Methodenartikel

Light-gemedieerde Vorming en patroonvorming van hydrogels voor Cultuur van de Cel Applications

DOI:

10.3791/54462

⸱

29 september 2016

 , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Delaware

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een sequentieel proces voor lichtgemedieerde vorming en daaropvolgende biochemische patroonvorming van synthetische hydrogelmatrices voor toepassingen in driedimensionale celcultuur. De constructie en modificatie van hydrogels met cytocompatibele fotoclick-chemie wordt gedemonstreerd. Bovendien worden eenvoudige technieken gepresenteerd om patronen te kwantificeren en observeren en de celviabiliteit binnen deze hydrogels te bepalen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Instructies chemische werden onderzocht voor gebruik in tal van biomaterialen toepassingen, zoals geneesmiddelafgifte, weefseltechnologie en celkweek. In het bijzonder licht-gemedieerde klik reacties zoals photoinitiated thiol-een en thiol-yn reacties, verkregen spatiotemporele controle materiaaleigenschappen en laat het ontwerp van systemen met een hoge mate van de gebruiker gerichte objecten control. Fabricage en modificatie van hydrogel gebaseerde biomaterialen met de precisie geboden door licht en de veelzijdigheid die door deze thiol-X Photoclick chemie zijn van toenemend belang, met name voor de kweek van cellen in welbepaalde, biomimetische micro-omgevingen. We beschrijven hier werkwijzen voor het photoencapsulation cellen en daaropvolgende photopatterning biochemische signalen binnen hydrogelmatrices behulp veelzijdige modulaire bouwstenen gepolymeriseerd met een thiol-een Photoclick reactie. In het bijzonder wordt een aanpak gepresenteerd voor samenwerkingnstructing hydrogelen van allyloxycarbonyl (Alloc) -functionalized peptide verknopingen en hanger peptide eenheden en thiol-gefunctionaliseerde poly (ethyleenglycol) (PEG) die snel polymeriseren bij aanwezigheid van lithium acylphosphinate fotoinitiator en cytocompatible doses van lange golflengte ultraviolet (UV) licht. Facile technieken photopatterning visualiseren en kwantificeren van de concentratie van peptiden toegevoegd worden beschreven. Daarnaast worden werkwijzen vastgesteld voor het inkapselen van cellen, specifiek menselijke mesenchymale stamcellen, en bepalen van de levensvatbaarheid en activiteit. Terwijl de vorming en patroonvorming van eerste thiol-alloc hydrogels hier getoond, deze technieken kunnen breed worden toegepast op een aantal andere lichte en radicale geïnitieerde materiaalsystemen (bijvoorbeeld thiol-norborneen, thiol-acrylaat) patroonmatig substraten genereren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Instructies chemie worden steeds meer gebruikt bij het ontwerpen van materialen voor verschillende biomedische toepassingen, waaronder drug delivery, tissue engineering en gecontroleerde celkweek door hun selectieve, efficiënt en vaak cytocompatible reactiviteiten. 1-3 Photoclick chemie die licht gebruiken om uitlokken of initiëren reacties (bijvoorbeeld azide-alkyn, 4 thiol-een, 5 en tetrazool-alkeen 6) zijn van bijzonder belang voor de vorming of wijziging van biomaterialen. Hoge snelheden onder milde omstandigheden en bepalen wanneer en waar zij plaatsvinden met oplicht deze reacties zeer geschikt voor de gebruiker gerichte controle biomateriaal eigenschappen in de aanwezigheid van cellen. 7,8 Vooral zijn thiol-een Photoclick chemie gebruikt naar hydrogel gebaseerde biomaterialen robuuste mechanische eigenschappen en 5,9 voor de inkapseling van een grote verscheidenheid aan celtypen, waaronder, maar worden er geent beperkt tot, menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs), fibroblasten, chondrocyten en pancreascellen, met belofte voor celcultuur en levering. 10,11 Verder zijn deze chemische gebruikt voor het ruimtelijk patroon van biochemische signalen essentiële aspecten nabootsen natieve cel microenvironments en juiste cel-matrix interacties, zoals hechting, differentiatie en invasie vergemakkelijken. 3,12

Voor de bouw van thiol-een hydrogels met licht, peptiden die cysteïnen (thiol) gewoonlijk worden omgezet met polymeren gefunctionaliseerd met acrylaten of norbornenen ( "ene") voor een snelle, photoinitiated polymerisatie onder cytocompatible omstandigheden. 13 Uitbreiding deze toolbox zochten we vaststellen methoden voor het hydrogel formatie met nieuwe veelzijdige en toegankelijke bouwstenen die minimale synthetische verwerking of waren in de handel verkrijgbaar in de richting van hun brede gebruik als synthetische extracellulaire matrices.14 In het bijzonder werden peptiden gemodificeerd met allyloxycarbonyl (Alloc) -beschermde lysines: één voor hanger, integrine-bindende groepen om celadhesie [K (alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] of twee te bevorderen voor niet-afbreekbaar of cell-afbreekbaar crosslinks [K ( Alloc) RGKGRKGK (Alloc) G of KK (Alloc) GGPQGIWGQGK (Alloc) K = Pep2Alloc respectievelijk]. Met deze sequenties werden vastgestelde voorwaarden voor snelle reactie (1-5 min) met vierarmige thiol-gemodificeerde poly (ethyleenglycol) (PEG4SH) via cytocompatible doses van lange golflengte UV-licht (10 mW / cm2 bij 365 nm) en de foto-initiator lithium fenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). De resulterende hydrogels waren stabiel onder celcultuur voorwaarden voor weken. Tot-cel gedreven afbraak en verbouwing mogelijk te maken, werd een enzymatisch-kliefbare peptide opgenomen in de gel crosslinks (dwz GPQGIWGQ), 15 en een model primaire cel, menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs), bleven zeer levensvatbaar na inkapseling en during cultuur binnen deze matrices. Verder peptiden zijn ruimtelijk patroon in deze materialen en hMSCs blijven levensvatbaar en metabolisch actief onder photopatterning omstandigheden. Alternatieve hanger peptidesequenties, hier niet getoond (bijv IKVAV, YIGSR, GFOGER, etc.) kunnen ook worden opgenomen in matrices extra cel interacties met het omringende micro sonde. Deze resultaten zijn veelbelovend voor de toepassing van deze hydrogel gebaseerde materialen voor driedimensionale (3D) celkweek en levering te bestuderen en directe cel-matrix interacties voor verschillende celtypen.

Hierin werkwijzen om cellen photoencapsulate vervolgens photopattern biochemische signalen binnen het voorgestelde hydrogel systeem zijn weergegeven (figuur 1). Technieken te observeren en te kwantificeren die photopatterns ook gedemonstreerd: name i) de kwantitatieve en kwalitatieve analyse gebruik van Ellman het bepalen modificatie van vrije thiolen op gevormde substraten en ii) de complementaire kwalitatieve gebruik van fluorescente peptiden (AF488Pep1Alloc) om deze patronen te observeren in drie dimensies. Verder assays voor levensvatbaarheid (Live / dead levensvatbaarheid / cytotoxiciteit-kleuring) en metabole activiteit te bepalen (MTS 3- (4,5-dimethyl-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyfenyl) -2- (4-sulfofenyl) 2H-tetrazolium) worden gepresenteerd, zodat gebruikers de cytocompatibility van photoencapsulation en photopatterning voorwaarden voor verschillende cellijnen binnen hydrogel matrices kan bepalen. Terwijl het protocol is aangetoond voor een gemakkelijke licht gebaseerde Photoclick hydrogel systeem kunnen de technieken worden toegepast op talrijke andere radicaal-geïnitieerde hydrogelenystemen voor photoencapsulation en photopatterning in aanwezigheid van cellen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van materialen voor Hydrogel Formation

