Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

High-throughput, Multi-Beeld Cryohistology gemineraliseerde weefsels

16K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54468

⸱

14 september 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Reconstructive Sciences, University of Connecticut Health Center, 2Department of Computer Science and Engineering, University of Connecticut, 3Department of Orthopaedic Surgery, University of Connecticut Health Center, 4Department of Orthopaedics, University of Rochester

In dit artikel

Samenvatting

In dit manuscript presenteren we een hoogdoorvoerige, semi-geautomatiseerde cryohistologieplatform om gealignde composietbeelden te produceren van meerdere responsmaatregelen uit verschillende rondes van fluorescentiebeeldvorming op bevroren secties van gemineraliseerde weefsels.

Samenvatting

Er is een toenemende behoefte aan efficiënt fenotypering en histopathologie van verschillende weefsels. Deze behoefte aan fenotypering is duidelijk met de ambitieuze projecten om elk gen in het muizengenoom te verstoren. De onderzoeksgemeenschap heeft snelle en goedkope middelen nodig om weefsels via histologie te fenotyperen. Histologische analyses van skeletweefsels zijn vaak tijdrovend en op zijn best semi-kwantitatief, en vereisen regelmatig subjectieve interpretatie van dia's door getrainde personen. Hier presenteren we een cryohistologisch paradigma voor efficiënte en goedkope fenotypering van gemineraliseerde weefsels. Ten eerste presenteren we een nieuwe methode van tape-gestabiliseerde cryosectionering die de morfologie van gemineraliseerde weefsels behoudt. Deze secties worden vervolgens stijf op glazen dia's geplakt en herhaaldelijk geïmagineerd over verschillende rondes van kleuring. De resulterende beelden worden vervolgens handmatig of via computersoftware uitgelijnd om samengestelde stapels van verschillende gelaagde beelden op te leveren. Het protocol maakt co-lokalisatie mogelijk van talrijke moleculaire signalen naar specifieke cellen binnen een bepaalde sectie. Bovendien kunnen deze fluorescente signalen objectief worden gekwantificeerd via computersoftware. Dit protocol overwint veel van de tekortkomingen geassocieerd met histologie van gemineraliseerde weefsels en kan dienen als een platform voor hoog-doorvoer, hoog-inhoud fenotypering van musculoskeletale weefsels in de toekomst.

Inleiding

Biologisch onderzoek vereist vaak efficiënt fenotypering, die vaak is geassocieerd met een soort van histologische analyse 1-3. Deze behoefte is nog duidelijker bij de ambitieuze projecten voor elk gen in de muis genoom 4 verstoren. Deze histologische analyses kunnen variëren van het beoordelen celmorfologie en / of anatomische kenmerken te brengen expressie van specifieke genen of eiwitten aan individuele cellen. In feite is een van de fundamentele bijdragen van histologie op het gebied van genomica is de mogelijkheid om een ​​specifieke moleculaire signaal koppelen aan een specifieke regio of celtype.

Traditionele methoden van histologie, vooral voor musculoskeletale weefsels, zijn vaak tijdrovend en moeizaam, die soms weken op te lossen, ontkalken, sectie, vlek, beeld en het monster vervolgens analyseren van de beelden via menselijke interpretatie. Het analyseren van meerdere moleculaire signalen, hetzij via immunohistochemie, in situ hybridization, of speciale vlekken, vereist meerdere secties en zelfs meerdere specimens adequaat presteren. Bovendien, deze meerdere reacties kunnen niet gelijktijdig worden gelokaliseerd aan dezelfde cel en soms niet gelijktijdig gelokaliseerd in een bepaald gebied in een gegeven monster. Als het veld genomics en epigenomics verplaatst naar het digitale tijdperk, moet de histologische veld ook volgen op efficiënte, hoge doorvoer en geautomatiseerde analyse van moleculaire signalen in een histologische sectie verschaffen.

