Rapid Subtractieve patroonvorming van Live-Cell Lagen met een microfluïdische Probe

Samenvatting

We presenteren een protocol om subtractieve patterning van levende celmonolagen op een oppervlak uit te voeren. Dit wordt bereikt door lokale en selectieve lysis van adherende cellen met behulp van een microfluïdische sonde (MFP). Het cellysaat dat uit lokale gebieden wordt verkregen, kan worden gebruikt voor downstream-analyse, waardoor moleculaire profileringsstudies mogelijk worden.

Samenvatting

De microfluïdische sonde (MFP) vergemakkelijkt het uitvoeren van lokale chemie van biologische substraten door beperken nanoliter volumes van vloeistoffen. Via een bepaalde implementatie van de MFP, de hiërarchische hydrodynamische stroming opsluiting (hHFC), worden meerdere vloeistoffen tegelijkertijd in contact gebracht met een substraat. Lokale chemische werking en vloeibare vormen van het gebruik van de hHFC, wordt benut om de cel patronen te creëren door het plaatselijk lyseren en het verwijderen van cellen. Door gebruik het scannen vermogen van de MFP, worden willekeurige patronen van celmonolagen werden aangemaakt. Dit protocol maakt een snelle, real-time en ruimtelijk gecontroleerde cel patronen, die selectieve cel-cel en cel-matrix interactie studies kan toestaan.

Inleiding

In hun eigen omgeving, cellen in biologische weefsels waarnemen verschillende biochemische en fysische signalen waarbij hun groei, organisatie en ontwikkeling. Inzicht in deze signalen vereist selectief onderzoeken van cel-cel en cel-matrix interacties. Dit vereist de ontwikkeling van methoden voor patroonvorming celmonolagen. Methoden om geometrisch scheiden verschillende celtypen in kweek (patronen) inschakelen brede studies van fysische en chemische signalen in de celbiologie. De meeste van de huidige benaderingen voor patroonvorming cellagen ^1-4 afhankelijk afzetten cel-adhesie-eiwitten op oppervlakken of via microfabricated sjablonen voor selectieve groei op substraten. Daarentegen Hier presenteren we een methode om snel patroon celmonolagen in situ, dat wil zeggen, cellen in kweek, door het verwijderen van cellen in geselecteerde zones van de monolaag. Methoden die dergelijke subtractieve patronen ⁵ uit te voeren ^{- 9} usually vereisen gespecialiseerde substraten, oppervlaktebehandeling, complexe operatie, fysiek contact of ablatie met behulp van een laser, per ongeluk waardoor de levende cellen. We gebruiken hier een microfluïdische sonde (MFP) ^10,11, een contactloze scanning microfluïdische technologie die hydrodynamisch beperkt een vloeistof op een substraat. Een belangrijk onderdeel van de MFP is de op microschaal vervaardigde kop met microkanalen (figuur 1). De bijbehorende platform bestaat uit spuitpompen voor vloeibare controle fasen voor het scannen van controle en een omgekeerde microscoop voor visualisatie en feedback (figuur 2). In de basisconfiguratie de MFP kop omvat twee microkanalen met openingen aan de top, een voor inspuiten van een behandelingsvloeistof en de andere voor het aan elkaar aanzuigen de geïnjecteerde behandelingsvloeistof enkele immersievloeistof (Figuur 3A). MFP tijdens gebruik, de punt zich op een vaste afstand van het substraat. Wanneer de aspiratie debiet (QA) is sufficiently hoger dan de injectie debiet _(Qi), dwz _Qa: Q _i ≥ 2,5, de behandelingsvloeistof beperkt op het substraat. Dit resulteert in een hydrodynamische stroming bevalling (HFC). De regio waar de behandelingsvloeistof in direct contact met het substraat wordt genoemd de voetafdruk. Voor normale bedrijfsomstandigheden wordt de stroming van de behandelingsvloeistof binnen de HFC gekenmerkt door een lage Reynolds (Re ≈ 10 ^-2) en een hoge Péclet getal (Pe ≈ 10 ^2). Dit impliceert vloeistofstromen in laminaire regime met convectie wordt de primaire functie van de massa-overdracht van chemische stoffen. De numerieke en analytische modellen voor stroming opsluiting zijn elders beschreven ^12-14.

