Laser-assisted Cytoplasmatische Micro-injectie in Livestock Zygotes

Samenvatting

Dit protocol laat zien hoe cytoplasmatische micro-injectie in zygoten van boerderijdieren kan worden uitgevoerd. Deze techniek kan worden gebruikt om elke oplossing in de eencellige embryo te brengen, zoals genoombewerkingstools om knock-out dieren te genereren.

Samenvatting

Cytoplasmatische micro-injectie in eencellig-embryo's is een zeer krachtige techniek. Als voorbeeld, maakt het de levering van genoombewerkingstools mogelijk die genetische modificaties kunnen creëren die aanwezig zullen zijn in elke cel van een volwassen organisme. Het kan ook worden gebruikt om siRNA, mRNA's of blokkerende antilichamen af te leveren om genfunctie in preimplantatie-embryo's te bestuderen. De conventionele techniek voor het micro-injecteren van embryo's die bij knaagdieren wordt gebruikt, bestaat uit een zeer dunne micropipet die rechtstreeks het plasmamembraan penetreert wanneer deze in het embryo wordt voortgeduwd. Wanneer deze techniek wordt toegepast op vee, resulteert dit meestal in een lage efficiëntie. Dit komt voornamelijk omdat in tegenstelling tot muizen en ratten, bovine, ovine en porcine zygoten een zeer donker cytoplasma en een zeer elastisch plasmamembraan hebben, waardoor visualisatie tijdens injectie en penetratie van het plasmamembraan moeilijk te bereiken is. In dit protocol beschrijven we een geschikte micro-injectiemethode voor de aflevering van oplossingen in het cytoplasma van runder-zygoten die ook succesvol is gebleken voor schapen- en varkensembryo's. Eerst wordt een laser gebruikt om een gat in de zona pellucida te maken. Vervolgens wordt een stomp eind glas micropipet door het gat geïntroduceerd en geavanceerd tot de punt van de naald ongeveer 3/4 in het embryo bereikt. Dan wordt het plasmamembraan gebroken door aspiratie van cytoplasmatisch materiaal in de naald. Ten slotte wordt het afgezogen cytoplasmatisch materiaal gevolgd door de oplossing van belang, teruggeïnjecteerd in het embryonale cytoplasma. Dit protocol is met succes gebruikt voor de aflevering van verschillende oplossingen in boviene en ovine zygoten met 100% efficiëntie, minimale lysis en normale blastocysten ontwikkelingssnelheden.

Inleiding

Cytoplasmatische micro-injectie van 1-cel embryo is een zeer krachtige techniek. Het kan worden gebruikt voor het afleveren van elke oplossing in het embryo, bijvoorbeeld, produceren gen knock-outs voor bestudering van genfunctie of gen aangepast dieren te genereren. De meeste landbouw-relevante boerderijdier zygoten hebben een zeer hoge vetzuursamenstelling dat hun cytoplasma ondoorzichtig en donker ¹ maakt. Ze hebben ook een vrij elastisch plasmamembraan (PM). Deze eigenschappen maken van micro-injectie met behulp van conventionele pronucleaire / cytoplasmatische injectie zoals gebruikt in knaagdieren uitdagende en vaak onnauwkeurig.

Protocol

1. Micropipet Production

1. injectie micropipet
   1. Plaats een borosilicaat glazen capillair (buitendiameter (OD): 1,0 mm, binnendiameter (ID): 0,75 mm) in een micropipet trekker (in het midden van de houders rechter en linker capillaire) en vergrendelen.
   2. Gebruik een geschikte programma om de glazen capillair trekken, zodat het resulteert in een dunne tip met een lange tapper. (Voorbeeld: Heat: 825; Trek: 30; Velocity: 120; Tijd: 200; Pressure: 500).
   3. Haal de getrokken pipetten uit het apparaat en plaats het op een microforge in een horizontale positie.
   4. Breng de getrokken pipet en de microforge verwarming filament met zijn gl....

Resultaten

Laser-assisted cytoplasmatische microinjectie is een krachtige en betrouwbare protocol oplossingen in het cytoplasma van vee zygoten. Figuur 3 toont een algemeen overzicht van de zygoten voor en na injectie en de totale omtrek van de techniek. Dextran-rood wordt toegepast als injecteren oplossing volgstation van injectie en injectie efficiëntie en nauwkeurigheid mogelijk. Succesvolle levering van de oplossing is geïllustreerd in figuur 4 toont een recent.......