Inderdaad is er een behoefte aan verbeterde histologische technieken die meerdere moleculaire signalen kunnen koppelen aan specifieke cellen in een gegeven monster. Onlangs hebben we een nieuwe high-throughput cryohistological methode voor het bepalen van een aantal bestrijdingsmaatregelen binnen een bepaalde sectie van gemineraliseerd weefsel 14/05 gepubliceerd. Het proces omvat het stabiliseren van de cryosectie met bevroren cryotape, hechten van de afgeplakte gedeelte vast aan een microscoop glijbaan, engeleidende verschillende rondes van kleuring en beeldvorming op elke sectie. Deze rondes van beelden worden vervolgens uitgelijnd met de hand of via de computer automatisering voorafgaand aan beeldanalyse (figuur 1). Hier presenteren we gedetailleerde protocollen van dit proces en voorbeelden waarbij deze technieken ons begrip van verschillende biologische processen verbeterd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De Universiteit van Connecticut Health Center institutionele dierlijke zorg en het gebruik commissie keurt alle dierlijke procedures.

1. Fixatie and Embedding

  1. Euthanaseren het dier via de CO 2 stikken of andere goedgekeurde methoden.
  2. Oogst de weefsel van belang (bijvoorbeeld ledematen, wervels, etc.) en plaats in 10% neutraal gebufferde formaline bij 4 ° C tot de juiste manier bevestigd. Wees extra voorzichtig om een ​​consistente anatomische plaatsing voorafgaand aan de fixatie te behouden. Bijvoorbeeld, fix ledematen met gewrichten op consistente buiging, interne rotatie en externe rotatie hoeken 11. Typisch, fix hele muis ledematen voor 1-3 dagen.
    Let op: Formaline is giftig en mag in een zuurkast worden behandeld terwijl het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
    Opmerking: Het tijdschema van de fixatie afhangt van de grootte van het monster. Indien het experiment toelaat, opensnijden van het bot fixatie van het merg compartiment verbeteren.Sommige exemplaren kunnen perfusiefixatie 15 vereisen fluorescerende achtergrond (bv zwakke fluorescentie signalen binnen het beenmerg) te minimaliseren.
  3. Transfer specimens van formaline tot 30% sucrose in 1x PBS en incubeer gedurende 12-24 uur bij 4 ° C.
    Let op: Eenmaal gedurende 12-24 uur, monsters kunnen vervolgens worden bij -80 ° C voor langdurige opslag geplaatst. Deze opslagmethode wordt aanbevolen voor experimenten waarin onderzoekers gaan meerdere monsters te bedden in hetzelfde blok, maar kunnen niet al deze monsters oogsten tegelijkertijd (bijvoorbeeld experimenten met verschillende tijdstippen).
  4. Verwijder exemplaren uit de sucrose en ontleden weg overtollige weefsel.
  5. Vul een cryomold (grootte van schimmel is afhankelijk van monster grootte) deel van de weg met cryo inbedding medium. Plaats monster matrijs zodat snijvlak van het interessegebied is parallel aan de bodem van de vorm.
    Opmerking: Een voorbeeld van een specifiek weefsel plaatsing en richtingis te vinden in figuur 2A - B.
  6. Plaats de cryomold op een stuk droog ijs tot een dunne laag van cryo inbeddingmedium bevriest en vervolgens fixeert het monster op zijn plaats. Vul het resterende volume van de cryomold met cryo inbeddingmedium met behoud van de cryomold op het droge ijsregen.
  7. Plaats de cryomold in een houder met 2-methyl-butaan vooraf gekoeld met droogijs. Zodra exemplaren volledig zijn bevroren, verwijder cryomolds en schud het overtollige 2-methyl-butaan. Wikkel cryomolds in cellofaan en in een -20 ° C of -80 ° C vriezer voor opslag.
    Opmerking: Monsters kunnen uitdrogen tijd indien opgeslagen in cryo inbeddingmedium, vooral bij -20 ° C. We raden opslag van monsters langer dan 1-2 maanden cryo inbeddingmedium bij -80 ° C of 30% sucrose bij -80 ° C (zie stap 1,3).