In dit artikel gebruiken we de aanpak van gelijktijdig opsluiten van meerdere verwerkingseenheden vloeistoffen, die wordt genoemd hiërarchische HFC (hHFC) ^14. Voor de uitvoering van hHFC met de MFP, twee additional openingen zijn nodig om een ​​secundaire bron van injectie en te zuigen. Dit stelt ons in staat om een ​​vloeistof te beperken binnen een tweede vloeistof. De binnenste (verwerking) vloeistof profiteert van zijn afgeschermd van verdwaalde puin op het substraat door de buitenste (afscherming) vloeistof. Bovendien hHFC is bedrijf in twee modi: (i) de geneste stand, waarbij de behandelingsvloeistof in de binnenste HFC het oppervlak raakt (figuur 3B), en (ii) de geknepen stand, waarbij de inwendige vloeistof verliest contact en alleen de buitenste vloeistof in contact met het substraat (Figuur 3C). Schakelen tussen de twee modi kunnen gebruikers bewerkstelligen of stoppen met het verwerken van het substraat en wordt bereikt door regeling van de kop-oppervlak opening of door de verhouding tussen de stromen injectie (Q _i2 / Q _i1). Voor een gegeven geometrie kanaal, kan de voetafdruk van de behandelingsvloeistof op het substraat worden geregeld door het moduleren stromingscondities (Figuur 3D). natrium hydroxide (NaOH) wordt gebruikt als de binnenste behandelingsvloeistof om de cellen te lyseren en het lysaat wordt continu afgezogen van het oppervlak. Omdat de chemische werking van de behandelingsvloeistof worden gelokaliseerd in het binnenste HFC footprint, de aangrenzende cellen blijven onverstoord die spatiotemporele studies van cel-cel interacties toelaat. Het scannen functionaliteit van de MFP laat de oprichting van door de gebruiker gedefinieerde geometrieën van de cel patronen (Figuur 4). Verder is de keuze van NaOH als behandelingsvloeistof geschikt stroomafwaartse DNA-analyse (Figuur 7).

Protocol

1. MFP Head en Platform Reiniging en voorbereiding

LET OP: Dit protocol maakt gebruik van verticaal georiënteerde silicium-glas hybride MFP hoofd ^15,16. De siliciumcomponent van de kop bevat de microkanalen die geëtst tot een diepte van 100 urn zijn. De geëtste silicium gebonden aan glas gebruikt anodische binding. Het kanaal ontwerp bestaat uit een patroon van zes kanalen, twee elk voor injectie en aspiratie, en twee voor het injecteren van de immersievloeistof (figuur 1). De kanalen worden gebruikt voor het injecteren van onderdompeling vloeistof vullen de media rondom het biologisch monster, waardoor de verliezen als gevolg van aspiratie en verdamping vermeden. De binnenste en buitenste kanalen kanalen die gebruikt worden in de huidige werkzaamheden zijn 100 x 100 micrometer en 200 × 100 micrometer respectievelijk. Bericht fabricage en verwerking, MFP hoofden met duidelijke kanalen en gepolijste toppen worden verkregen.

