, B, C en D. De resultaten worden getoond Language Staphylococcus isolaten (A , C) of gemeenschappelijke lab Staphylococcus isolaten S. epidermidis Tü3298 (remmer) en S. epidermidis Rp62A (concurrent) (B), en S. epidermidis Rp62A (remmer) en S. aureus Newman (concurrent) (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Voorbeelden van inconsistente resultaten als gevolg van een slechte techniek resultaten kan anders zijn dan verwacht als verschijnen (A. ) concurrent stam werd ook verdund, (B) remmer stam was niet volledig droog is voordat incubatie / borden waren niet droog of (C) indien de deelnemer stam niet gelijkmatig werd gespoten en werd ook geconcentreerd. Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.

Discussie

Een kritische stap van deze bacteriesoorten concurrentie protocol dat het zich onderscheidt van anderen, is de nacht incubatie van de remmer te isoleren voor toevoeging van de concurrent te isoleren. De remmer stam moet deze groei periode remmende verbindingen te produceren. Als de deelnemer stam overlay bovenop hetzelfde medium, deze methode kan de onderzoeker om het volledige potentieel observeren van de remmer stam belemmeren de groei van de stam concurrent. Daardoor deze test geeft wat er gebeurt met de natuur; één isolaat is volledig vastgesteld in een nis, en de andere moet kunnen elk remmend variabelen op te heffen kunnen succesvol binnenvallen niche.

Er zijn twee delen van dit protocol dat de meeste kans om foutieve resultaten veroorzaken bij verkeerd uitgevoerd. Ten eerste kan onvolledige sterilisatie van de verdamper flessen introduceren besmettende bacteriën in de assay. Incubation van de bouillon gebruikt om de verdamper fles in stap 3,6 spoelen met een steriel vat kan worden gebruikt voor flessen werden volledig bevestigd gesteriliseerd. Extra wassingen in desinfecterende oplossingen, zoals Virkon kan voorafgaand worden gebruikt om het wassen in oppervlakteactief reinigingsmiddel, in stap 3.2, als extra sterilisatie vereist.

Een tweede stap die onjuiste resultaten kan leiden is de verdunning van de deelnemer stam (stap 6,1). Indien de verdunningslucht niet optimaal, duidelijk metingen van remming mogelijk niet goed vastgesteld. Deze test werd geoptimaliseerd met behulp van verschillende nasale isolaten als remmer-producerende stammen in een breed scala van Gram-positieve en Gram-negatieve soorten versus S. aureus SH1000 als concurrent stam ^7,8. Het is vervolgens getest met behulp van verschillende coagulase-negatieve en coagulase-positieve stafylokokken als concurrent en remmer-producerende stammen. Bij het testen van andere dan de hierboven beschreven als concurrent generastam, kunnen sommige optimalisatie van de verdunning van het inoculum nodig.

Als duidelijkheid scores aanzienlijk verschillen tussen herhalingen, kan het nodig zijn om de deelnemer stam inoculum standaardiseren door hem op een specifieke extinctie. Dit zal echter de tijd neemt de test op te zetten, en zal waarschijnlijk een aantal stammen verminderen kan verwerken per experiment te verhogen. Visueel aanpassing van de kweek aan een geschikte OD met een McFarland-standaard kan een snel alternatief.

Een beperking van deze techniek is dat het alleen kan worden toegepast op kweekbare bacteriën. Dit is de reden waarom veel studies gebruik 16S rRNA sequencing om concurrerende uitsluiting interacties ^3,4,13 voorspellen. Echter, genetische en metagenomic technieken alleen onderscheiden leden van de gemeenschap om de soort niveau, en / of niet goed zijn voor het bijzonder kenmerk intraspecifieke variatie. Het is mogelijk om te screenen op de associatie van een particular gen dat een eigenschap van de aanwezigheid of afwezigheid van een bacteriesoort ⁵ codeert, maar dit vereist voorkennis van een gen waarschijnlijk geassocieerd met uitsluiting van een soort.