  1. Synthetiseren hanger (Pep1Alloc, AF488Pep1Alloc) en verknopen van peptiden (Pep2Alloc) door middel van standaard vaste fase peptidesynthese (SPPS) technieken en thiol-gefunctionaliseerde polymeer door drie-stappen-procedure voor het einde groep modificatie (PEG4SH). 14,16 alternatief kopen PEG4SH (M n ~ 20 kDa), Pep1Alloc en Pep2Alloc commercieel.
  2. Synthetiseren de foto-initiator (LAP) door de twee-staps reactie hieronder beschreven. 14,17 Voer synthese stappen (1.2.1-1.2.11) in een zuurkast en voorzichtig te zijn bij de omgang met chemicaliën (beschermende handschoenen, kleding en een veiligheidsbril) . LAP ook kunnen in de handel worden aangeschaft.
    1. Droog het glaswerk in de oven (> 2 uur, 80 ° C).
    2. Voeg een roerstaaf een lege één-hals rondbodem kolf (100 ml) en deksel met een septum.
    3. Bevestig de kolf op een magnetische roerder verwarmingsplaat met een ring statief en klem.
    4. iknsert een naald (18 G) door het septum en laat het uiteinde open naar de atmosfeer. Plaats een tweede naald bevestigd aan een inert gas lijn. Open de inert gas lijn (bijvoorbeeld argon of stikstof) en zuiveren de kolf gedurende 10-15 min.
      NB: Het systeem zal continu worden gespoeld met inert gas, argon of stikstof, gedurende de reactie.
    5. Overdracht 1,5 g (~ 1,4 ml) dimethyl phenylphosphonite (PAS) aan de kolf met een injectiespuit met naald doorboren het septum. Zet het roer plaat (gemiddelde snelheid) en wees voorzichtig dat de inhoud niet spatten op de zijkanten van de kolf.
    6. Voeg 1,6 g (~ 1,46 ml) 2,4,6-trimethylbenzoylchloride (LET) druppelsgewijs aan de kolf die dimethyl phenylphosphonite, met een injectiespuit met een naald om het septum te doorboren.
    7. Bedek het reactievat met folie ter bescherming tegen licht en roer gedurende 18 uur onder argon of stikstof.
    8. De volgende dag, verhogen de hoogte van de kolf en plaats een oliebad op de roerder, eennd kantel de kolf in het oliebad. Verwarm het water en de kolf tot 50 ° C onder handhaving magnetisch roeren.
    9. Ontbinden 3,05 g lithiumbromide in 50 ml 2-butanon. Breng de kolf uit het oliebad en voeg de lithiumbromide oplossing voor de rondbodemkolf kort verwijdering het septum te gieten in de kolf.
      1. De erlenmeyer opnieuw met het septum (NB: Septum zal nog een naald die tot de argon lijnen en een naald te ventileren), laat de kolf weer in verwarmde oliebad, en laat de reactie verlopen gedurende 10 min. Een vast neerslag wordt gevormd.
    10. Na 10 minuten, uit te schakelen argon, verwijder de kolf van het vuur en laat het mengsel rusten gedurende 4 uur (bedekt met een folie ter bescherming tegen licht als een lichtgevoelige initiator is geproduceerd. Houd de naald opening plaats.
    11. Giet het product in een glas frit trechter of trechter gevoerd met de juiste papieren filter. Spoel filtraat 3 keer met 50 ml 2-butanon aan rchrap eventueel niet-omgezet lithiumbromide.
    12. Droog (eerst op benchtop en vervolgens in vacuümexsiccator) en product analyseren met 1H NMR in D 2 O. Karakteristieke pieken bij 1,8-1,9 (6H, s), 2,1-2,2 (3H, s), 6,7-6,8 (2H, s), 7,3-7,4 (2H, m), 7,4-7,5 (1H, m) en 7,5 -7,7 (2H, m). 14,17
  3. Gebruik een spreadsheet om het volume en de concentratie van elk bestand oplossing (PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, LAP), die moeten worden opgesteld om hydrogels (tabel 1) te berekenen. Om non-patroon gels te maken, ervoor te zorgen dat [SH] = [Alloc] zodat alle reactieve groepen tijdens de polymerisatie worden geconsumeerd. Als photopatterning gels gepland bevatten een overmaat thiol functionele groepen tijdens gelvorming gebaseerd op stoichiometrie (bijvoorbeeld 0,2-5 mM, [SH]> [Alloc]) voor latere reactie met Pep1Alloc.
    LET OP: Gels moet groter zijn dan 5 gewichtsprocent (gew%) bevatten PEG4SH tot snelle polymerisatie (binnen 5 min) te garanderen. Echter, lagere gew% bereiks kunnen worden onderzocht als de aanvraag vraagt om hydrogels met lagere moduli (bijvoorbeeld <0,5 kPa); polymerisatie moet worden gecontroleerd en aangepast voor deze lage gew% composities. Omgekeerd verleent Pep1Alloc concentratie worden ingesteld voor verschillende toepassingen (bv, 0,2-5 mM) zoals gerapporteerd in de literatuur voor thiol gefunctionaliseerde peptiden. 18-21 LAP concentratie aanbevolen ongeveer 0,067 gew% (2,2 mM) of minder, zoals beschreven, als hogere concentraties kan cellevensvatbaarheid verminderen.
  4. Bereid voorraad oplossingen van Pep1Alloc, Pep2Alloc, PEG4SH en LAP onder steriele omstandigheden voor celkweek op basis van berekeningen in tabel 1.
    1. Voor Pep1Alloc en Pep2Alloc individueel wegen de totale massa van Pep1Alloc en Pep2Alloc van peptidesynthese en oplossen in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 1% penicilline / streptomycine (PS) en 0,5 ug / ml fungizon (FZ). Typische concentraties van bereide stamoplossingen range20-100 mg / ml peptide. Mixen deze voorraden gels met uiteindelijke moduli relevant zachte weefsels toepassingen (Young's modulus ~ 0,5-5 kPa). 22,23 Aliquot en bewaar bereiken bij -20 ° C tot gebruik.
    2. Voor PEG4SH, wegen PEG4SH in een steriele microcentrifugebuis en los op in PBS + PS + FZ. Typische concentraties van deze voorraad oplossing range 250-430 mg / ml (20-30% PEG4SH van het gewicht).
    3. LAP, weeg LAP in een steriele microcentrifugebuis en oplossen in PBS + PS + FZ tot een eindconcentratie van 7,5 mg / ml.
      LET OP: Het voorbereiden van verse oplossingen van PEG4SH en LAP wordt aanbevolen voor elke inkapseling of gel experiment om te zorgen voor een consistente polymerisatie tijden.
  5. Bereid steriele spuit Tip Mallen voor het Vormen van hydrogels.
    1. snijd voorzichtig de tips off van 1 ml spuiten met behulp van een scheermesje en vervolgens verwijderen van de zuigers van de spuit assen.
    2. Dompel de spuit schachten en zuigers in 70% ethanol gedurende 15 minuten eend plaats in een steriele celkweek kap drogen (30 min). Als er teveel druppels ethanol binnenkant spuit as te blijven, gebruik maken van de plunjer om ze te duwen.
  6. Bereid steriele glazen Slide Mallen voor het Vormen van hydrogels.
    1. Soak Glasplaten (veelvouden van 2) en rubber pakkingen (0,254 mm dik, 2 kleine stukjes gebruikt als schijven, een rechthoek met schijven uitgestanst, of vierkante frame vorm) in 70% ethanol gedurende 15 min, en plaats in steriele celkweek kap drogen.
    2. Bedekkinghelft van de gesteriliseerde dia's met anti-hechtende coating volgens de aanwijzingen van de fabrikant om de hechting van de top van de gel op het glijoppervlak (bijvoorbeeld wanneer er 4 glijbanen, 2 slides wordt bekleed met anti-kleefmiddel) te voorkomen. Deze zullen als de bovenkant van het glasplaatje mal.
  7. Kalibreer de lamp voor spuit of glasplaatje mallen.
    LET OP: Voor deze experimenten, kwik booglamp met een externe filter adapter assemblage en 365 nm extern filter werd gebruikt. andere lampom passende intensiteiten van lange golflengte UV licht te produceren kunnen worden gebruikt zoals door anderen. 24-27
    1. Bevestig een collimatorlens aan het einde van de met vloeistof gevulde lichtgeleider relatief gelijkmatige lichtintensiteit in alle monsters te verzekeren. Als dat nodig is, stel dan de afstand van de lichtgeleider uit de steekproef (s) naar een plek grootte die zal betrekking hebben op monsters van belang te bereiken.
    2. Plaats een cut spuit schimmel in een microcentrifugebuis houder (om spuit schimmel in verticale stand te houden). Houd de radiometer ter hoogte van de spuit waar de monsters worden gehouden en pas sluiter (% open) om een lichtintensiteit van 10 mW / cm2 bereikt bij 365 nm. Noteer de aangepaste instellingen voor later gebruik.
    3. Plaats een glasplaatje mal op de bovenkant van een steriel oppervlak (bijvoorbeeld de top van een pipetpunt box binnen een bio kast). Houd de radiometer detector ter hoogte van het glaasje mal en stel sluiter (% open) om een ​​lichtintensiteit van 10 m te bereikenW / cm2 bij 365 nm. Noteer de aangepaste instellingen voor later gebruik.