1. Voorbereiding van het pompstation en de vloeistof-handlinginrichting
   1. Gebruik capillairen met een 1/16 '' (1,59 mm) buitendiameter en 0,02 "(0,51 mm) binnendiameter alle slangen aangesloten op de spuiten. Variëren capillaire afmeting gebaseerd op de toepassing en het verkrijgen van de juiste connectors en accessoires voor de interface van de MFP hoofd met de spuiten. Gebruik ultrapuur water waar verdunningen nodig zijn.
   2. Schone spuiten (250-500 pi volume) en spuit plunjers door sonicatie in 0,5% bleekwater oplossing in ultrapuur water voorafgaand to-en post-live cell experimenten. Spoel ze grondig met water. Vullen met water door het volledig onderdompelen van de uiteinden in een waterbad en aanzuigen via de zuiger. Spoel de vloeistof, terwijl binnen het waterbad met de spuit as contact opnemen met de afdichting bij de uitgang van de spuit. Herhaal aspireren en spoelen tot er geen luchtbellen worden gezien in de spuit kolommen.
   3. Sluit injectiespuiten aan de spuit pompen met behulp van Luer lock-connectors. Gebruik een schakelklep aangebracht op depompen om de vloeistof van de spuit direct naar één van twee capillairen die ofwel de MFP hoofd of de vloeistofreservoirs (figuur 6). (Als er geen switch afsluiter is beschikbaar zie paragraaf 1.4.4). Purge beide capillairen met water uit de spuiten met een debiet van ongeveer 10-50 pl / min, afhankelijk van de grootte van de injectiespuit tot ongeveer 10 pl water achterblijft in de spuiten.
   4. Pre-steek de gespoeld haarvaten in een geschikte microfluïdische connector / adapter die raakvlakken met het kanaal via's in het hoofd (bv M1 connector - zie materialen).
2. MFP hoofd voorbereiding
   1. Reinig de MFP hoofd door sonicatie behulp glaswerk wasmiddel voor het standaard reiniging of 0,5% bleekmiddel voor strenge schoonmaak, gedurende 5 minuten. Purge kanalen met water door onderdompeling van de apex in water en onder vacuüm brengen van de via.
   2. Inspecteer kanalen onder een stereomicroscoop voor potentiële obstakels (verstopping) en opnieuwturf de vorige stap indien nodig.
   3. Monteer het schone kop op de kophouder en schroef de connector met de vooraf geplaatst en gespoeld slang op de weg. Schroef de kophouder de Z-fase, die wordt gebruikt voor de bestrijding van openingsafstand tussen de kop en de cel monolaag.
3. Kalibreren van de scanning stadia van de MFP-platform
   1. Voer eindpunt kalibratie van de X-, Y- en Z-fasen voorafgaand aan het verbinden van de kop naar het platform, volgens het protocol van de fabrikant met een geschikte software-interface. Gekalibreerde etappes zorgen voor nauwkeurigheid bij het positioneren van de MFP hoofd.
   2. Het verkrijgen van een ruwe nul openingsafstand (op nul zetten) door aanpassing van de MFP hoofd over een kamer dia zonder cellen en langzaam dalen in 5 micrometer stappen. Bij probe contact met het substraat, dient Newton ringen worden waargenomen. Dit is een ruwe schatting. Een nauwkeurige positie te verkrijgen na aanpassing coplanarity de probe apex naar het substraate.
   3. Om coplanarity de sonde apex waarborgen, past de kanteling van de kop met een goniometer (op het grensvlak van het hoofd en de Z platform). Wanneer gevormd opdat de ringen van Newton symmetrisch (figuur 1). Beweeg de MFP hoofd 20 urn uit de buurt van de ondergrond en stel tilt met behulp van de goniometer. Herhaal de afdaling, op nul zetten en kantelverstelling tot ringen van de Newton's zijn symmetrisch op contact. Met tilt bijgesteld, stel de Z-positie die symmetrisch Newton ringen produceert als nul.
      OPMERKING: De Z-fase regelt de head-to-substraat afstand, terwijl de kruistafel regelt het scannen van het substraat (figuur 2). Een gedetailleerde uitleg kunt u vinden in onze eerdere werk ^14.
4. Chemische producten voor de lokale verwijdering van cellagen
   Let op: In voorkomend geval, de veiligheid van het gebruik apparatuur (bijvoorbeeld, nitril handschoenen, een veiligheidsbril) voor de chemicaliën die worden voorbereid. Gebruik een fume hood zonodig voor het bereiden van oplossingen. Bereid alle chemicaliën en buffers met ultrapuur water als oplosmiddel.
   1. Bereid 50 mM NaOH oplossing de behandelingsvloeistof voor de binnenste injectiekanaal (i2 met stroom _I2 Q in figuur 1).
   2. Bereid de extractiebuffer oplossing nodig voor de buitenste injectie (i1 met stroming Q _I1 in figuur 1), bestaande uit 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 0,5% Tween 20, en 10 uM rhodamine B in 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethaan bij pH 8. Voor zuivering, water gebruiken in het streven spuiten.
   3. Filtreer alle oplossingen met een 0,2 urn spuitfilter. Ontgas alle gefilterde oplossingen met behulp van een exsiccator totdat de opgeloste lucht stop opborrelen.
   4. Met behulp van de afvoerleiding aangesloten op de spuit pompen, zuiveren de rest water en zuig de ontgaste oplossingen in de injectiespuiten op 40 pl / min tot het spuiten zijn volledige (250 of 500 pi).Hierdoor luchtbellen vullen van de spuiten, connectoren en capillairen. De spuit-switch ventiel-twee-capillaire systeem maakt het vullen van de spuiten mid-experiment. Bij het ontbreken van een dergelijke switch klep, koppel de haarvaten van het hoofd en de haarvaten en de spuit te vullen door het opzuigen van de ontgaste oplossingen voor hen opnieuw aan te sluiten op het hoofd.
   5. Opzuigen verwerking en afscherming vloeistoffen door de capillairen maakt het gebruik van kleine volumes tijdens bedrijf. Indien de chemicaliën kunnen worden bereid in grote hoeveelheden, vullen injectiespuiten met de vereiste oplossingen direct. Zo kan de aspiratie spuiten die water bevatten worden gevuld met deze benadering.
   6. Spoel de haarvaten van de MFP hoofd met de voor elk kanaal, zoals omschreven in 1.4.1 en 1.4.2 toegewezen vloeistoffen.
      OPMERKING: De extractie bufferoplossing schermt het NaOH in de binnenste opsluiting en rhodamine component in de buffer maakt de visualisatie van de hHFC tijdens het gebruik.
   7. Als de cellen zijn over-confluent, met mobiele aggregaten die op het gekweekte oppervlak, een aanvulling op de extractie buffer met 10% Proteinase K. Deze aanvulling op de werking van NaOH op deze aggregaten door het oplossen van gedenatureerde eiwitten als het lysaat komt in de aspiratie kanalen. Dit voorkomt verstopping van de kanalen tijdens bedrijf.
5. Bereiding van celmonolagen op kamer objectglaasjes
   Let op: Gebruik een celkweek kap voor het kweken van de cellen en verwerken apparatuur volgens de geldende voorschriften door de bioveiligheid officer van het laboratorium in te stellen. Let op speciale eisen van specifieke cellijnen en het protocol en de uitrusting aan te passen.
   1. Gebruik celkweek incubator (5% _CO2 en 37 ° C) voor kweek en uitbreiding van cellen worden gevormd. Voer de uitbreiding van het gebruik van standaard celkweek protocollen ^17,18 in T-kolven. Gebruik het kweken van media als per eisen van de specifieke cell lijn (bv serum en antibiotica aangevuld DMEM voor het kweken van MCF7 en MDAMB 231).
   2. Bij het ​​bereiken celconfluentie in de kweekkolven, trypsinize en laat cellen en zaden 2 x 10 ⁵ cellen / ^cm2 in elk van de 2-kamer glijbanen voor patroonvorming en cultuur dan 48 uur. Gebruik de cellen in een van de kamers als controle voor celgroei en levensvatbaarheid.
   3. Bij het ​​bereiken celconfluentie op de kamer slides, incubeer de cellen gedurende 45 min met 500 ul cel tracker kleurstofoplossing (bijvoorbeeld groen - CMFDA of oranje - CMRA) en 10 uM concentratie bereid in serumvrij medium. Dit wordt gedaan voor mobiele visualisatie tijdens de patroonvorming. Was de gemerkte cellen met PBS door zachtjes spoelen elke kamer met een pipet, en vervolgens de cellen te kweken in serum-aangevuld medium voor patroonvorming experimenten.
   4. een referentiebeeld van het cel-tracker gekleurde celoppervlak verkrijgen ten behoeve van celtellingen. Dit wordt gewaarborgdconfluentie van de cellaag. Daarnaast dient het als een hulpmiddel voor de kwantificering experimenten als monster herstel en DNA-analyse zijn doelstellingen.
      LET OP: In het geval dat de levensvatbaarheid van de cellen is om tijdens de patroonvorming worden beoordeeld, kunnen de cellen worden gekleurd met een Live / Dead cytotoxiciteit kit volgens de instructies van de fabrikant.