Discussie

Micro-injectie van zygoten is een bekende methode voor het introduceren van oplossingen in zoogdierlijke embryo. Bij sommige variaties afhankelijk van de soort en het doel van het experiment, kan deze techniek ruimer toegepast. We zien hoe intracytoplasmatische microinjectie uitvoeren aan laser naar de ingang van een stompe uiteinden micropipet staan. Zygoten van sommige diersoorten (zoals runderen, schapen en varkens) een donkere cytoplasma, belemmeren de visualisatie van de injectiepipet eenmaal in het embryo. Ook hun.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Glass capillary	Sutter instruments	B100-75-10	Deze capillairen worden gebruikt voor het maken van de houd- en injectiepipetten. Elke dik/standaardwandige borosilicaatbuis zonder gloeidraad kan worden gebruikt.
Microforge	Narishige	MF-9	Uitgerust met een 10X vergrotingslens.
Micromanipulator	Nikon/ Narishige	NT88-V3
Omgekeerde microscoop	Nikon	TE2000-U	Uitgerust met 4X, 20X lenzen en met een lasersysteem.
Laser	Research Instruments	7-47-500	Saturn 5 Active laser.
Microdispenser	Drummond	3-000-105	De microdispenser wordt gebruikt om de embryo's te verplaatsen. Een p10 pipet kan ook worden gebruikt, maar met zo min mogelijk volume.
100 x 15 mm kweekschaal	Falcon	351029	Gebruik het deksel van de schaal om de injectieplaat te maken, omdat ze lagere wanden hebben en het positioneren en verplaatsen van de micromanipulator gemakkelijker maken. Het deksel van een 60 mm kweekschaal kan ook worden gebruikt.
35 mm kweekschaal	Corning	430165	Deze schalen worden gebruikt voor het kweken van de embryo's in druppels van 50 µl bedekt met minerale olie. Alternatief kan ook een 4-kamerschaal worden gebruikt. Ongeacht de schotel die wordt gekozen om de embryo's te kweken, ze moeten altijd minstens 4 uur in de incubator worden geëquilibreerd voordat de embryo's erin worden overgebracht.
Incubator	Sanyo	MCO-19AIC	Elke incubator die kan worden ingesteld op 38,5 °C, 5% CO2-omstandigheden kan worden gebruikt.
Stereomicroscoop	Nikon	SMZ800	Gebruikt voor het visualiseren van de embryo's in de kweekdruppels en tijdens het wassen. Elke stereomicroscoop met een 10X vergroting kan worden gebruikt.
Control Unit HT	Minitube	12055/0400	Verwarmingssysteem bevestigd aan de stereomicroscoop.
Verwarmde microscooptafel	Minitube	12055/0003	Verwarmingssysteem bevestigd aan de stereomicroscoop.
Dextran-Red	Thermo Scientific	D1828	Een steriele oplossing van 10 mg/ml wordt gebruikt om te injecteren.
Minerale olie	sigma	M8410	Bewaar de minerale olie op kamertemperatuur en beschermd tegen licht met aluminiumfolie.
KSOMaa Evolve Bovine	Zenit	ZEBV-100	Aangevuld met 4 mg/ml BSA. KSOM-platen voor embryocultuur moeten minstens 4 uur in een incubator worden geëquilibreerd voor gebruik.
FBS	Gemini-Bio	100-525	Gebruik een stamcel gekwalificeerd FBS.
Zygoten			Zygoten worden geïnjecteerd 17 - 20 hpf en kunnen in-vitro- of in-vivo-afkomstig zijn.
NaCl	Sigma	S5886	Eindconcentratie: 107,7 mM. Component van SOF-HEPES medium.
KCl	Sigma	P5405	Eindconcentratie: 7,16 mM. Component van SOF-HEPES medium.
KH2PO4	Sigma	P5655	Eindconcentratie: 1,19 mM. Component van SOF-HEPES medium.
MgCl2 6H2O	Sigma	M2393	Eindconcentratie: 0,49 mM. Component van SOF-HEPES medium.
Natrium DL-lactaat	Sigma	L4263	Eindconcentratie: 5,3 mM. Component van SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2O	Sigma	C7902	Eindconcentratie: 1,71 mM. Component van SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose	Sigma	F3510	Eindconcentratie: 0,5 mM. Component van SOF-HEPES medium.
HEPES	Sigma	H4034	Eindconcentratie: 21 mM. Component van SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA	Sigma	M7145	Eindconcentratie: 1x. Component van SOF-HEPES medium.
BME-EAA	Sigma	B6766	Eindconcentratie: 1x. Component van SOF-HEPES medium.
NaHCO3	Sigma	S5761	Eindconcentratie: 4 mM. Component van SOF-HEPES medium.
Natriumpyruvaat	Sigma	P4562	Eindconcentratie: 0,33 mM. Component van SOF-HEPES medium.
Glutamax	Gibco	35050	Eindconcentratie: 1 mM. Component van SOF-HEPES medium.
BSA	Sigma	A-3311	Eindconcentratie: 1 mg/ml. Component van SOF-HEPES medium.
Gentamycine	Sigma	G-1397	Eindconcentratie: 5 µg/ml. Component van SOF-HEPES medium.
Water voor embryo-overdracht	Sigma	W1503	Component van SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium	Gemaakt in het lab		pH 7,3 - 7,4, 280 ± 10 mOs. Filter gesteriliseerd door een 22 µm filter kan 1 maand in de koelkast bij 4 °C worden bewaard. Warm in 37 °C waterbad voor gebruik.