2. Hydrogel Vorming en Photopatterning

  1. Voorbereiding van de Non-patroon Hydrogels.
    OPMERKING: Op dit punt in het protocol als hydrogelen gebruik in celkweek toepassingen, alle volgende stappen worden onder steriele omstandigheden uitgevoerd in een steriele kast of kap.
    1. Meng voorraad oplossingen van PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP en PBS + PS + FZ volgens de spreadsheet-berekening (zie tabel 1 voorbeeld). Pipetteer de resulterende gel precursor oplossing hevig om gelijkmatige menging van de oplossing.
    2. Bereid dikke hydrogels gevormd in spuittips pipetteren 10-20 pl van de gel precursor oplossing (PEG / Pep / LAP / PBS) in de punt van een steriele spuit cut. Maak een enkele gel per spuit, ongeveer 0,5-1,5 mm dik op basis van volume en spuit diameter.
      LET OP: Grotere volumes kan onderzocht worden op basis vande gewenste gel grootte, waar bovengrenzen kunnen bestaan ​​op basis van diffusie beperkingen voor Pep1Alloc tijdens photopatterning en / of nutriënten / afval naar / van ingekapselde cellen in celkweek.
    3. Bereid dunne hydrogels in glasplaatje vormen door het plaatsen van de rubberen pakking (0,254 mm dik) aan de randen van de onbeklede glasplaatje. Pipetteer 5-10 ul gel precursor oplossing (enkelvoudige of meervoudige 5-10 gl gels kunnen worden door pipetteren één of meer punten van de oplossing op één dia) op de onbeklede glasplaatje en plaats het glaasje gecoat met anti-hechtmiddel bovenop de geloplossing (grotere gels, tot de grootte van het glaasje kan worden afhankelijk van de uiteindelijke toepassing). Zet de glaasjes met een klein bindmiddel clips te stabiliseren.
    4. Plaats mallen onder de lamp en zet de lamp intensiteit (bijvoorbeeld% sluiter geopend) tot 10 mW / cm2 te bereiken op het gel oppervlak voor spuit tip mallen of glasplaatje mallen op basis van metingen in stap 1.7.2 en1.7.3, respectievelijk.
    5. Onder lichte gedurende 1 tot 5 minuten om volledige polymerisatie van gels mogelijk. Gebruik een kortere polymerisatietijd voor gels met een hoger gehalte PEG4SH (8 gewichts% of meer, 1 min) en langer gels met lagere PEG4SH gehalte (5-8 gew%, 3-5 min) volledig gepolymeriseerde hydrogels produceren met moduli binnen het bereik van de zachte weefsels (0,5-5 kPa).
    6. Plaats gels van spuit mallen in een steriele niet-behandelde 48-well plaat en plaats objectglaasjes in een steriele schaal.
    7. Spoel 3 x 15 minuten met celkweekmedium of geschikte buffer (bijvoorbeeld PBS + PS + FZ, Ellman's reactiebuffer) is gebaseerd op geplande experimenten, zoals hieronder beschreven.
  2. Voorbereiding van de Patterned Hydrogels.
    1. Meng voorraad oplossingen van PEG4SH, Pep2Alloc, LAP en PBS + PS + FZ volgens de spreadsheet berekening, waardoor vrije thiolen (0,2-5 mm) voor latere reactie met Pep1Alloc. Pipetteer de precursor oplossing krachtig om gelijkmatige menging van de oplossing.
    2. Bereid dik en dun hydrogels zoals vastgelegd in de stappen 2.1.2 tot 2.1.6.
      LET OP: Niet gels in groeimedium plaatsen voorafgaand aan photopatterning. Vrije thiolen kunnen worden door species in het groeimedium (bijvoorbeeld disulfiden met thiol bevattende eiwitten) verschijnt niet patroonvorming van de gel zonder additionele bewerkingsstappen toe (bijvoorbeeld reductie van disulfidebindingen).
    3. Bereid oplossingen Pep1Alloc (eindconcentratie ~ 3-20 mg / ml) en 2,2 mM LAP.
    4. Bedek voorgevormde gels met Pep1Alloc / LAP oplossing en incubeer 1 uur bij 37 ° C.
    5. Verwijder overtollig Pep1Alloc / LAP oplossing. Als gels een spuittip werden gevormd, gebruik een spatel om de gels voorzichtig brengen van de 48-well plaat waarin ze incuberen in een steriele glasplaatje voor patroonvorming.
    6. Plaats een fotomasker met het gewenste patroon rechtstreeks op Naalden- en glazen schuif gevormde gels. Zorg ervoor dat de afgedrukte gedeelte van het masker raakt de gel voor een optimale Pattern trouw (dat wil zeggen, masker moet leest het goed en zijn emulsie naar beneden). Leg monsters onder de lamp en bestralen gedurende 1 minuut met de lamp instellingen die worden gebruikt voor de glasplaatjes (stap 1.7.3).
    7. Na het vormen, place spuit-gegoten gels in een steriele, 48 putjes niet-weefselkweek behandelde plaat en plaats glasplaatje gegoten gels die de glasplaatjes worden gehecht in een steriele schaal.
    8. Spoel 3 x 15 min met een mobiele kweekmedium of geschikte buffer (bijvoorbeeld PBS + PS + FZ, Ellman's reactie buffer) op basis van de geplande experimenten.