2. Het creëren van de hiërarchische Hydrodynamische Flow Opsluiting (hHFC)

1. Beweeg de MFP via cel monolaag een spleetafstand van 50 urn van het glaasje. Deze kloof afstand en tegelijkertijd contact van de hHFC verklaart ook monolaag oppervlak en de dikte variatie.
2. Injecteer NaOH op 6 of 8 ul / min door i2. Evalueer andere debieten (dat wil zeggen, Q _I1, Q en Q _{A1 A2)} met behulp van de stroom regels in figuur 3.
3. Moduleren omvang van de binnenste HFC door de verhouding van Q _I2 / _I1 Q met de injectiespuiten.Gebruik bijvoorbeeld een Q _I1 tussen 1,3 pl / min en 4 pl / min, met de Q _I2 in 8 pl / min, waardoor een NaOH voetafdruk van 150 vaste - 300 cellen (100 - 200 pm ² / cel) ( figuur 3D).
4. Injecteer volledig medium van de buitenste grootste openingen op de MFP kop met een stroomsnelheid van 20 pl / min te verklaren verdamping van de media en aspiratie tijdens de operatie van de hHFC.

3. patroonvorming celmonolagen behulp hHFC

Opmerking: Het aftastpatroon bepaalt de gebieden van de cel monolaag waarbij de cellen worden gewonnen (subtractieve patronen), waarbij de resterende cellen tot specifieke biologische vragen bestuderen. Dit patroon kan worden rechte lijnen of een array van spots, bijvoorbeeld. Complexe patronen vereisen ontwerp van een geschikte scanning van de bal. Bijvoorbeeld, een geblokte aftast trajectorie verschaft een raster van celgebieden (getoond bijvoorbeeld op Figuur 4A ), hetgeen mogelijk bestuderen van het effect van verschillende stimuli op cellen in verschillende vierkanten terwijl u vlak. Deze patronen kunnen worden gemaakt met behulp van de controle over de XY stadia van het platform, waar de besturingssoftware maakt scripting scan trajecten voor de MFP hoofd over de cel monolaag.

1. De weg geëffend software om de meetkop via eencellige laag in gebruikerseenheden patronen scannen (door X, Y en Z-coördinaten) bij een scansnelheid van 10 pm / s op een openingsafstand van 50 urn.
2. Met de geneste hHFC in bedrijf en in contact met de monolaag, scant de MFP met een baan van het gewenste patroon tot patroon celverwijdering bewerkstelligen.
3. Voor een co-cultuur na de eerste celtype verwijdering, zaad een andere cel lijn om de leemtes op te vullen, met behulp van methoden in paragraaf 1.5 beschreven. Verplaatsen tussen geneste en kneep modi (door groeiende kloof afstand, bijvoorbeeld) naar cel verwijdering beheersen.
   LET OP: De scan snelheid kan zijn onderzoeksprocedure te zijngated voor de andere cellijnen. De scan snelheid gebruikt in deze demonstratie effecten volledige cel verwijdering over de gescande regio's voor de gebruikte cellijnen.