2.-Tape gestabiliseerd Tissue-Sectie

  1. Verwijder specimen blokken van diepvries en plaats in cryostat de ingesteld tussen -20 en -25 ° C geroerd.
  2. Verwijder het blok van de cryomold en trim overtollige cryo weg inbedding medium met een scheermesje.
  3. Plaats wat cryo inbeddingmedium op het objectplaatje en lijn het blok zodanig dat het oppervlak van het monster schijf parallel aan het bodemoppervlak van het blok waarbij de juiste snijvlak vaststelling voor de regio van belang.
  4. Leg het monster disc in de cryostaat en zorgen voor de cryo inbedding medium te bevriezen.
  5. Het analysemonster schijf op de objectkop en pas de kop zodanig dat het blad evenwijdig met het oppervlak van het monster blok.
  6. Trim het blok naar beneden tot een niveau binnen de regio van belang en borstelen eventuele spaanders van het oppervlak van het blok.
  7. Knip een stuk van de cryotape groot genoeg is om het gebied van belang en pre-chill in de cryostaat te dekken.
    Opmerking: Meerdere stukken kunnen worden gesneden van een consistente grootte en opgeslagen in de cryostop tijdens het snijden.
  8. Verwijder niet-klevende steun van de cryotape door grijpen de tape door de niet-plakkerige zilver / goud tabs behulp van een tang en zet de tape op het blok sticky-kant naar beneden.
  9. Druk uitoefenen op de cryotape met de rol (figuur 2C).
  10. Maak een sectie (5-8 pm) met behulp van de automatische motor of handmatig snijden wiel van de cryostaat.
    Opmerking: Het is een goede gewoonte om de rand van de cryotape vast te houden als het aankomt op het podium, zodat de sectie niet van het podium valt tijdens het snijden (figuur 2D).
  11. Leg het gedeelte weefsel kant naar boven op een plastic microscoopglaasje binnen de cryostaat.
  12. Verwijder de plastic dia van de cryostaat en laat het cryo inbeddingsmedium smelten zodat het gedeelte aan het oppervlak van de schuif.
  13. Herhaal snijden voor seriële secties of andere regio's van belang.
  14. Eenmaal klaar, slaan de secties in een dia doos eent 4, -20 of -80 ° C afhankelijk van de lengte van de opslag nodig is en de stroomafwaartse responsmaatregelen. Gebruik bijvoorbeeld dia's die zullen worden gekleurd voor enzymatische activiteit (zie 5,2-5,3) binnen een maand als bewaard bij 4 ° C.