Een veiligheidsoverweging van deze techniek is dat door de aërosolvorming van bacteriën, het kan alleen worden gebruikt in laboratoria met een niveau 2 veiligheidskast, of vergelijkbare veiligheidsmaatregelen. Er zijn alternatieve technieken om te testen voor de concurrentie tussen isolaten die goed zijn voor intraspecifieke trait variatie en niet aërosolen van bacteriën te genereren. Een dergelijke werkwijze is de gelijktijdige antagonisme test ^2. In deze werkwijze wordt een inoculum van één isolaat uitgespreid op een agarplaat en een tweede isolaat inoculum wordt gespot of gestoken geplaatst nadat de eerste is opgedroogd. Dit zou een omgeving waar de stammen zijn in directe concurrentie (gelijktijdig antagonisme) te produceren, zowel concurreren om remmende verbindingen produceren en te vangen voedingsstoffen eerste. de advantage van de uitgestelde groeiremming test over de gelijktijdige antagonisme test is dat de remmer isolaat altijd zou moeten hebben het concurrentievoordeel van wordt volledig vastgesteld vóór de invasie van de concurrent te isoleren. Dit is weerspiegelt wat in het milieu zou gebeuren, zoals in de meeste niches, wordt één isolaat worden vastgesteld voordat andere stam wordt toegevoegd, in plaats van twee isolaten wordt toegevoegd tegelijkertijd ^8.

Een ander alternatief om aërosolvorming van bacteriën te voorkomen is om de deelnemer isoleren topagar, die kunnen worden gegoten en niet gesproeid via remmer isolaat voegen. De omvang van top agar toegevoegd zou moeten ongeveer 3 ml tot gelijkmatige verdeling van de plaat waarborgen. Binnen dit volume, zou de deelnemer isolaat niet groeien op dezelfde media als de remmer isolaat, dus niet lijdt aan een verminderde voedingsstoffen. De concurrent zou ook niet in direct contact met een remmende verbindingen until ze verspreid in de top agar. Bij een dergelijke bepaling niet kon worden omschreven als uitgestelde remming of gelijktijdig antagonisme.

Een soortgelijke werkwijze is eerder gebruikt om de niveaus van resistentie bij klinische bacitracine S. beoordelen aureus isolaten ^10. Het belangrijkste verschil tussen de hier beschreven protocol en beschreven door ^10, is de laatste alleen geclassificeerd concurrent stammen zo gevoelig (compleet inhibition- duidelijkheid score 0) of resistent (gedeeltelijke geen inhibition- duidelijkheid score 1-5). De latente groeiremming assay kan derhalve worden gebruikt om te screenen op mate van resistentie voor producenten van bepaalde antimicrobiële, of zelfs om te zoeken naar nieuwe antibiotica actief tegen multiresistente pathogenen.

Er is gesuggereerd dat de host microflora worden gemanipuleerd om ongewenste leden van de bacteriegemeenschappen ⁹ elimineren. Toepassing van Corynebacteria of stafylokokylococcus epidermidis reeds aangetoond dat S. elimineren aureus kolonisatie in de neusgaten in een aanzienlijk deel van de bevolking ^11,12. Studies in specifieke stammen die concurrerend kan uitsluiten ongewenste lid van de ontvangende flora, door middel van technieken zoals hier beschreven, kan derhalve leiden tot toekomstige therapieën.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Brain heart infusion broth	Lab M	lab049	rijk algemeen doel medium
agar-agar	Merck Milipore	101614
Petrischalen	Sarstedt	82.1473.001
Kunststof parfumverstuiver	niet bekend	-	10 cm hoog met 3,5 cm diameter heldere kunststof spuitfles met deksel, gekocht in de reisartikelenafdeling van een supermarkt
Universele flessen		niet langer in productie, alternatief SLS BOT5006	28 ml glazen cilindrische fles (~280 mm diameter, 850 mm hoogte), platte bodem met plastic schroefdop
Decon 90	Decon		oppervlakteactieve reinigingsmiddel