4. downstream processing voor monsterneming en DNA Amplification

1. Bereid de bemonstering station voor downstream-analyse van het lysaat. Voor de bemonstering station, gebruik maken van een 3D geprint 8-strip PCR buishouder. Alternatief Kies een geschikte buishouder om als deze adapter, die kunnen worden binnen het scanbereik van het hoofd buiten het substraat aangebracht is. Veeg de buishouder met 70% ethanol of een ander oppervlak ontsmettingsmiddelen basis van de gewenste stringentie voor de toepassing. Gebruik een magnetische clip op de buis houder om het te hechten op het substraat houder.
2. Na bereiding van de bemonstering station, plaatst u de MFP hoofd 100 micrometer uit de monolaag. Beginnen werken de hHFC met 50 mM NaOH oplossing de behandelingsvloeistof voor de binnenste injectiekanaal met stroomsnelheden van 1, 6, -7 En -17,5 pl / min Q respectievelijk _{I1, I2} Q, Q Q _A1 en _A2.
   1. Zodra de stroom opsluiting (ongeveer 10 seconden) is gestabiliseerd, dalen de meetkop een spleetafstand van 50 urn tot NaOH gebaseerde lokale lysis van de gekozen subpopulatie van cellen met de hHFC voeren. Zodra lysis van de subpopulatie voltooid (ongeveer 30 sec per footprint), richt de richting van de buizen in het monsternemingsstation. Verwijder de verzamelde lysaat in de PCR buisjes direct (figuur 6).
3. Voor verdere verwerking van het lysaat eerst de pH van de oplossing te neutraliseren door het mengen van het lysaat met Tris buffer (1: 1). Na neutralisatie Verhit het lysaat aan 95 ° C gedurende 30 min. Vervolgens direct het lysaat laden in een standaard qPCR workflow zoals vastgesteld door leverancier van het instrument.

Resultaten

De beschreven protocol voor snelle subtractieve patroonvorming van celmonolagen wordt aangetoond met meerdere componenten MFP platform (figuren 1 en 2). Het protocol maakt gebruik van de hiërarchische hydrodynamische stroom opsluiting (hHFC; figuur 3) ter plaatse te behandelen en cellen te verwijderen uit celmonolagen, met behulp van NaOH als de verwerking vloeistof. De hHFC configuratie bestaat uit een innerlijke HFC en een buitenste HFC. De opgesloten NaOH in de binnenstad hHFC introduceert chemische werking en afschuiving op de cellen in contact. Binnen deze footprint worden de cellen homogeen blootgesteld aan de chemische werking van NaOH vanwege convectie aangedreven massaoverdracht binnen en met verwaarloosbare diffusie naar het gebied buiten de bevalling. De schuifspanning op de cellen anderzijds, kan worden veranderd door het variëren van de stroomsnelheid van NaOH. Operationele parameters vereenvoudigen, kozen we om chemische werking maken het dominante mechanisme van cel verwijderd in vergelijking met de schaar. naarschatten de kracht afschuiving door de hHFC aangebracht op het oppervlak, werd een eindige elementen model gemaakt met Comsol Multiphysics 5,0. Simulaties werden uitgevoerd met behulp van de CFD-module voor laminaire stromingen. Twee inlaat randvoorwaarden aan de injectie openingen van de geometrie en twee uitlaat randvoorwaarden om aspiratie openingen (figuur 5) werden toegepast voor het bereik van stroomsnelheden en diafragma afmetingen in de huidige demonstratie. In het verkregen model, de stroming de regels bepaald shear profiel, terwijl de stroomsnelheden de grootte van de afschuiving op het oppervlak gedefinieerd. Praktisch, een combinatie van beide bepaalt of de hHFC het oppervlak raakt. Houden van deze factoren in het achterhoofd hebben we besloten om een ​​reeks debieten voor bedrijf te vinden om chemisch dominante cel verwijdering te verkrijgen. Om een ​​hHFC te maken, gebruiken we de stroom regel van een totaal streven naar injectie stroomsnelheid verhouding van 3,5. De andere stroom regels gebruikt werden gedefinieerd om te minimaliseren verstopping binnen de aspiratie kanalen,die kan worden veroorzaakt door gedenatureerde eiwitten vasthouden aan de kanaaloppervlakken. Met gebruikmaking van dit model hebben wij debieten van 5 tot 10 pl / min vertalen naar een schuifspanning tussen 1 en 3 N / m ^2. Zonder chemisch effect NaOH, bijvoorbeeld in het geval van de extractiebuffer, de schuifspanning niet hoog genoeg om de cellen te ¹⁹ verwijderen. Binnen de waargenomen bereik, merken we op dat de werking bij hogere stroomsnelheden is praktischer als gevolg van verstoringen in de stroom weg bij lage aspiratie debieten (dat wil zeggen, Q _I2 <4 pl / min) als gevolg van celresten in de kanalen.

Gezien de bestudeerde shear profiel en praktische overwegingen, NaOH debiet (Q _I2) van 6 en 8 pl / min worden toegepast voor de patroonvorming experimenten en Q _I1, Q _A1 en Q _A2 moet het stroomdiagram regels figuur 3. De verhouding injectie stromen (Q _I2 / _I1 Q) U kuntop verdere moduleren de grootte van de hHFC voetafdruk (figuur 3D en figuur 4B), waarbij het ​​onderliggende principe uitgewerkt door Autebert et al. ^14. Als liquid-shaping vermogen van de hHFC combinatie met een hoge-resolutie scanning vermogen van MFP platform demonstreren wij levende cellen raster generatie op meerdere schalen en bovendien de toepassing van het protocol gegeven in ontwikkeling co-kweken (figuur 4C) tonen.