3. Hechting van de afdelingen te Microscope Slides

  1. UV kleefstof methode.
    1. Label de microscoop dia.
      Opmerking: Voor meer automatisering, samples en dia's kunnen worden gelabeld met barcodes.
    2. Breng een druppel-UV geactiveerde optische kleefmiddel twee glasplaatjes en gebruik de rand van een plastic dia een dunne laag hechtmiddel verspreid over het oppervlak van de glasplaatjes.
    3. Snijd de / tab zilver goud en leg de afgeplakte sectie weefsel zijde naar boven op de lijm van de eerste dia. Breng het gedeelte in een rollende beweging van de ene kant naar de andere om de vorming van ingesloten luchtbellen onder de band te minimaliseren.
      OPMERKING: De eerste slede wordt gebruikt voor het vooraf bevochtigen van de onderzijde van tHij tape voorafgaand aan het plaatsen het op de tweede (permanent) slide (stap 3.1.4).
    4. Verwijder de vastgebonden gedeelte van de eerste schuif en plaats het op de kleeflaag van de tweede schuif (figuur 3A). Nogmaals, zorg om insluiten van luchtbellen te vermijden.
      LET OP: Deze stap duurt praktijk te beheersen.
    5. Zodra het vereiste aantal secties voor het experiment gegeven wordt op elke dia Veeg overtollige lijm uit de omgeving.
    6. Inspecteer elke sectie nauw te bellen of vezels onder de tape. Voer deze inspectie onder een microscoop of vergrootglas. Als er obstakels, verwijder de afzonderlijke sectie, verwijder de obstructies, en vervolgens opnieuw toe te passen aan het glaasje.
    7. Zodra is vastgesteld dat er geen obstakels onder vastgebonden secties, plaats de objectglaasjes onder de UV black light voor 5-10 minuten om de lijm te verknopen.
  2. Chitosan lijm methode.
    1. Bereid the 1% chitosan lijm. Bereid azijnzuuroplossing door het oplossen van 0,25 ml geconcentreerd azijnzuur in 100 ml gedeïoniseerd water (0,25% v / v). Los 1 g chitosan poeder in 100 ml azijnzuuroplossing en roer de oplossing O / N of totdat al het chitosan poeder wordt opgelost.
      NB: De oplossing is stabiel bij kamertemperatuur.
    2. Deponeren een druppel chitosan oplossing voor elke sectie die op de slede worden geplaatst.
    3. Snijd de tab zilver / goud van de tape en plaats elke afgeplakt sectie weefsel zijde naar boven op de lijm (figuur 3A). Gebruik grote zorg om insluiten van luchtbellen te vermijden.
    4. Zodra alle gedeelten op de slede geplaatst, tilt de schuif op een van de lange zijden en sleep buitensporige chitosan aan de onderrand behulp van een tang.
    5. Plaats de glaasjes in deze oriëntatie bovenop een tissue een schuifkast. Zwaartekracht zal dan voor zorgen dat de overtollige chitosan neer te vallen op de handdoek, waardoor een vlakke, uniforme laag van chitosan.
    6. Place de dia doos met het deksel open opengehouden in de koelkast O / N om het chitosan om te drogen.
      OPMERKING: Zie tabel 1 voor een vergelijking tussen de twee lijm methoden.

4. Toepassing van de Reference Markers naar Slides

  1. Bereid referentiemarkering oplossing door het oplossen van 50 ui groene en 50 pl rode microbolletjes in 100 pl water. Bewaar de oplossing in het donker bij 4 ° C.
  2. Plaats een 10 ul of 20 pi pipet tip in de microsfeer oplossing. Voeg een kleine druppel van de oplossing microsfeer elke sectie grenzend aan het gebied van belang (figuur 3C). Wees voorzichtig om de microsferen binnen de regio van belang niet te krijgen.
  3. Droog de objectglaasjes bij kamertemperatuur (beschermd tegen licht) gedurende 30 min indien verwerkt de glaasjes op die dag. Zo niet, plaats de objectglaasjes in een doos bij 4 ° C.
    Opmerking: Zolang de microsfeer oplossing droogt vóór de dia hydrateren, de microspheres zal gehecht blijven aan de dia's tijdens meerdere rondes van vlekken / beeldvorming.

5. Meerdere Rondes van kleuring

OPMERKING: Door een compatibele reeks imaging, kleuring en reimaging stappen, is het mogelijk te detecteren en co-lokaliseren veel biologische signalen op dezelfde weefselsectie. Elke ronde van beeldvorming / vlekken / reimaging worden ontwikkeld voor de specifieke histologische vraag. De beeldvorming / kleuring / reimaging sequentie omvat gewoonlijk het verwerven van de endogene fluorescentiesignalen (bijvoorbeeld cellulair GFP, mineralisatie kleurstoffen, in vivo imaging probes) op de eerste ronde van beeldvorming gevolgd door fluorescente multiplex immunokleuring en meerdere ronden enzymactiviteit vlekken. Ten slotte kan het onderdeel worden gekleurd met behulp van chromogene kleurstoffen (bijvoorbeeld H & E, toluïdineblauw, safranine O, enz.) Aan de weefselarchitectuur markeren. Gepresenteerd in deze sectie zijn aangepaste methoden aangepast vancommercieel beschikbare protocollen.

