Laser-assisted Cytoplasmatische Micro-injectie in Livestock Zygotes

Samenvatting

Dit protocol laat zien hoe cytoplasmatische micro-injectie in zygoten van boerderijdieren kan worden uitgevoerd. Deze techniek kan worden gebruikt om elke oplossing in de eencellige embryo te brengen, zoals genoombewerkingstools om knock-out dieren te genereren.

Samenvatting

Cytoplasmatische micro-injectie in eencellig-embryo's is een zeer krachtige techniek. Als voorbeeld, maakt het de levering van genoombewerkingstools mogelijk die genetische modificaties kunnen creëren die aanwezig zullen zijn in elke cel van een volwassen organisme. Het kan ook worden gebruikt om siRNA, mRNA's of blokkerende antilichamen af te leveren om genfunctie in preimplantatie-embryo's te bestuderen. De conventionele techniek voor het micro-injecteren van embryo's die bij knaagdieren wordt gebruikt, bestaat uit een zeer dunne micropipet die rechtstreeks het plasmamembraan penetreert wanneer deze in het embryo wordt voortgeduwd. Wanneer deze techniek wordt toegepast op vee, resulteert dit meestal in een lage efficiëntie. Dit komt voornamelijk omdat in tegenstelling tot muizen en ratten, bovine, ovine en porcine zygoten een zeer donker cytoplasma en een zeer elastisch plasmamembraan hebben, waardoor visualisatie tijdens injectie en penetratie van het plasmamembraan moeilijk te bereiken is. In dit protocol beschrijven we een geschikte micro-injectiemethode voor de aflevering van oplossingen in het cytoplasma van runder-zygoten die ook succesvol is gebleken voor schapen- en varkensembryo's. Eerst wordt een laser gebruikt om een gat in de zona pellucida te maken. Vervolgens wordt een stomp eind glas micropipet door het gat geïntroduceerd en geavanceerd tot de punt van de naald ongeveer 3/4 in het embryo bereikt. Dan wordt het plasmamembraan gebroken door aspiratie van cytoplasmatisch materiaal in de naald. Ten slotte wordt het afgezogen cytoplasmatisch materiaal gevolgd door de oplossing van belang, teruggeïnjecteerd in het embryonale cytoplasma. Dit protocol is met succes gebruikt voor de aflevering van verschillende oplossingen in boviene en ovine zygoten met 100% efficiëntie, minimale lysis en normale blastocysten ontwikkelingssnelheden.

Inleiding

Cytoplasmatische micro-injectie van 1-cel embryo is een zeer krachtige techniek. Het kan worden gebruikt voor het afleveren van elke oplossing in het embryo, bijvoorbeeld, produceren gen knock-outs voor bestudering van genfunctie of gen aangepast dieren te genereren. De meeste landbouw-relevante boerderijdier zygoten hebben een zeer hoge vetzuursamenstelling dat hun cytoplasma ondoorzichtig en donker ¹ maakt. Ze hebben ook een vrij elastisch plasmamembraan (PM). Deze eigenschappen maken van micro-injectie met behulp van conventionele pronucleaire / cytoplasmatische injectie zoals gebruikt in knaagdieren uitdagende en vaak onnauwkeurig.

Cytoplasmatische micro-injectie heeft voordelen ten opzichte pronucleaire microinjectie omdat het makkelijker uit te voeren en veroorzaakt ook minder schade aan de geïnjecteerde embryo, wat resulteert in hogere levensvatbaarheid ^2. Het algemene doel van dit protocol is om een ​​succesvolle methode te demonstreren voor het leveren van oplossingen in het cytoplasma van de boerderij dierlijke zygoten. Om te kunnen presterencytoplasmatische micro-injectie met een hoge efficiëntie op vee embryo wordt een laser gebruikt om een ​​gat in de zona pellucida (ZP) en vervolgens een stompe uiteinden glazen naald wordt gebruikt voor de micro-injectie genereren. Deze strategie is gericht op de mechanische schade afgedrukt op het embryo tijdens de injectie te verminderen. Vervolgens aspiratie cytoplasmatische inhoud binnen de injectienaald maakt een efficiënte en zekere breuk van de PM verzekeren dat de oplossing in het cytoplasma van de embryo wordt geleverd.