3. Het visualiseren en kwantificeren van Photopatterning

  1. Ellman's Assay te kwantificeren Gratis Thiolen detecteren en in Photopatterned Hydrogels.
    1. Bereid Ellman reactiebuffer, cysteine ​​werkoplossing, standaarden en Ellman's reagens zoals hieronder beschreven.
      1. Voor Ellman's Reaction Buffer, los 2,4 g natrium dibasisch (Na 2 HPO4) en 74,4 mg ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) in 200 ml Dih 2 O (0,1 M Na 2 HPO 4, 1 mM EDTA). Op pH 7,5-8 met oplossingen van natriumhydroxide (NaOH) of fosforzuur (H PO 3 4).
      2. Voor Cysteine ​​Working Solution, ontbinden 5,27 mg cysteïne in 15 ml reactiebuffer (2 mM cysteïne).
      3. Voor Cysteine ​​Standards, verdunde cysteine ​​werkoplossing in reactiebuffer bij een eindconcentratie van 2, 1,5, 1,25, 1, 0,75, 0,5, 0,25 en 0 mM cysteïne.
      4. Voor Ellman's reagens, te ontbinden 4 mg Ellman's reagens in 1 ml reactiebuffer. Ultrasone trillingen de Ellman's reagens volledig oplossen.
    2. Kwantificeren van de concentratie van vrije thiolen in gels met Ellman's test (Figuur 2).
      OPMERKING: "Thin" 5 pl hydrogels, gevormd tussen glasplaatjes, worden beschreven in de onderstaande procedure aanbevolen en snelle diffusie van Ellman's reagens t toestaanhrough de gel (dat wil zeggen, het duurt het reagens een langere tijd te diffunderen door dikke gels).
      1. Bepaal de gezwollen gel volume van de 'dunne' 5 pl gels (V S) op basis van de volumetrische zwelling ratio, Q.
        1. Maak drie 20 'dikke' gels ul gebruik van de spuit mallen. Plaats gels in Ellman reactie buffer gedurende 24 uur en vervolgens af te wegen (evenwicht gezwollen massa, M S). Lyofiliseren de gels en vervolgens af te wegen (droge massa, M D).
        2. Uitgaande van de gemeten massa's dikke gels Bereken het volumetrische zwelverhouding 28 door Q = 1 + ρ polymeer / ρ oplosmiddel (M S / M D -1) waarin ρ polymeer = 1,07 g / cm 3 voor PEG, 29 ρ = 1,0 solvent g / cm 3 voor PBS / H2O
        3. Bereken de theoretische drooggewicht van de gel te gebruiken voor Ellman's test (hier "dun" gels 5 pi typisch uSED), door het optellen van de massa's van individuele componenten PEG4SH, Pep1Alloc en Pep2Alloc (M D = M PEG4SH + M Pep1Alloc + M Pep2Alloc). Bijvoorbeeld een 5 pl gel met 10 gew% PEG4SH bevat ongeveer 0,000535 g PEG, berekend M PEG4SH = 0,005 cm 3 x 1,07 g / cm 3 x 0,10. Pep1Alloc en Pep2Alloc massa worden berekend op dezelfde wijze op basis van gew% in oplossing (zie spreadsheet voor waarden), uitgaande van ρ ≈ 1,0 g / cm 3 van deze waterige oplossingen.
          LET OP: Gels kunnen ook worden gedroogd en gewogen in plaats van de berekening van het theoretische drooggewicht. Het kan echter een uitdaging om consistent meten het drooggewicht van de dunne, 5 gl gelen.
        4. Op basis van de voorspelde droge massa en de Q-waarde bepaald op basis van 'dikke' gels, het berekenen van de voorspelde gezwollen massa M S voor de 'dunne' gel (vergelijking in stap 3.1.2.1.1). Neem aan dat ρ ≈ 1,0 g / cm 3, dan M S ≈ V S. Gebruik deze berekende V S kwantitatieve Ellman's analyse uit te voeren.
          LET OP: De bovenstaande methode wordt aanbevolen om V s voor gezwollen gels als de 'dunne' 5 ul gels bepalen, zijn moeilijk te dragen voor het wegen.
      2. Vorm dunne hydrogels voor patronen zoals beschreven in paragraaf 2.2 (5 pi volume). Specifiek maakt gels met overmaat vrije thiolen en 'patroon' helft van deze monsters met behulp Pep1Alloc duidelijk dekglaasje overstromen blootstellen gehele gel met licht (bijvoorbeeld 6 totaal gels met overmaat thiol: 3 niet-gemodificeerd niet-'patterned 'en 3' patroon).
        LET OP: Voor deze test 'patroon' gels zijn overstroming blootgesteld aan licht, zonder een fotomasker. Deze methode wordt gebruikt om het totale aantal vrije thiolen verbruikt in de gehele gel monster te bepalen en om aan te tonen hoe efficiënt vrije thiolen kunnen worden gemodificeerd met peptide. Uit deze informatie,het aantal vrije thiolen verbruikt tijdens de patroonvorming met een fotomasker kan worden voorspeld op basis van de gel dikte en de afwijkingshoek (gebieden blootgesteld aan licht).
      3. Plaats 'gevormde en niet-'patterned' gelen in putjes van een 48-well plaat en spoel 3 x 15 min met Ellman's reactiebuffer diffusie ongereageerde soorten mogelijk uit de gel en evenwichtzwelling plaatsvinden.
      4. Voeg extra Ellman reactiebuffer de gels gespoeld zodat Vs bij reactiebuffer is een veelvoud van 20 pl. Wanneer bijvoorbeeld de voorspelde V S 15 ui, voeg 5 ul reactiebuffer (20 ui), en indien de voorspelde Vs is 30 pl, voeg 10 ul reactiebuffer (40 ui).
      5. Pipetteer de cysteine normen in afzonderlijke putjes (zonder gels) van een 96-wells plaat in veelvouden van 20 ul afhankelijk van het volume die in de vorige stap (bijvoor- beeld als de vorige stap moest Vs + extra reactie bUffer = 40 ui, voeg 40 ul van elke norm aan individuele lege putten).
      6. Verdun Ellman's reagens in reactiebuffer (veelvouden van 180 gl reactiebuffer + 3,6 pl Ellman's reagens, bijvoorbeeld, 183,6 20 367,2 ul of pi 40 pi in stap 3.1.2.5).
      7. Voeg verdunde Ellman's reagens aan putjes die standaarden en monsters. Voor 20 pl monsters voeg 183,6 ul oplossing in elk putje. Het dubbele hoeveelheid reagens verdunde Ellman voor 40 pl monsters (of schalen dienovereenkomstig gebaseerd op de grootte van het monster).
      8. Incubeer of plaatsen op een schudder gedurende 1 uur en 30 minuten (bij kamertemperatuur) of totdat de kleur van de oplossing overeenkomt met de kleur van de gels visuele inspectie om voldoende diffusie van het geel 2-nitro-5-thiobenzoaat dianion waarborgen (TNB 2), dat wordt gegenereerd na reactie van Ellman's reagens met vrije thiolen, uit de gel.
      9. Neem 100 gl oplossing van monsters en sNORMEN en plaats in putjes van een 96-wells plaat.
      10. Lees absorptie bij 405 nm op een plaatlezer.
      11. Om de gegevens te verwerken, plot de standaard curve (monsters uit stap 3.1.1.3) (absorptie versus concentratie) en breng een lineaire functie. Met de lineaire functie, de concentratie van vrije thiolen in de 'verdunde gel-oplossing (gel + reactiebuffer) worden berekend op basis van absorptiemetingen. Tenslotte, gezien de "verdunning" met reactiebuffer, bepalen de vrije thiol concentratie in de gels zonder reactiebuffer. (Bijvoorbeeld als 15 ul gel met 5 ui reactiebuffer werd verdund, vermenigvuldigen met 20/15).
    3. Visualisatie van photopatterns met Ellman's reagens (Figuur 3A).
      1. Geniet dunne hydrogels patroon met Pep1Alloc in Ellman reactie buffer gedurende 1 uur.
      2. Overtollig reactiebuffer voorzichtig schoon rond de randen van de hydrogel met een tissue.
      3. Pipetteer Ellman's reagens direct op het oppervlak van de gel. Onmiddellijk beeld op een lichtmicroscoop bij 10X of stereomicroscoop met een kleurencamera.
        Opmerking: Gels moet onmiddellijk worden afgebeeld, omdat visualisatie patronen zullen verdwijnen binnen 5 min als de gele TNB 2- ion geproduceerd door splitsing van Ellman's reagens bij reactie met thiolen in niet-gevormde regio verspreidt over de hele gel. Non-patroon regio's lijken flauw geel met het blote oog; voor betere resolutie en kleinere onderdelen, vergroting (bijvoorbeeld, gebruik van een microscoop) vereist.
  2. Visualisatie van Photopatterns met fluorescente peptiden (Figuur 3B).
    1. Visualiseren patronen met een hogere resolutie of driedimensionaal, photopattern een AF488-gemodificeerde Pep1Alloc (of soortgelijke fluorescent peptide) aan de gels in stap 2,2.
    2. Afbeelding op een fluorescentiemicroscoop. Een confocale microscoop kan hier worden gebruikt om z-st nemenack beelden van de gel zodat het patroon kan worden waargenomen in de x-, y- en z-vlakken.
      OPMERKING: Bij fluorescentie moet gelen worden beschermd tegen licht tot de stabiliteit van de AF488 fluorofoor en maximale fluorescentie waarborgen. Gels niet direct moeten worden afgebeeld omdat de fluorescerende peptide redelijk stabiel indien beschermd tegen licht (opslag in een container verpakt in folie bij 4 ° C).