  1. Calceïne blauw kleuring voor geaccumuleerde minerale
    LET OP: calceïne blauwe vlekken levert een consistente mineraal oppervlak dat vatbaar is voor automatische beeldanalyse in tegenstelling tot donkerveld of differentiële interferentie contrast (DIC) beeldvorming. Het probleem met calceïne blauwkleuring is dat het fluorescentiespectrum overlapt tetracycline en demeclocycline etikettering. Daarom, als de steekproef deze minerale labels, beeld de labels in de eerste ronde van beeldvorming vóór kleuring met calceïne blauwe bevat.
    1. Als de endogene signalen in het weefsel voorafgaand worden afgebeeld op deze vlekken stap, dompel de dia's uit de vorige beeldvorming door in een Coplin pot gevuld met 1xPBS totdat de dekglaasjes verwijderd van de dia's vallen. Verwijderen en droog de dekglaasjes.
    2. Bereid 30 mg / ml calceïne blauwe oplossing in 2% NaHCO3 (gemaakt door het oplossen van 2 g NaHCO3 in 100 ml H2O en pasgens pH van 7,4 met HCl). Aliquot en bewaar de oplossing bij -20 ° C.
    3. Dompel de dia's in een Coplin pot met 1x PBS gedurende 15 minuten op de afdelingen te hydrateren, indien deze niet reeds uit de vorige ronde gehydrateerd.
    4. Verwijder de glijbanen en droog de achterkant en de randen met een papieren handdoek.
    5. Solliciteer 100-500 ul van calceïne blauwe oplossing per dia en incubeer gedurende 10 min in een vochtige kamer bij RT.
    6. Spoel de objectglaasjes in 1x PBS gedurende 10 min met 3 veranderingen.
    7. Solliciteer ~ 200 ul van 50% glycerol in 1x PBS om elke dia en monteer het deksel slip.
    8. Overtollig glycerol en droog de onderkant van de glijbanen.
  2. Tartraat-resistent zuur fosfatase (TRAP) enzymatische activiteit kleuring
    OPMERKING: TRAP wordt uitgedrukt door meerdere celtypes in de hematopoietische afkomst waaronder osteoclasten. De TRAP-kleuring hier gepresenteerde maakt gebruik van een geel fluorescerend zuur fosfatase substraat. Sommige fluorescerende signalen ovERLAP met de aangepaste gele filter set inclusief tetracycline / demeclocycline mineralisatie labels, calceïne blauwe vlek, en DAPI tegenkleuring.
    1. Dompel dia's uit de vorige beeldvorming door in een Coplin pot gevuld met 1x PBS totdat de dekglaasjes verwijderd van de dia's vallen. Verwijderen en droog de dekglaasjes.
    2. Bereid Buffer 1 door oplossen van 9,2 g watervrij natriumacetaat en 11,4 g natrium tartraat dibasisch dihydraat in water en het brengen van het uiteindelijke volume op 1000 ml. Breng de pH op 4,2 met geconcentreerd ijsazijn (~ 1,5-2 ml). Bewaar de oplossing bij 4 ° C gedurende maximaal 12 maanden.
    3. Buffer 2 Bereid door oplossen van 40 mg natriumnitriet in water en het brengen van het uiteindelijke volume op 1 ml. Bewaar de oplossing bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week.
    4. Op de dag van kleuring Bereid de reactiebuffer door het mengen van 7,5 ml van buffer 1 en 150 pl buffer 2.
    5. Breng de reactiebuffer zonder het substraat aan de dias 10 - 15 min aan het weefsel equilibreren bij de lagere pH.
      Opmerking: Het typische volume ~ 200 ul maar moet groot genoeg zijn om alle secties te dekken.
    6. Verdun de geel fluorescerende zuurfosfatase substraat tussen 1:50 en 1: 100 in de reactiebuffer.
      LET OP: Moet verdund zal worden gedicteerd door TRAP activiteit in de steekproef.
    7. Giet de reactiebuffer af van de glijbanen en breng de reactiebuffer de geel fluorescerende substraat dia.
    8. Zet de objectglaasjes onder de UV zwarte licht ~ 5 min aan het substraat te activeren.
      LET OP: incubatietijd kan variëren afhankelijk van de TRAP activiteit in de steekproef.
    9. Spoel de objectglaasjes in 1x PBS gedurende 10 min met 3 veranderingen.
    10. Solliciteer ~ 200 ul van 50% glycerol in 1x PBS om elke dia en monteer het deksel slip.
    11. Overtollig glycerol en droog de onderkant van de glijbanen.