Deze techniek werd reeds met succes toegepast in runderembryo's naar siRNA geven in de zygotische cytoplasma ^3,4 en mutaties met de geclusterde regelmatig op afstand van elkaar korte palindroom repeats (CRISPR) / CRISPR systeemcomponent 9 (Cas9) systeem ⁵ genereren. Het is ook geschikt (met kleine wijzigingen) aan runder-cumulus ingesloten oöcyten ⁶ injecteren. Hier hebben we onze injectieprotocol leveren van een kleurstof beschreven, kunnen die welke voor het injecteren van elke des teIRED oplossing in de zygote, en laten zien dat met deze techniek geeft vrijwel geen lysis en heeft geen invloed op de vroege embryonale ontwikkeling.

Protocol

1. Micropipet Production

1. injectie micropipet
   1. Plaats een borosilicaat glazen capillair (buitendiameter (OD): 1,0 mm, binnendiameter (ID): 0,75 mm) in een micropipet trekker (in het midden van de houders rechter en linker capillaire) en vergrendelen.
   2. Gebruik een geschikte programma om de glazen capillair trekken, zodat het resulteert in een dunne tip met een lange tapper. (Voorbeeld: Heat: 825; Trek: 30; Velocity: 120; Tijd: 200; Pressure: 500).
   3. Haal de getrokken pipetten uit het apparaat en plaats het op een microforge in een horizontale positie.
   4. Breng de getrokken pipet en de microforge verwarming filament met zijn glazen kralen in beeld. Gebruik het oculair reticule tot de gewenste dikte te meten en zet de pipet horizontaal totdat het verhitterfilament het doel binnendiameter (5 pm) bereikt.
   5. Pas de warmte tot ongeveer 45% en voorzichtig breng de pipet naar beneden, zodat het de gloeidraad raakt. Activeer even de kachel. dit wziek enigszins smelt de pipet, zodat het voldoet aan de gloeidraad en bij afkoeling, zal de pipet te breken bij het contactpunt het genereren van een rechte snede.
      Opmerking: de juiste temperatuurinstelling sleutel in deze stap, omdat te hoge temperaturen de pipet bocht maakt en dus een rechte snede niet mogelijk en temperatuur te laag niet voldoende om de pipet (figuur 1A) smelten.
   6. Maak een geschatte hoek van 30 ° in de buurt van de pipet tip door het plaatsen van het ongeveer 10 micrometer uit de buurt van de verwarming filament. Stel de temperatuur in op 60% en de verwarming activeert.
      Opmerking: Dit zal de pipet buigen over de gloeidraad. Deze hoek is gewenst dat de punt van de naald parallel aan het oppervlak van de injectieplaat bij montage in de injector (Figuur 1B).
   7. Handvat micro-injectie pipetten met de nodige voorzichtigheid als ze zijn zeer scherp en kwetsbaar.
2. Holding micropipet
   1. Plaats een borosilicat glazen capillair (OD: 1,0 mm, ID: 0,75 mm) in een micropipet trekker (in het midden van de houders rechter en linker capillaire) en vergrendelen.
   2. Gebruik een geschikte programma om de glazen capillair trekken, zodat het resulteert in een dunne tip met een lange, zelfs taps en parallelle wanden (Voorbeeld: Heat: 815; Trek: 20; Velocity: 140; Tijd: 175; Pressure: 200).
   3. Haal de getrokken pipet uit de trekker apparaat en plaats het op de microforge houder in een horizontale positie. Pas de focus op de verwarming filament en pipet.
   4. Gebruik het oculair vizier naar de pipet diameter meten en beweeg de pipet totdat de diameter over de gloeidraad 180 pm bereikt.
   5. Op de aangegeven maten, merk de glazen capillair met een diamant tip pen, en dan zachtjes druk op de trok tip om het glas te breken. Dit moet resulteren in een rechte snede (figuur 1C).
   6. Verplaats de pipet om verticaal met de punt dicht bij de gloeidraad. Stel de temperatuur van de microforge tot 60%.
   7. Brand-polish de punt van de pipet met standaardtechnieken ⁷ tot deze een ID van 40 urn bereikt. Gebruik het oculair vizier om de ID (figuur 1D) te controleren.
   8. Maak een hoek op de pipet.
      1. Breng de pipet naar een horizontale positie ongeveer 10 urn van het filament en 5 mm van de punt. Stel de temperatuur tot ongeveer 60% en activeren van de verwarming de pipet via filament buigen. Verhit tot een gewenste hoek (ongeveer 30 ^°) bereikt. Controleer de hoek visueel (figuur 1E).
         Opmerking: De pipet is meestal gemonteerd op de microinjector in een hoek van circa 60 ^° ten opzichte van de bodem van de schotel injectie. De punt van de pipet wordt gebogen, zodat het evenwijdig aan de bodem van de schaal, die nodig is voor de juiste injectie van het embryo in het middenvlak is.