Het platform maakt het ook mogelijk ons ​​te proeven lysaat ophalen uit te voeren voor downstream-analyse. Om de kwaliteit van het verkregen lysaat tonen we probeerden lokaal gelyseerde cellen uit een en vijf voetafdrukken in twee onafhankelijke experimenten, die de variatie in hoeveelheden DNA verkregen uit het lysaat (Figuur 7). Hier hebben we geamplificeerde DNA in het lysaat met behulp van β-actine primers (voorwaarts: GGATGCAGAAGGAGATCACT en achteruit: CGATCCACACGGAGTACTTG ) Via 4 pl van het geneutraliseerde lysaat in elke PCR-reactie.

Figuur 1. Modules van de MFP platform en de kop. (A) De operationele modules van het platform omvatten gemotoriseerde spuiten, gemotoriseerde fase en een regelaar. De MFP is verbonden met een gemotoriseerde Z-fase naar de spleet afstand tussen de kop en het substraat controle en de substraathouder is om de X- en Y-gemotoriseerde fasen waaruit het scansysteem bevestigd. (B) De MFP kop heeft fluidic vias naar het pompstation aan te sluiten, montagegaten aan het hoofd op de Z-stage te monteren, en kanalen die de gepolijste apex verlaat. De punt is ingesteld coplanaire aan de celkweek substraat. Symmetrische Newton ringen kunnen worden waargenomen wanneer de top en het substraat zijn coplanair en in contact. p_upload / 54447 / 54447fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. MFP platform. De hoge-resolutie scanning platform is voorzien van een bewerkt kophouder interfacing met de hoge precisie gemotoriseerde Z-fase. De substraathouder is verbonden met de XY podium voor het scannen. Voor de recuperatie van het lysaat voor downstream analyse, wordt een 3D geprint monsternemingsstation magnetisch geknipt aan de zijde van de substraathouder (zie detail). Spuitpompen, een omgekeerde microscoop, controllers en displays bevinden zich rond het platform. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3 "src =" / files / ftp_upload / 54447 / 54447fig3.jpg "/>
Figuur 3. Hiërarchisch hydrodynamische stroming opsluiting (hHFC) voor ruimtelijke en temporele controle celverwijdering. (A) Schematische voorstelling van een HFC. (B) Geneste en (C) geknepen modus hHFC werking. (D) Afbeelding van de voetafdruk voor twee verschillende injectie / aspiratie stroom ratio's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Patronen van celmonolagen met behulp van de MFP. (A) Cell-grid generatie door geprogrammeerde aftasten van de MFP op een MDA-MB-231 cel monolaag. De cellen werden gekleurd met groene cel-tracker kleurstof. (B) De voetafdruk voor de verschillende injectieverhoudingen (n) Op MCF7 cel monolaag. Het schema toont de verwachte variatie in de vorm van de binnenste HFC met een verandering in n. (C) Patterned co-cultuur door subtractieve patroonvorming van MCF7 monolaag gevolgd door het zaaien van MDA-MB-231 cellen in de afgetrokken regio's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. afschuifspanning op de ondergrond na het aanbrengen hHFC. De schuifspanning op het oppervlak lineair toeneemt met de binnenste injectie stroomsnelheid. Het hoogste scheer piek wordt gevonden tussen de twee binnenste openingen (rechtsonder inzet), wanneer de verwerking vloeistof wordt beperkt (rood stroom lijnen, linksboven inzet). Het diafragma afmetingen die in het eindige elementen model zijn 200, 100, 100 en 200 urn voor i1, i2, a1en A2, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. Bedrijfsmodi van de MFP platform naar cel verwijdering en patronen uit te voeren. (A) Schematische weergave van de stroming pad voor subtractieve patroonvorming door cellysis. Eenvoudigheidshalve slechts één van elke injectie en aspiratie stroompaden getoond. De spuiten zijn gevuld met de afvoerklep in de pomp. i1 en i2 worden gebruikt voor het injecteren extractiebuffer en NaOH, respectievelijk. (B) Schematische voorstelling van stroomweg voor lysaat herstel. Deze stromingsweg wordt geactiveerd na verzameling cellysaat voor analyse via de stromingsbaan in (A). Gelieve click hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7. Downstream analyse van DNA uit cellysaat met behulp van qPCR. (A) Versterking percelen van DNA in lysaat geëxtraheerd uit 5 footprints (5 fp) en 1 footprint (1 fp). Controles werden geëxtraheerd na lysaat collectie voor beide zaken. (B) smelt curven van DNA geamplificeerd uit het lysaat met de kwaliteit van het geëxtraheerde DNA. qPCR werd uitgevoerd (N = 2, n = 3) om de β-actine-gen te versterken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur S1. Een geschaalde beeld van kanaal ontwerp voor de 6-kanaals MFP headvoor patroonvorming experimenten. Channels uitvoeren van de hHFC zijn 200, 100, 100, 200 urn breed en 100 um diep. De twee buitenste kanalen, die onderdompeling vloeistof te vullen zijn 500 micrometer breed en 100 micrometer diep. Een GDS-bestand voor het zelfde ontwerp is voorzien als een aanvulling op dit artikel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