      NB: De zure TRAP buffer zal de secties ontkalken. Het extra voordeel van het decalcificatie is dat bepaalde kleuren weer beschikbaar voor downstream kleuring (bv mineralisatie labels) zal zijn. Zo zal de calceïne blauwkleuring gedurende de TRAP kleuring worden verwijderd. Daarom kan DAPI tegenkleuring in dit kanaal worden afgebeeld tijdens een volgende ronde.
  3. Alkalische fosfatase (AP) enzymatische activiteit kleuring
    LET OP: Meerdere soorten cellen die betrokken zijn bij de mineralisatie waaronder osteoblasten en mineralisatie chondrocyten uiten AP. De Fast Red substraat gebruikt in dit protocol roept zowel een fluorescerend rood en chromogene rood sein. Hierdoor wordt het chromogene substraat fluorescentiesignalen in de gebieden waar het substraat neerslaat blussen. Daarom is het het beste om deze kleurstof doen na beeldvorming van de fluorescentiesignalen die kunnen worden gedoofd door het AP substraat.
    1. Dompel dia's uit de vorige beeldvorming door in een Coplin pot gevuld met 1x PBS totdat de dekglaasjes verwijderd van de dia's vallen. remove en droog de dekglaasjes.
    2. Bereid 1 M Tris door het oplossen van 12,1 g Tris in 100 ml water. Breng de pH op 9,5 met 1 M NaOH.
    3. Bereid 1 M MgCl2 hexahydraat door het oplossen van 20,33 g MgCl2 in 100 ml gedeïoniseerd water.
    4. Bereid 2 M NaCl door het oplossen van 11,68 g NaCl in 100 ml gedeïoniseerd water.
    5. Bereid 100x (20 mg / ml) voorraadoplossing van Fast Red TR zout door het oplossen van 1 g poeder in 50 ml gedeïoniseerd water. Voeg 100 ul porties en bewaar bij -20 ° C.
    6. Bereid 100x (10 mg / ml) naftol AS-MX fosfaat voorraadoplossing door het oplossen van 500 mg poeder in 50 ml N, N dimethylformamide. Voeg 100 ul porties en bewaar bij -20 ° C.
    7. Op de dag van kleuring bereiden AP buffer door het toevoegen van 1 ml van 1 M Tris, 0,5 ml 1 M MgCl2, 0,5 ml 2 M NaCl en breng het uiteindelijke volume op 10 ml met behulp gedeïoniseerd water (eindconcentraties: 100 mM Tris, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl).
    8. Plaats AP bUffer elke dia en incubeer in een vochtige kamer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    9. Bereid AP substraat buffer door verdunning 100x voorraden Fast Red TR Zout en Naftol AS-MX tot 1x in de AP-buffer.
    10. Giet AP buffer off van dia's en vervangen door AP substraat buffer. Incubeer glijbanen voor 5-10 min in een vochtige kamer bij RT.
      OPMERKING: Incubatie tijd wordt bepaald door AP activiteit van het monster.
    11. Was 3x glijdt in 1x PBS gedurende 5 minuten elk.
    12. Mount dekglaasjes met DAPI tegenkleuring oplossing (1: 1000 verdunning van DAPI in 50% glycerol in 1 x PBS).
  4. Toluïdine blauw O (TB) chromogeen kleuring
    OPMERKING: Omdat alle voorgaande stappen zijn afgebeeld onder tijdelijke waterige montage in 50% glycerol / PBS-oplossing, wordt de chromogene stap ook afgebeeld in aanwezigheid van water. Echter, de kleuroplossing vaak uitlogen tijd. Daarom wordt voorgesteld om het beeld toluidineblauw zo snel mogelijk na kleuring.
    1. Dompel dia's uit de vorige beeldvorming door in een Coplin pot gevuld met gedemineraliseerd water totdat de dekglaasjes verwijderd van de dia's vallen. Verwijderen en droog de dekglaasjes.
    2. Na het verwijderen van de dekglaasjes, te vervangen door vers water en incubeer de objectglaasjes gedurende ten minste 10 minuten zodat zouten van PBS voldoende uit het weefsel verwijderd.
    3. Bereid 0,025% TB-oplossing in gedemineraliseerd water.
    4. Plaats de objectglaasjes in de TB oplossing 1-5 min.
      OPMERKING: incubatie tijd is afhankelijk van de voorkeur van de gebruiker, maar consistent in alle monsters moeten worden bewaard.
    5. Plaats dia's in Coplin pot met gedemineraliseerd water en wassen glijbanen 3x gedurende 5 minuten elk.
    6. Mount dekglas met 30% glycerol opgelost in gedemineraliseerd water (NIET 1x PBS, omdat dit zal leiden tot de vlek uit te lekken uit het weefsel). OPMERKING: Glycerol fixeermiddel kan zijn gesubstitueerd met fructosestroop, waardoor diffusie van de vlek uit het weefsel te voorkomen. naarbereiden fructosestroop, los 30 g fructose in 10 ml gedeioniseerd water en verhit tot 60 ° C totdat opgelost.