le "> 2. micromanipulator Setup

1. Controleer of de microinjectors volledig geladen met olie en dat er geen luchtbellen in het systeem (bellen in het microinjector voorkomen fijne controle van de injectie).
2. Controleer of de micromanipulators zijn in de middelste stand. Dit zal zorgen voor een breed scala van de beweging van de pipetten.
3. Plaats de pipet die in de micromanipulator houder linker en de injectie pipet in de juiste micromanipulation houder.
4. Laat de olie in de pipetten te gaan door capillaire werking en controleer of het systeem goed werkt door op en neer bewegen van olie in de pipet met behulp van de microinjector controles.
   Let op: Als er geen beweging van olie in de naalden, kan er een klomp te zijn. In dit geval, gebruik dan een nieuwe naald.
5. Gebruik de micromanipulator controles om de pipetten in het centrum van het gezichtsveld van de microscoop brengen. Met behulp van 4X vergroting, controleren of de micropipet tips zijn in de juiste hoek (parallel naar de bodem van de schaal).
   Opmerking: Een correcte opstelling van de naalden is de sleutel voor een succesvolle injectie en voor resultaten consistentie.
6. IJk het lasersysteem na kalibratie van de fabrikant handleiding.

3. Bereiding van Injectie Dish (figuur 2)

1. Plaats een 50 ul druppel verwarmd (37 ° C) SOF-HEPES (samenstelling beschreven in de paragraaf materialen) aangevuld met 20% foetaal runderserum (FBS) op het midden van het deksel van een 100 mm petrischaal. Plaats een 1-2 ul druppel van de oplossing te injecteren dicht bij de injectie druppel. Zorg ervoor dat de embryo's niet af te koelen onder de RT.
   Opmerking: In dit protocol zullen we de Dextran rode kleurstof toevoegen injectie oplossing kunnen de injectieplaats visualiseren en volgen later.
2. Bedek de druppels in de injectie plaat met behulp van ongeveer 10 ml van minerale olie.
3. Plaats de injectie schotel op het stadium van het omgekeerde microscoop en breng de pipEttes in de injectie druppel. Controleer of de naalden zijn in focus in de drop. Passen hun hoogte indien nodig met de micromanipulator controles.
4. Met een microdispenser, laadt ongeveer 20-30 zygoten (17-20 uur na bevruchting (HPF)) in de bovenzijde van de injectie druppel. Voer injectie op kamertemperatuur zodat het aantal embryo's in de druppel injectie wordt bepaald door de snelheid waarmee de persoon die kan injecteren. Niet meer embryo niet laden dan degene die in 30 minuten kan worden geïnjecteerd.
   1. Om de embryo's in de microdispenser te laden, op de zuiger volledig en dompel de punt in de oplossing die de embryo's. Raak de embryo's om te worden opgehaald met de punt van de glazen capillair (één op het moment) en langzaam los van de zuiger, zodat elk embryo komt in de capillaire. Herhaal dit totdat alle embryo's worden opgenomen of de microdispenser capaciteit is vol.
   2. Om de geladen embryo's vrij te geven, drukt u de zuiger voorzichtig tot het gehele volume containing de embryo vrijkomt uit het capillair.