We presenteren een veelzijdig protocol voor de subtractieve patroonvorming van celmonolagen die korte generatietijd van bepaalde omtrek celpatronen maakt. Selectieve lysis van celmonolagen wordt uitgevoerd met NaOH als behandelingsvloeistof in hHFC. NaOH gedenatureerd onmiddellijk de eiwitten in de celmembraan. Wij raden het gebruik van 50 mM concentratie van NaOH tot downstream processing van het lysaat te waarborgen. Deze concentratie kan worden verhoogd voor snellere celverwijdering, ontvangen lysaat downstream processing is geen doelstelling. De hHFC zorgt dat de verwerkte aangrenzende plaatsen van de cel monolaag onaangetast en zijn beschikbaar voor zowel uitbreiding van de patroon of probing andere eigenschappen van de cellen.

De snelheid van cel verwijderen is een functie van zowel de chemie en afschuiving door de stroming. We kiezen voor een bereik van debieten chemie dominante cel verwijdering hebben. Scannen snelheden van 10 - 20 en #181; m / sec met een NaOH injectie stroomsnelheid van 6-8 pl / min gebruikt om 'snelle' subtractieve patroon vergemakkelijken. Het snelle tempo van de cel verwijderd wordt een aantal uitdagingen voor het oppervlak printen op basis patronen benadert ^20,21. Deze werkwijzen vereisen een mechanisme om de groei van cellen in ruimtelijk gedefinieerde gebieden te beperken, bijvoorbeeld door selectieve afzetting van celadhesie-eiwitten via micro-contact drukken en daaropvolgende zaaien van cellen om het patroon te verkrijgen. Zij worden beperkt door lage doorvoer en vereisen een aantal opeenvolgende stappen op patroon generatie en een nieuw sjabloon / stempel voor elk patroon. De beschreven methode maakt geen selectieve groei van cellen op bepaalde gebieden vereisen en overwint verscheidene beperkingen door het uitvoeren van subtractieve patroonvorming in tegenstelling tot het drukken, zonder dat enige extra behandeling van de celkweek substraat.

Met de in deze paper protocol, de doorvoer van patroonvorming celmonolagenis toegenomen, terwijl het verkrijgen van onmiddellijke visuele feedback van de gegenereerde patroon. Dit vergemakkelijkt realtime modificatie van de patronen. Dergelijke controle zou cruciaal scenario's waarin cellevensvatbaarheid op een bepaald oppervlak niet homogeen. Een ander voordeel van de werkwijze is dat dezelfde kop en chemie kan worden gebruikt om meerdere patronen te genereren, waardoor het aantal stappen voor het genereren van een gevormde cel monolaag verminderen.

De afmetingen van de kanalen in het hoofd en de geometrie kan worden geschaald volgens de vereisten van de toepassing, waardoor controle over de resolutie van het patroon. Alle experimenten in de huidige werkzaamheden werden uitgevoerd met een MFP kop met vaste afmetingen diafragma, specifiek binnenste openingen 100 x 100 urn en buitenste openingen 200 x 100 urn. Dit ontwerp met grotere buitendiameter openingen gekozen om continue werking van de hHFC waarborgen zonder verstopping van de openingen doorverdwaalde celresten. We hebben hoofden getest met innerlijke opening afmetingen 50 x 50 micrometer en 50 micrometer afstand tussen hen, met succesvolle resultaten in cel verwijderen. Gebruik van kleinere openingen naar 10 x 10 urn met 10 urn afstand, zou schaling toelaten om een ​​kleinere voetafdruk grootte (~ 30 x 30 micrometer), waardoor een hogere resolutie in patroonvorming. We zagen operationele problemen met de opening die kleiner zijn dan 10 micrometer als gevolg van verstopping van de deeltjes. Vanwege deze operationele problemen, 100 urn is de stroombegrenzing resolutie en daarmee een beperking van de beschreven techniek. Maar we kunnen dit aan te pakken met behulp van de vloeibare vormgeving vermogen van de hHFC. We hebben aangetoond dat de oplossing van celverwijdering voor een bepaalde reeks van diafragma afmetingen kunnen gevarieerd worden door het regelen Q _I2 / _I1 Q (figuur 4b) en de top-tot-substraat gap ^10,14. De stappen die in het huidige werk een minimale stapgrootte van 100 nm.Een combinatie van deze bestuurbare parameters kan de ruimtelijke resolutie van celverwijdering wat betreft de grootte en footprint scanafstand verbeteren.