4. Cell Encapsulation in hydrogels en Photopatterning

  1. Verzamelen en voorbereiden van Cellen voor inkapseling.
    1. Na standaard steriele zoogdiercelcultuur procedures, trypsinize en het verzamelen van cellen van belang uit platen. Quench trypsine met groeimedium na onthechting optreedt (bijvoorbeeld een T-75 kolf 5 ml trypsine, blussen met 5 ml medium, spoel plaat met 5 ml medium voor totaal 15 ml).
      OPMERKING: trypsine kunnen variëren tussen celtypen maar meestal liggen tussen 5 en 15 minuten. Alternate cel detachment middelen (bijvoorbeeld Versene) worden gebruikt om cellen te verzamelen, indien gewenst.
    2. Aantal cellen (minimaal 100 of per protocol van de fabrikant) van fracties van de getrypsiniseerde celsuspensie met een hemocytometer of andere mobiele telinrichting tijdens centrifugeren van de celsuspensie volume (90-110 x g, 5 min). Resuspendeer celpellet na centrifugeren in een minimaal volume PBS of kweekmedium en opnieuw tellen als de eerste getrypsiniseerde celsuspensie te verdunnen is.
    3. Resuspendeer cellen in een minimaal volume PBS en verdund tot respectievelijk voor elke gel staat in microcentrifugebuizen zodat er zullen 5000 cellen / ul bij menging met de geloplossing (voorafgaand aan polymerisatie).
      OPMERKING: Typische cel monsters bevatten 300,000-500,000 cellen en zijn voldoende om 60-100 pl gel / celsuspensie die kunnen worden gebruikt voor 3-5 x 20 gl gels met 5000 cellen / pl te maken. Hogere of lagere celdichtheden worden gebruikt voor inkapseling, afhankelijk van de hoeveelheid van cel-celvs. celmatrix contact gewenst, respectievelijk, en moet worden bepaald voor elke toepassing.
    4. Centrifuge cel / PBS fracties (90-110 x g, 5 min).
    5. Zorgvuldig aspireren PBS van cel pellet in microcentrifugebuis vlak voor inkapseling.
      OPMERKING: Indien cellen gevoelig voor afschuifkrachten, kan de tweede centrifugatiestap worden geëlimineerd door het tellen (bijvoorbeeld hemocytometer) en vervolgens aliquotting de trypsine celsuspensie (trypsine + media + cellen) in porties nodig voor elke gel staat. Deze monsters worden eenmaal gecentrifugeerd (90-110 x g, 5 min) en de trypsine + media wordt afgezogen, waardoor een cel pellet voor inkapseling.
  2. Inkapselen van cellen in Non-patroon Hydrogels.
    1. Onmiddellijk na het opzuigen van PBS, opschorten gepelleteerde cellen in PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP en PBS + PS + FZ zoals berekend in het werkblad tot een uiteindelijke concentratie van 5000 cellen / l.
    2. Schimmel en polymeriseren hydrogels als descrIBED in de stappen 2.1.2 tot 2.1.6.
      OPMERKING: Bij het inkapselen van cellen in glasplaatje vormen, is voorzichtigheid geboden bij het verwijderen van de bovenste slede post-polymerisatie te voorkomen afschuiving van de gel, wat kan leiden tot celdood. Om de verwijdering van de gel uit de vorm kan glijden schimmels in steriele PBS of kweekmedium worden geplaatst na de polymerisatie om de pakking en hydrogel nat, waardoor het makkelijker om de bovenste slede verwijderen. Een methode om dit afschuiving geheel te voorkomen is door het gebruik van de spuit matrijzen.
    3. Rinse gels 3 x 10 min in groeimedium om niet-gereageerd soorten en overtollige LAP te verwijderen.
    4. Incubeer gels in groeimedium bij 37 ° C en 5% CO2 totdat het gewenste tijdstip voor verdere analyse. Vul medium elke 48 uur of zoals bepaald voor de toepassing (bv typisch voeden interval voor specifieke celtype en gemiddeld).
  3. Inkapselen van cellen en Photopatterning in de tegenwoordigheid van Cells.
    1. Onmiddellijk na aanzuigen PBS,schorsen gepelleteerde cellen in PEG4SH, Pep2Alloc, LAP en PBS + PS + FZ zoals berekend in het werkblad tot een uiteindelijke concentratie van 5000 cellen / ul. Laat een geschikte concentratie van vrije thiolen (bijvoorbeeld 2 mm) voor latere reactie met Pep1Alloc.
    2. Mold, polymeriseren, en het patroon hydrogels, zoals beschreven in de stappen 2.2.2 tot 2.2.8.
    3. Rinse gels 3 x 10 min in groeimedium na gestructureerd om niet-gereageerd soorten en overtollige LAP te verwijderen.
    4. Incubeer gels in groeimedium bij 37 ° C en 5% CO2 totdat het gewenste tijdstip voor verdere analyse. Vul medium elke 48 uur of zoals bepaald voor de toepassing.

5. Het bepalen van de levensvatbaarheid en metabole activiteit van ingekapselde cellen

  1. Live / Dead cytotoxiciteit Assay om Encapsulated Cell levensvatbaarheid (Figuur 4A) te bepalen.
    1. Verwijder groeimedium uit gels en spoel 3 x 15 min met PBS om diffusie van medium uit g toestaanels.
    2. Dooi levend / dode cytotoxiciteit meetoplossingen (ethidiumhomodimeer-1 en calceïne AM).
    3. Voeg 2 ul van 2 mM ethidium homodimeer-1 en 0,5 pl van de 4 mM calceïne AM oplossingen 1 ml steriel PBS. Vortex om een ​​volledige menging te garanderen.
    4. Voeg 300 gl kleuroplossing voor elke spuit schimmel gel in 48-well platen, of voldoende om het oppervlak van gel betrekking op een glasplaatje in een steriele schotel en incubeer gedurende 45 minuten.
    5. Verwijder overtollig kleuroplossing en spoel om overtollige kleurstof uit de gels (3 x 15 min met PBS) te verwijderen.
    6. Beeld op een confocale microscoop (z-stack beelden) of op een epi-fluorescentie microscoop met z-stack-functie op 10X en 488/525 nm Ex / Em. Kwantificeren van het aantal levensvatbare cellen door het projecteren van de z-stacks en tellen van het aantal levende (groen gehele cellichaam) en dode (rode nuclei) cellen met beeldverwerkingssoftware.
  2. Voer metabolische activiteit test om celactiviteit post-inkapseling te bepalen (Figure 4B).
    1. 24 uur voorafgaande aan testen, voer ingekapselde cellen met vers groeimedium.
      OPMERKING: medium toe aan een paar extra putten (die geen gels of gels zonder cellen) als controle (achtergrond lezingen).
    2. Op het moment bezienswaardigheid, ontdooien MTS reagens oplossing.
      Opmerking: Om de metabole activiteit te bepalen tijd, wordt een initieel tijdpunt (12-24 uur na inkapseling) aanbevolen als een referentie ter vergelijking met latere tijdstippen.
    3. Voeg MTS reagens aan elk putje (20 pl per 100 ul groeimedium).
    4. Incubeer monsters gedurende 1-4 uur bij 37 ° C en 5% CO 2, volgens de instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: Incubatietijden moet voldoende zijn voor cellen MTS verminderen en diffusie van het formazan product uit de gel. Bijgevolg kunnen dikkere gels zoals spuit gels langere incubatietijden (~ 4 uur) voor voldoende MTS reductie en diffusie vereisen.
    5. Pipet 100 ul verminderd MTS / Mediumnaar schone putjes van een 96-putjesplaat en opnemen absorptie bij 490 nm op een plaatlezer.
    6. Trek de achtergrondabsorptie voor putten zonder cellen van monster absorptiewaarden tot baseline absorptiewaarden genereren.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De opstelling en procedure voor cellen en vervolgens photopattern gels die ingekapselde cellen is in Figuur 1 photoencapsulate, en een voorbeeld voor het bereiden voorraadoplossingen vorming van een 10 gew% gel is opgenomen in tabel 1. Tabellen 1, de hoeveelheid monomeren (PEG4SH , Pep2Alloc, ± Pep1Alloc) en foto-initiator (LAP) nodig om hydrogels polymeriseren wordt berekend. Op basis van deze berekeningen, zijn voorraad oplossingen van PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc en LAP voorbereid en gemengd met en zonder Pep1Alloc voor het vormen en photopatterning gels, respectievelijk (figuur 1A). Vervolgens worden cellen verzameld uit platen, geteld en gecentrifugeerd in geschikte hoeveelheden inkapseling (Figuur 1B). De celpellet wordt opnieuw gesuspendeerd in gelvormende oplossing (peptide / polymeer / LAP in PBS) en cellen / monomeermengsels worden overgebracht naar glazen of spuit molds. De cellen zijn ingekapseld in de hydrogel bij toepassing van licht (1-5 minuten van 10 mW / cm2 bij 365 nm) (Figuur 1C). Voor photopatterning (figuur 1D), zijn gels doordrenkt met Pep1Alloc en LAP van 30 min tot 1 uur en 30 minuten, waardoor diffusie van peptide en initiator in de gepolymeriseerde matrix. Deze peptide-beladen gels zijn bedekt met fotomaskers met gewenste patronen en blootgesteld aan een tweede dosis licht (1 min) om de peptiden te conjugeren vrije thiolen in de matrix. Hanger aanbinden alleen covalent gebonden aan de gel in gebieden blootgesteld aan licht, vergemakkelijken juiste cel-matrix interacties en nabootsen belangrijke mechanische en biochemische eigenschappen van de natieve cel micro richting sonderen celfunctie en het lot in vitro.