4. Micro-injectie

1. Met behulp van de 4X doel, laadt u de oplossing in de injectie pipet worden geïnjecteerd door het toepassen van negatieve druk (opzuigen). Laad afdoende oplossing te injecteren 2-3 zygoten. Ga dan naar de injectie druppel.
2. Binnen de injectie drop, verplaatsen de holding pipet, zodat de tip komt dicht bij een zygote. Solliciteer negatieve druk (aspireren) samen met het bedrijf microinjector zodat de zygote wordt bevestigd aan het bedrijf pipet en wijziging van een 20x doelstelling.
3. Zodra de zygote het aanhouden pipet is bevestigd, controleert de kwaliteit ervan met behulp van het injecteren pipet om voorzichtig te bewegen het embryo zonder los te maken. Een goede kwaliteit zygote dienen beide polaire lichamen (hoewel soms slechts één zichtbaar) en een homogeen cytoplasma. Niet injecteren abnormale zygoten (figuur 3A).
4. Indien nodig, de positie van de embryo voor een goede injectielocatie. Een goede positionering zou zijn dat waar er enige ruimte tussen de ZP en PM, zodat de PM niet beschadigd door de laser.
5. Controleer of de injectiepipet wordt op het embryo middenvlak door voorzichtig de zygote op de injectieplaats raken. Als het niet op het middenvlak, de naald de neiging om het embryo te roteren in plaats van de punctie. De hoogte van de injectiepipet indien nodig.
6. Een gat in de ZP behulp van een laser (figuur 3B).
   1. Met de laser software plaats de laser dradenkruis in de ZP waar het gat wordt gemaakt (aan de kant waar het embryo tot het bedrijf pipet bevestigd). Met behulp van de laser controle venster klik op de vuurknop. Blijft de grootte van het gat groot genoeg is om een ​​opening in de ZP van de naald maken te passeren zonder schade aan de PM (Voorbeeld: 0,662 msec pulsduur / 6,9 um gat grootte).
7. Steek de injectienaalddoor het gat in de ZP en contact maken met de PM. Ga door het indrukken van de pipet naar voren totdat de naald is ¾ van de weg naar het embryo (Figuur 3C).
8. Op de positie van de meniscus bij de oplossing interfase-olie, omdat dit wordt gebruikt om consistent injectievolume regelen.
9. Toepassen onderdruk (aspiraat) op de injectie pipet, wat zal resulteren in PM en cytoplasma wordt ingeademd in de injectienaald. Doorgaan tot het verkeer van cytoplasma in de naald versnelt of wanneer cytoplasma inhoud mengen met injectieoplossing te zien. Deze zullen breuk van de PM (figuur 3D) te geven.
10. Injecteer terug de cytoplasmatische inhoud gevolgd door de oplossing in het cytoplasma van de zygote door toepassing van positieve druk (injecterende), totdat de meniscus aan de oplossing-olie interfase is geavanceerd equivalente diameter een zygote verleden uitgangspunt.
    Let op: Onder onze voorwaarden, deze vertegenwoordigt ongeveer 7 pl van geïnjecteerde oplossing (figuur 3E).
11. Wijziging van een 4X doelstelling en verplaats de geïnjecteerde embryo / s aan de onderkant van de injectie druppel. Laat het embryo door het toepassen van positieve druk op het bedrijf microinjector. Houd de niet-geïnjecteerde embryo's aan de bovenzijde en de geïnjecteerde die op de onderzijde van de druppel te helpen houden van de geïnjecteerde / niet-geïnjecteerde embryo en efficiënt werken.