Als gevormde co-kweken worden gewenst specifieke cel-cel interacties tussen verschillende celtypen te bestuderen, kunnen opeenvolgende zaaien en patroonvorming worden uitgevoerd met het beschreven protocol. Tenslotte kan amplificeerbaar DNA van hoge kwaliteit worden verkregen bij het ​​lysaat, zoals blijkt door de enkelvoudige piek in het DNA te smelten kromme (zie figuur 7). We evalueerden een DNA hoeveelheid ongeveer 1,6 ng van een voetafdruk (ongeveer 300 cellen) gebruikt qPCR, dat dicht bij de theoretische verwachting (6-8 pg / cel). Dit duidt op een hoeveelheid van het geëxtraheerde DNA geschikt voor meerdere stroomafwaartse processen tijdens gebruik wegnemen van elke DNA isolatie werkwijzen. Dit opent mogelijkheden voor DNA-analyse op basis van lokale sonderen van gekweekte cellen. Het vermogen van hHFC vloeistoffen vormen kunnen ook worden gebruikt om levende cellen en eiwitten op ac deponerenveerd oppervlakken, die in combinatie met de subtractieve patronen en sequentiële co-kweken in dit protocol maakt de creatie van complexe cel en cel-matrix patronen op cultuur substraten. De veelzijdigheid en de controle door hHFC gebaseerde subtractieve patroonvorming van celmonolagen en de mogelijkheid van het uitvoeren van DNA-analyse van het geëxtraheerde cellen, een krachtig nieuw instrument ingesteld biologen ruimtelijk opgeloste studies met cel interacties voeren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materialen
Microfluidic Probe (MFP)			Silicon/glas hybride sondekop met in silicon gevormde kanalen. Fabricage gebeurde in eigen beheer bij IBM Research - Zürich
Lab Tek II Chamber slides met 2 kamers	ThermoFisher scientific, USA	154461	2 kamer kamer slides voor celcultuur waarbij elke kamer een oppervlakte van 4 cm2 biedt en geschikt is voor maximaal 3 ml mediavolume
Chemicaliën en cellijnen
Natriumhydroxide, Tris-Cl, Ethyleendiaminetetraazijnzuur, Rhodamine B	SigmaAldrich chemicaliën, USA	S5881, 252859,  E9884, R6626	Chemicaliën gebruikt voor het verwerken en afschermen van vloeistoffen
Proteinase K	Qiagen, Duitsland	19131	protease om gedenatureerde eiwitten te verteren
Deconex 16 Plus	Bohrer Chemie, Zwitserland		Universeel reinigingsmiddel voor laboratoriumverbruiksartikelen. Gebruikt voor niet strenge reiniging.
DNA away	ThermoFisher scientific, USA	7010	Oppervlakteontsmettingsmiddel dat DNA en DNAasen denatureert.
DMEM, hoge glucose, GLUTAMAX supplement	ThermoFisher scientific, USA	10566-016	Kweekmedium voor epitheelcellen.
CellTracker Green CMFDA kleurstof	ThermoFisher scientific, USA	C7025	Membraan doorlatende live cellabeling kleurstof. Kleurstof actief gedurende 72 uur.
CellTracker Orange CMRA kleurstof	ThermoFisher scientific, USA	C34551
β-actine genomische primers voor qPCR	Integrated DNA technologies, USA		Aangepaste oligo's gebruikt voor DNA kwaliteitsvalidatie en qPCR.
MCF7 borstcarcinoom cellen	ATCC, USA	ATCC HTB-22	Cellijnen gebruikt om co-culturen te produceren.
MDA-MB-231 borstcarcinoom cellen	ATCC, USA	ATCC HTB-26
Apparatuur en vloeistofverbindingen
Gemotoriseerde hoge precisie stages	Op maat gemaakte componenten.  Lineaire asmotoren van LANG GmBH, Duitsland	Aangepaste lineaire as stages uit de LT-serie	3 × LT voor 3 assen. LSTEP controller gebruikt voor interface van stages en PC via RS 232 poort.
Spuiten	Hamilton, Zwitserland	1700 TLLX serie	Uitwisselbaar met spuiten geleverd door andere fabrikanten met een 250-500 µl bereik.
Nemesys lagedruk spuitpompen	cetoni GmbH, Duitsland		Onderdeel van de pompinstallatie.
Circulaire M1-connector	Dolomite microfluidics, Verenigd Koninkrijk	3000051	Interface tussen vias in MFP-kop en buis
Kanteling/rotatiestandaard Goniometer	OptoSigma, USA	KKD-25C	Goniometer om coplanariteit van MFP-top aan te passen
DS Fi2 HD kleurencamera (CCD)	Nikon, Zwitserland		Gestuurd met DS-U3 controller unit
Software
Win - Commander	LANG GmBH, Duitsland		Stage besturingssoftware.
Qmix Elements	cetoni GmbH, Duitsland		Pompbesturingssoftware.
NIS Elements	Nikon, Zwitserland		Basisonderzoeksmodule voor beeldverwerving en analyse.