Ellman's test biedt een gemakkelijke en goedkope methode om de gel modificatie en peptide integratie binnen photopatte kwantificerenrned substraten. Gevormd en non-gevormde gels (dat wil zeggen, gels met of zonder peptide modificatie) worden geweekt in reactie buffer post-polymerisatie Ellman's. Vervolgens worden cysteine normen en de gelen geweekt in buffer in 48-well platen geplaatst en geïncubeerd met Ellman's reagens (Figuur 2A, links). Na 1 uur 30 minuten worden monsters van monsters die in individuele putjes van een 96-putjesplaat en de absorbantie wordt opgenomen bij 405 nm. Een kalibratiecurve (Figuur 2A, rechts) vanaf het cysteïne normen uitgezet (absorptie versus concentratie lineaire fit), en de hoeveelheid vrije thiolen in gels kunnen worden bepaald op basis van de verdunningsfactor. Deze vrije thiol concentraties van verschillende polymerisatie en photopatterning omstandigheden van een 10 gew% gel worden getoond in figuur 2B. Gels gepolymeriseerd voor 1 of 5 min zonder Pep1Alloc (blauwe balken, I = 1 min en II = 5 min) hebben statistisch gezien een soortgelijke vrije thiol concentraties, met vermelding van thoed van een snelle reactie optreedt en gelering voltooid is binnen 1 min (tweezijdige t-test, p> 0,05). Zo hoeft extra blootstelling aan licht (2-5 minuten) niet tot verdere omzetting van functionele groepen. Gels gepolymeriseerd 1 min zonder Pep1Alloc doorweekt met Pep1Alloc (3 mg / ml) en LAP (2,2 mM) gedurende 30 en 90 minuten (groene balken, II = 30 min en IV = 90 min) en blootgesteld aan een tweede dosis licht gedurende 1 min. De afname van vrije thiolen (60-80% ten opzichte van de 1 min toestand) geeft doelmatige modificatie van gels hangers signalen onder deze omstandigheden. Als hogere modificatie gewenst is, kunnen verhoogde concentraties Pep1Alloc oplossing worden gebruikt als toegankelijkheid van Pep1Alloc aan vrije thiolen in meer verdunde oplossingen kunnen peptide omzetting beperken; bijvoorbeeld, hebben we gevonden dat concentraties tot 20 mg / ml Pep1Alloc produceren> 90% omzetting van vrije thiolen.

Uniek patronen van peptiden toegevoegd aan de hydrogel kansnel worden afgebeeld met Ellman's reagens (Figuur 3A, onder 5 min). Echter, visualisatie van het patroon verloren tijd (meer dan 5 min) vanwege diffusie van de gele TNB 2- dianion door de gel. Om beeldresolutie te verbeteren en observeren patronen in drie dimensies (x-, y- en z-vlakken) en in de aanwezigheid van cellen kunnen fluorescerend peptide toevoeging (AF488Pep1Alloc) worden gebruikt. In figuur 3B x-, y- en z-projecties van afbeeldingsstapels genomen met een confocale microscoop getoond, demonstreren patroon Resolutie (urn schaal).

Ongeveer (94 ± 2)% en (94 ± 1)% van hMSCs ingekapseld in afbreekbare gels (Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) levensvatbaar blijven (groen cellichamen) 1 en 6 dagen na inkapseling, respectievelijk met weinig dode cellen (rode nuclei ) waargenomen (figuur 4A). Verder hMSC spreiding wordt waargenomen na 6 dagen na inkapseling ( rong> Figuur 4A, bijvoegsel), wat aangeeft dat cellen kunnen verbouwen en interactie met deze MMP afbreekbare matrices gemodificeerd met integrine-bindende RGDS. Metabolische activiteit assays uitgevoerd op cellen ingekapseld in niet-afbreekbare gelen (Pep2Alloc = RGKGRK) 1 en 3 dagen na de inkapseling (Figuur 4B) een tweede maatregel van de levensvatbaarheid van de cellen en aantonen dat de cellen actief is voor de geteste met diverse photoencapsulation en photopatterning voorwaarden blijven Ellman's test (figuur 2B). Met name is er geen significant verschil in metabolische activiteit tussen 30 min en 90 min incubatie met Pep1Alloc + LAP (voorwaarden III en IV) en de eerste inkapseling (voorwaarden I en II), wat aangeeft dat de procedure geschikt is voor toepassingen van photopatterning in is de aanwezigheid van ingekapselde cellen (tweezijdige t-test, p> 0,05).

2fig1.jpg "/>
Figuur 1:. Setup voor het inkapselen van cellen in hydrogels en vervolgens photopatterning met biochemische cue (A) Stock oplossingen van macromeren en de foto-initiator worden bereid en gemengd (PEG4SH = backbone, Pep2Alloc = crosslink, Pep1Alloc = hanger lijm groep (RGDS), LAP = foto-initiator ). (B) De cellen worden verzameld voor inkapseling. (C) Cellen worden macromeren gemengd met oplossingen zonder of met integrine-bindende peptiden (PEG4SH / Pep2Alloc / LAP of PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP respectievelijk) en worden ingekapseld bij blootstelling aan licht. (D) Gels bevatten overmaat thiol groepen tijdens gelvorming (hier, PEG4SH / Pep2Alloc / LAP, gevormd met 2 mM overmaat thiol) kan worden gevormd met biochemische signalen door de latere toevoeging van peptiden gefunctionaliseerd met een enkele Alloc groep (Pep1Alloc, bijvoorbeeld, RGDS, IKVAV, etc.) om celhechting te bevorderenbinnen specifieke gebieden van de gel. Hier, het vormen van de gels met fluorescent gelabelde RGDS wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-1
Figuur 2:. Kwantitatieve Ellman's test opzet en resultaten modificatie van gevormde hydrogels evalueren (A) Gels en cysteine normen geïncubeerd in 48-well platen met Ellman's reagens. Een lineaire ijkcurve uitgezet cysteïne concentratie bepalen gelmonsters. (B) Overtollige vrije thiolen worden opgenomen in hydrogels tijdens gelvorming en geconsumeerd bij patroonvorming met een hanger Alloc-peptide (I = 1 min polymerisatie; II = 5 min polymerisatie; III = 30 min incubatie met Pep1Alloc; IV = 90 min incubatie wi th Pep1Alloc; zowel III en IV gepolymeriseerd en gedessineerde met licht voor 1 min). De getoonde gegevens illustreren de gemiddelde (n = 3) met fout bars met de standaard fout. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 3:. Ellman's test en fluorescerende beelden naar photopatterned hydrogels visualiseren (A) Ellman's reagens kan worden gebruikt om snel patronen (lijnen) in de x- en y-vlakken (geel = unpatterned regio Schaal bar = 1 mm) te detecteren. (B) Fluorescente peptiden kunnen worden gebruikt om patronen te ontdekken in de x-, y- en z-vlakken (groen = gevormde regio; 200 urn schaalbalk, 10X water dompelen doelstelling; Ex / Em 488/525 nm).large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
. Figuur 4: Leefbaarheid en metabole activiteit van cellen in niet-afbreekbare photopatterned hydrogels (A) Voorbeeld confocale z-stack (z-projectie, 10X water dompelen objectief) van levensvatbare (groen; Ex / Em 488/525 nm) en dode hMSCs (rood; Ex / Em 543/580 nm) ingekapseld in hydrogels 24 uur na inkapseling (Schaal bar = 200 pm). Cellen verspreid binnen deze hydrogels 6 dagen na (afbeelding bijvoegsel, Schaal bar = 50 pm) inkapseling. (B) De cellen zijn metabolisch actief 1 en 3 dagen (donker en licht bars, respectievelijk) post-inkapseling voor de verschillende polymerisatie (I = 1 min polymerisatie; II = 5 min polymerisatie) en patroonvorming omstandigheden (III = 30 min incubatie met Pep1Alloc ; IV = 90 min broen met Pep1Alloc; zowel gepolymeriseerd en gedessineerde met licht voor 1 min). De getoonde gegevens illustreren de gemiddelde (n = 3) met fout bars met de standaard fout. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Tabel 1: Voorbeeld setup te bepalen hoeveel voorraad oplossingen te berekenen voor het maken van hydrogels cellen in de spreadsheet die blauw zijn gemarkeerd geven de gebruiker gedefinieerde parameters;. de overige hoeveelheden worden berekend op basis van deze instellingen. De laatste volumes voor elke voorraad oplossing om een ​​gel te worden gemarkeerd oranje. De witte bloedcellen bevatten formules voor de laatste delen op basis van door de gebruiker gedefinieerde parameters berekenen. Merk op dat een concentratie van 2,2 mM LAP is gelijk aan 0,067 gew%.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De procedure hier gepresenteerde demonstreert technieken om cellen photoencapsulate binnen hydrogels gevormd door thiol-een klik chemie en vervolgens photopattern de gels met biochemische signalen. Het gebruik van licht aanvankelijk vormen hydrogels maakt homogene vermenging en suspensie van de cellen in de polymeeroplossing voorafgaande aan polymerisatie. Snelle polymerisatie "sluizen" de gel in de vorm van de gedefinieerde vorm en inkapselt gesuspendeerde cellen in de hydrogel netwerk. Gels kunnen ook worden gevormd in een groot aantal verschillende vormen (bijvoorbeeld, glasplaatjes of spuittips) afhankelijk van de gewenste eindtoepassing. Cellen ingekapseld voor 3D cultuur hydrogels gehecht aan glazen plaatjes zijn bijzonder nuttig voor beeldvorming toepassingen lichte vermindering is beperkt tot een dun monster. Injectiespuit mallen kunnen worden gebruikt voor snelle inkapselen van cellen, waardoor een groter aantal monsters te bereiden in een korte tijd (ten opzichte glasplaatjeB) die kan worden gebruikt voor experimenten die grote aantallen cellen zoals flowcytometrie of qPCR. Vervolgens deze gels kunnen vervolgens worden gevormd met biochemische signalen om gewenste cellulaire responsen zoals differentiatie of invasie te wekken. 30,31