5. Embryo Herstel en Injection Resultaten

1. Voeg 3 druppels van ongeveer 200 pi in een nieuwe schaal met voorverwarmd SOF-HEPES. Verzamel de geïnjecteerde embryo's met een microdispenser (zoals hierboven beschreven). Was de geïnjecteerde embryo's door ze te verplaatsen door middel van de 3 SOF-HEPES daalt.
2. Tel de embryo's gelyseerd tijdens micro-injectie en gooi ze weg.
   Opmerking: Een gelyseerd zygote kan gemakkelijk te onderscheiden van een intact zijn, want de eerste doorschijnende verschijnt, vul het hele ZP, en het heeft meestal cytoplasmainhoud lekken naar de buitenzijde van het embryo.
3. Optioneel, controleer dan de micro-injectie-efficiëntie met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Wees ervan bewust dat blootstelling aan UV-licht embryo schade die van invloed kan zijn verdere ontwikkeling kan induceren.
4. Cultuur groepen van 25 geïnjecteerde embryo's in 50 pl druppels kalium simplex optimalisatie medium (KSOM) aangevuld met 4 mg / ml runderserumalbumine (BSA) onder minerale olie bij 38,5 ° C, _5% CO2 in lucht en vocht tot verzadiging.
5. Vul het kweekmedium met 5% FBS twee dagen na de injectie.
6. Controleer blastocyst (BL) tarieven 7 dagen na de injectie. Bereken BL tarieven als het totale aantal blastocyst embryo's / totaal aantal embryo's gekweekt in die druppel.

Resultaten

Laser-assisted cytoplasmatische microinjectie is een krachtige en betrouwbare protocol oplossingen in het cytoplasma van vee zygoten. Figuur 3 toont een algemeen overzicht van de zygoten voor en na injectie en de totale omtrek van de techniek. Dextran-rood wordt toegepast als injecteren oplossing volgstation van injectie en injectie efficiëntie en nauwkeurigheid mogelijk. Succesvolle levering van de oplossing is geïllustreerd in figuur 4 toont een recent...

Discussie

Micro-injectie van zygoten is een bekende methode voor het introduceren van oplossingen in zoogdierlijke embryo. Bij sommige variaties afhankelijk van de soort en het doel van het experiment, kan deze techniek ruimer toegepast. We zien hoe intracytoplasmatische microinjectie uitvoeren aan laser naar de ingang van een stompe uiteinden micropipet staan. Zygoten van sommige diersoorten (zoals runderen, schapen en varkens) een donkere cytoplasma, belemmeren de visualisatie van de injectiepipet eenmaal in het embryo. Ook hun...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Glass capillary	Sutter instruments	B100-75-10	Deze capillairen worden gebruikt voor het maken van de houd- en injectiepipetten. Elke dik/standaardwandige borosilicaatbuis zonder gloeidraad kan worden gebruikt.
Microforge	Narishige	MF-9	Uitgerust met een 10X vergrotingslens.
Micromanipulator	Nikon/ Narishige	NT88-V3
Omgekeerde microscoop	Nikon	TE2000-U	Uitgerust met 4X, 20X lenzen en met een lasersysteem.
Laser	Research Instruments	7-47-500	Saturn 5 Active laser.
Microdispenser	Drummond	3-000-105	De microdispenser wordt gebruikt om de embryo's te verplaatsen. Een p10 pipet kan ook worden gebruikt, maar met zo min mogelijk volume.
100 x 15 mm kweekschaal	Falcon	351029	Gebruik het deksel van de schaal om de injectieplaat te maken, omdat ze lagere wanden hebben en het positioneren en verplaatsen van de micromanipulator gemakkelijker maken. Het deksel van een 60 mm kweekschaal kan ook worden gebruikt.
35 mm kweekschaal	Corning	430165	Deze schalen worden gebruikt voor het kweken van de embryo's in druppels van 50 µl bedekt met minerale olie. Alternatief kan ook een 4-kamerschaal worden gebruikt. Ongeacht de schotel die wordt gekozen om de embryo's te kweken, ze moeten altijd minstens 4 uur in de incubator worden geëquilibreerd voordat de embryo's erin worden overgebracht.
Incubator	Sanyo	MCO-19AIC	Elke incubator die kan worden ingesteld op 38,5 °C, 5% CO2-omstandigheden kan worden gebruikt.
Stereomicroscoop	Nikon	SMZ800	Gebruikt voor het visualiseren van de embryo's in de kweekdruppels en tijdens het wassen. Elke stereomicroscoop met een 10X vergroting kan worden gebruikt.
Control Unit HT	Minitube	12055/0400	Verwarmingssysteem bevestigd aan de stereomicroscoop.
Verwarmde microscooptafel	Minitube	12055/0003	Verwarmingssysteem bevestigd aan de stereomicroscoop.
Dextran-Red	Thermo Scientific	D1828	Een steriele oplossing van 10 mg/ml wordt gebruikt om te injecteren.
Minerale olie	sigma	M8410	Bewaar de minerale olie op kamertemperatuur en beschermd tegen licht met aluminiumfolie.
KSOMaa Evolve Bovine	Zenit	ZEBV-100	Aangevuld met 4 mg/ml BSA. KSOM-platen voor embryocultuur moeten minstens 4 uur in een incubator worden geëquilibreerd voor gebruik.
FBS	Gemini-Bio	100-525	Gebruik een stamcel gekwalificeerd FBS.
Zygoten			Zygoten worden geïnjecteerd 17 - 20 hpf en kunnen in-vitro- of in-vivo-afkomstig zijn.
NaCl	Sigma	S5886	Eindconcentratie: 107,7 mM. Component van SOF-HEPES medium.
KCl	Sigma	P5405	Eindconcentratie: 7,16 mM. Component van SOF-HEPES medium.
KH2PO4	Sigma	P5655	Eindconcentratie: 1,19 mM. Component van SOF-HEPES medium.
MgCl2 6H2O	Sigma	M2393	Eindconcentratie: 0,49 mM. Component van SOF-HEPES medium.
Natrium DL-lactaat	Sigma	L4263	Eindconcentratie: 5,3 mM. Component van SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2O	Sigma	C7902	Eindconcentratie: 1,71 mM. Component van SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose	Sigma	F3510	Eindconcentratie: 0,5 mM. Component van SOF-HEPES medium.
HEPES	Sigma	H4034	Eindconcentratie: 21 mM. Component van SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA	Sigma	M7145	Eindconcentratie: 1x. Component van SOF-HEPES medium.
BME-EAA	Sigma	B6766	Eindconcentratie: 1x. Component van SOF-HEPES medium.
NaHCO3	Sigma	S5761	Eindconcentratie: 4 mM. Component van SOF-HEPES medium.
Natriumpyruvaat	Sigma	P4562	Eindconcentratie: 0,33 mM. Component van SOF-HEPES medium.
Glutamax	Gibco	35050	Eindconcentratie: 1 mM. Component van SOF-HEPES medium.
BSA	Sigma	A-3311	Eindconcentratie: 1 mg/ml. Component van SOF-HEPES medium.
Gentamycine	Sigma	G-1397	Eindconcentratie: 5 µg/ml. Component van SOF-HEPES medium.
Water voor embryo-overdracht	Sigma	W1503	Component van SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium	Gemaakt in het lab		pH 7,3 - 7,4, 280 ± 10 mOs. Filter gesteriliseerd door een 22 µm filter kan 1 maand in de koelkast bij 4 °C worden bewaard. Warm in 37 °C waterbad voor gebruik.