Testen op levensvatbaarheid en de metabolische activiteit geven de overleving van cellen voor het materiaalsysteem en patroonvorming omstandigheden gepresenteerd. Merk op dat metabole activiteit werd gevolgd tot dag 3 in niet-afbreekbare gels (RGKGRK verknopen peptide) aan de eerste effecten van polymerisatie en patroonvorming voorwaarden celfunctie beoordelen. Daarnaast is er een membraan integriteit assay (live / dead levensvatbaarheid / cytotoxiciteit kleuring) van hMSCs op 1 en 6 dagen na de inkapseling in gels geformuleerd met een afbreekbare peptide crosslink (GPQGIWGQ) ondersteunt dat cellen levensvatbaar en verspreiden zich over 1 week in de cultuur blijven. De levensvatbaarheid van additionele cellijnen gerapporteerd voor photopatterning omstandigheden 32 vergelijkbaar met dehier wordt gebruikt en kan worden gecontroleerd op de beschreven hydrogelenysteem met levende / dode vlekken en metabolische activiteit assays. Hoewel we geen problemen met de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van deze materialen systeem en de bijbehorende procedures (4.2 en 4.3) hebben opgemerkt, kunnen sommige celtypen gevoelig voor vrije radicalen en / of blootstelling aan licht zijn. In dat geval kunnen gebruikers overwegen niet photoinitiated materiaalsystemen, zoals azide-alkyn, FXIII 12, 31 of Diels-based hydrogel vorming chemie. 33

Facile technieken voor het detecteren en kwantificeren patroonvorming van biochemische signalen binnen gels ook gepresenteerd (3,1 en 3,2). Ellman's test is van bijzonder belang omdat de reagentia zijn commercieel verkrijgbaar en zonder extra synthetische bewerkingsstappen of duurdere reagentia (bijvoorbeeld fluorescentie-gemerkt peptide) vereist. Ellman's test kan worden gebruikt voor de modificatie van vrije thiolen precies te bepalen biochemische signalen onder different photopatterning omstandigheden en snel patronen visualiseren. Voor het kwantificeren van peptide opname, de thiol functionele groep concentratie voor en na het vormen, als een kwantitatieve maat peptide opname, direct beoordeeld met Ellman bepaling. Hoewel dergelijke kwantificering kan met fluorescent gelabelde peptiden, 34-beeldvorming kwantificering vereist tijdrovende behandeling en analysestappen (bijvoorbeeld, synthese van een fluorescentie-gemerkt peptide en het genereren van een kalibratiecurve te relateren fluorescentie peptideconcentratie met behulp van beeldanalyse). Voor grafische peptide bijmenging kan Ellman's reagens direct toegepast op monsters onmiddellijk zichtbaar. Terwijl beperkt tot de x- en y-vlakken op patroon visualisatie, kan de techniek worden gebruikt als een eenvoudige, routinematige werkwijze om te bepalen of matrices die vrije thiolgroepen zijn gevormd. Het is belangrijk op te merken dat de Ellman bepaling niet considered cytocompatible, dus terwijl het kan worden gebruikt om photopatterns observeren en te kwantificeren, kan niet worden uitgevoerd in de aanwezigheid van cellen. Voor beeldvorming patronen driedimensionaal en in aanwezigheid van cellen, de conjugatie van fluorescente peptiden binnen hydrogel matrices blijft een krachtige en veel gebruikte aanpak. Resolutie van patronen kan worden geëvalueerd in de x-, y- en z-vlakken met behulp van confocale microscopie en deze methode is cytocompatible zodat cellen in gevormde gebieden of niet-gevormde gebieden kunnen worden geïdentificeerd. Bij elkaar genomen, Ellman's test en imaging-gebaseerde technieken zijn aanvullende instrumenten voor onderzoekers om zowel kwantitatief als kwalitatief beoordelen van de photopatterning van biochemische signalen binnen het materiaal systeem.

Photoclick of ruimer photoinitiated, chemische werkwijzen voor de vorming en aanpassing van hydrogelen in aanwezigheid van cellen zijn talrijk. Het gieten, inkapseling en patroonvormende technieken die hier niet limperkt tot de beschreven materiaalsysteem en kunnen worden toegepast op andere licht gebaseerde chemie, zoals thiol-alkyn, 35 azide-alkyn, 4 en andere thiol-een chemie (bijvoorbeeld thiol-norborneen), 10,13 en met verschillende fotoinitiatoren, zoals Irgacure 2959, Eosine Y, en kamferchinon. Let op, kunnen gebruikers moeten procedure parameters aan te passen (bijvoorbeeld incubatietijden, polymerisatie tijden, celdichtheid) ervoor te zorgen dat de omstandigheden cytocompatible voor deze andere systemen blijven. Aangezien het patroonvormende proces van de diffusie-Alloc gemodificeerde peptide (n) vereist in de hydrogel (2.2.3-2.2.5), kan dit proces blijken het meest nuttig voor het toevoegen van integrine-bindende groepen (bijvoorbeeld peptiden of extracellulaire matrix eiwit fragmenten) aan de hydrogel, waarbij binding van de ligand aan het netwerk vereist is voor het genereren van trekkrachten van de cel en volledige integrine activering. 36 Noot voor biomoleculen die alis eveneens actief in oplossing of na immobilisatie (bijvoorbeeld groeifactoren of cytokinen), kan de incubatiestap eenheid diffusie (~ 1 uur) in de hydrogel tot signaleringsgebeurtenissen die patronen resultaten convoluut. Andere methoden zijn vastgesteld voor groeifactor immobilisatie of lokale opslag voor hun patronen. 37-39 Bovendien patroon resolutie wordt bepaald door de controle over de blootstelling aan licht. Hier, fotomaskers Maken van patronen door de gel diepte en in de x- en y-vlakken; echter kunnen grotere ruimtelijke controle patroonvorming van biochemische signalen binnen gels worden bereikt met alternatieve bestraling zoals het gebruik van een twee-foton confocale microscoop om patronen in de x-, y- en z-vlakken te genereren. 34,40 Tenslotte moet worden opgemerkt dat hoewel het materiaalsysteem gebruikt binnen deze procedure alleen initieel gemodificeerd met biochemische signalen, kan orthogonale Photoclick chemie worden gebruikt om alte toestaanrantsoenen in matrix eigenschappen in de tijd. 12 De procedure en de hier gepresenteerde technieken toe te voegen diversiteit aan de huidige aanpak voor het maken van synthetische matrices met goed gedefinieerde en spatiotemporeel-gecontroleerde eigenschappen. In het bijzonder zal de commerciële beschikbaarheid van reagentia en materialen die in deze werkwijze bruikbaar voor een groot aantal onderzoekers geïnteresseerd in het gebruik van hydrogel gebaseerde biomaterialen voor toepassing in gecontroleerde celkweek zijn.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Delaware COBRE programma's in Drug Discovery en in Advanced Biomaterials gefinancierd door Institutional Development Awards van het Nationaal Instituut voor Generals Medische Wetenschappen aan de National Institutes of Health (P20GM104316 en P30 GM110758-01, respectievelijk), de Pew Charitable Trusts (00026178), een National Science Foundation Career Award (DMR-1253906), de Burroughs Wellcome Fonds (1.006.787) en de National Science Foundation IGERT SBE2 programma aan de Universiteit van Delaware (fellowship aan L. Sawicki). De auteurs danken de Delaware Biotechnology Institute Bio-imaging Center aan de Universiteit van Delaware voor de opleiding en de toegang tot confocale microscopie, mevrouw Katherine Wiley voor begeleiding tijdens de video-shoot, de heer Matthew Rehmann voor royaal verstrekken hMSCs geïsoleerd uit beenmerg, Prof. Christopher J . Kloxin en de heer Stephen Ma voor royaal verstrekken van fotomaskers, en Prof. Wilfred Chen voor het gebruik van de geautomatiseerde plaatlezer.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Custom PeptidesVarious Vendors----Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep.
4-arm PEG Thiol, MW 20kJenKem USA4ARM-SHListed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced.
Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinateColorado Photopolymer SolutionsLi-TPO
Dimethyl PhenylphosphoniteSigma Aldrich149470Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
2,4,6-Trimethylbenzoyl ChlorideSigma Aldrich682519Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Lithium BromideSigma Aldrich213225
2-ButanoneSigma Aldrich360473
Flask, Round Bottom, 100 mlChemglassCG-1506-05
80 ml Filter Funnel, Buchner, Medium FritChemglassCG-1402-L-02Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired.
Magnetic Stir BarsVarious Vendors----
Magnetic Stirring and Hot PlateVarious Vendors----
Vacuum DessicatorVarious Vendors----
Deuterium OxideAcros Organics16630
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineThermoFisher Scientific14190-250
Penicillin StreptomycinThermoFisher Scientific15070-063
FungizoneThermoFisher Scientific15290-018
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol redThermoFisher Scientific15400-054Select appropriate medium and trypsin depending on cell type.
Microcentrifuge tubesVarious Vendors----1.5 or 2 ml sizes, sterile.
BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle)Fisher Scientific14-823-16HProduct number listed here is for a 1 ml syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX).
Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope SlidesFisher Scientific12-544-1
High-Purity Silicone Rubber, 0.010" Thick, 6" x 8" Sheet, 55A Durometer (Gasket)McMaster Carr87315K62
Ethanol, 200 ProofDecon Labs2701
RainX, OriginalAmazon800002243May be purchased from other vendors.
SigmacoteSigma AldrichSL2
PhotomasksAdvance Reproductions Corporation----Photomask Division, different designs may be printed as desired.
DTNB; Ellman's Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)ThermoFisher ScientificPI-22582
Sodium Phosphate DibasicSigma AldrichS5136
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma AldrichE6758
Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACSFisher ScientificS318
Orthophosphoric AcidAlfa Aesar33266
Cysteine Hydrochloride MonohydrateSigma AldrichC7880
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cellsThermoFisher ScientificL-3224
CellTiter 96 Aqueous One Solution AssayPromegaG3582
CentrifugeVarious Vendors----Capable of speeds at 90-110 x g.
Multiwell Plate ReaderVarious Vendors----Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate.
Epifluorescent or Confocal MicroscopeVarious Vendors----To visualize peptide patterns and cells within hydrogels.
Omnicure Exfo Series 2000Excelitas Technologies----Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels.
Zeiss Zen Lite SoftwareZeiss----Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes
ImageJNIH----Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chemie - Int Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).
  2. Xi, W., Scott, T. F., Kloxin, C. J., Bowman, C. N. Click Chemistry in Materials Science. Adv Funct Mater. 24 (18), 2572-2590 (2014).
  3. Azagarsamy, M. A., Anseth, K. S. Bioorthogonal click chemistry: An indispensable tool to create multifaceted cell culture scaffolds. ACS Macro Lett. 2 (1), 5-9 (2013).
  4. Adzima, B. J., Tao, Y., Kloxin, C. J., DeForest, C. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. Spatial and temporal control of the alkyne-azide cycloaddition by photoinitiated Cu(II) reduction. Nat Chem. 3 (3), 256-259 (2011).
  5. Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew Chemie - Int Ed. 49 (9), 1540-1573 (2010).
  6. Fan, Y., Deng, C., Cheng, R., Meng, F., Zhong, Z. In situ forming hydrogels via catalyst-free and bioorthogonal "tetrazole-Alkene" photo-click chemistry. Biomacromolecules. 14 (8), 2814-2821 (2013).
  7. Burdick, J. A., Murphy, W. L. Moving from static to dynamic complexity in hydrogel design. Nat Commun. 3, 1269(2012).
  8. Rehmann, M. S., Kloxin, A. M. Tunable and dynamic soft materials for three-dimensional cell culture. Soft Matter. 9 (29), 6737-6746 (2013).
  9. Yang, T., Long, H., Malkoch, M., Gamstedt, K. E., Berglund, L., Hult, A. Characterization of well-defined poly(ethylene glycol) hydrogels prepared by thiol-ene chemistry. J Polym Sci Part A Polym Chem. 49 (18), 4044-4054 (2011).
  10. Fairbanks, B. D., et al. A versatile synthetic extracellular matrix mimic via thiol-norbornene photopolymerization. Adv Mater. 21 (48), 5005-5010 (2009).
  11. Roberts, J. J., Bryant, S. J. Comparison of photopolymerizable thiol-ene PEG and acrylate-based PEG hydrogels for cartilage development. Biomaterials. 34 (38), 9969-9979 (2013).
  12. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nat Mater. 8 (8), 659-664 (2009).
  13. Lin, C. C., Ki, C. S., Shih, H. Thiol-norbornene photoclick hydrogels for tissue engineering applications. J Appl Polym Sci. 132 (8), (2015).
  14. Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Design of thiol-ene photoclick hydrogels using facile techniques for cell culture applications. Biomater Sci. 2 (11), 1612-1626 (2014).
  15. Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).
  16. Fairbanks, B. D., Singh, S. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable, photoadaptable hydrogels via radical-mediated disulfide fragmentation reaction. Macromolecules. 44 (8), 2444-2450 (2011).
  17. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  18. Yang, F., et al. The effect of incorporating RGD adhesive peptide in polyethylene glycol diacrylate hydrogel on osteogenesis of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 26 (30), 5991-5998 (2005).
  19. Wacker, B. K., et al. Endothelial cell migration on RGD-peptide-containing PEG hydrogels in the presence of sphingosine 1-phosphate. Biophys J. 94 (1), 273-285 (2008).
  20. Wilson, M. J., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Murphy, W. L., Nealey, P. F. Hydrogels with well-defined peptide-hydrogel spacing and concentration: impact on epithelial cell behavior. Soft Matter. 8 (2), 390-398 (2012).
  21. Qiong Liu, S., et al. Injectable biodegradable polyethylene glycol/ RGD peptide hybrid hydrogels for in vitro chondrogenesis of human mesenchymal stern cellsa. Macromol Rapid Commun. 31 (13), 1148-1154 (2010).
  22. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  23. Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3 (3), 299-306 (2007).
  24. Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32 (36), 9685-9695 (2011).
  25. Khetan, S., Burdick, J. Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering. J Vis Exp. (32), e1590(2009).
  26. Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro. J Biomater Sci Polym Ed. 11 (5), 439-457 (2000).
  27. Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks. Society. 6 (1), 386-391 (2005).
  28. Marsano, E., Gagliardi, S., Ghioni, F., Bianchi, E. Behaviour of gels based on (hydroxypropyl) cellulose methacrylate. Polymer (Guildf). 41 (21), 7691-7698 (2000).
  29. Bryant, S. J., Anseth, K. S. Photopolymerization of Hydrogel Scaffolds. Scaffolding Tissue Eng. , 71-90 (2005).
  30. Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7 (3), 830-838 (2011).
  31. Mosiewicz, K. A., et al. In situ cell manipulation through enzymatic hydrogel photopatterning. Nat Mater. 12 (11), 1072-1078 (2013).
  32. Williams, C. G., Malik, A. N., Kim, T. K., Manson, P. N., Elisseeff, J. H. Variable cytocompatibility of six cell lines with photoinitiators used for polymerizing hydrogels and cell encapsulation. Biomaterials. 26 (11), 1211-1218 (2005).
  33. Nimmo, C. M., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Diels - Alder Click Cross-Linked Hyaluronic Acid Hydrogels for Tissue Engineering. , 824-830 (2011).
  34. DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
  35. Fairbanks, B. D., Sims, E. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. Reaction rates and mechanisms for radical, photoinitated addition of thiols to alkynes, and implications for thiol-yne photopolymerizations and click reactions. Macromolecules. 43 (9), 4113-4119 (2010).
  36. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  37. Wylie, R. G., et al. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
  38. Pompe, T., Salchert, K., Alberti, K., Zandstra, P., Werner, C. Immobilization of growth factors on solid supports for the modulation of stem cell fate. Nat Protoc. 5 (6), 1042-1050 (2010).
  39. Hudalla, G. A., Murphy, W. L. Biomaterials that regulate growth factor activity via bioinspired interactions. Adv Funct Mater. 21 (10), 1754-1768 (2011).
  40. Lee, S. H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lichtgemedieerde hydrogelsthiol een fotoclickcelincapsulatiefotopatterning van hydrogelshydrogelvormingPEG gebaseerde hydrogelskwantificering van vrije thiolenEllman reagensanalyseconfocale microscopiehumane mesenchymale stamcellen

Gerelateerde artikelen