6. Meerdere Rondes van Imaging

  1. Plaats de dia's in de microscoop trays (Figuur 3D).
    Opmerking: De trays zijn verende.
  2. Plaats de laden in de lade stapel van de slide-scanning microscoop (figuur 3E).
  3. Klik op de lijst met profielen om een ​​profiel te laden voor elke dia met de juiste belichting tijden voor elke fluorofoor. Klik op de naam dia om elke dia handmatig te noemen of de software leest de barcode die op de dia label. Klik op de start preview-scan knop om een ​​voorbeeld beeld van de dia te nemen.
  4. Stel de regio's van belang in het weefsel detectie wizard en bewaar ze voor latere rondes van beeldvorming. Zodra elke dia is ingesteld, start het scanproces door te klikken op de start scan-knop.
    Opmerking: Het systeem kan maximaal 100 slides tegelijk.
  5. Zodra de beeldvorming is voltooid, exporteert u de beelden van elk kanaal en imaging round individueel als .tif of .jpg-bestanden voor het monteren en analyse.

7. Afbeelding Assembly

  1. Handmatige methode met behulp van Photoshop (of vergelijkbare software voor beeldbewerking kunnen produceren gelaagde beelden).
    1. Open elke afbeelding afzonderlijk kanaal uit elk imaging round.
    2. Monteer de afzonderlijke beelden als lagen binnen een samengestelde afbeelding. Om dit te doen, klikt u op de laag in het palet lagen van het ene beeld. Vervolgens sleept u de laag naar een andere afbeelding. Dit drag and drop operatie zal een nieuwe laag in de afbeelding te maken. Doe dit voor alle andere afbeeldingen. U kunt ook gebruik maken van een script (Bestand> Scripts> Bestanden laden naar stapel ...) om dit proces te automatiseren door het laden van meerdere beeldbestanden als lagen in een afbeelding stapel.
    3. Zodra elk beeld wordt genoemd als een individuele laag in het samengestelde beeld, dubbelklik op de naam van de laag naar de la hernoemenyers als nodig is om de verschillende kanalen onderscheiden.
    4. Om te zien door middel van elke laag en het creëren van een echt samengesteld beeld, verander de blend modus voor elke laag van "Normal" naar "Screen" in het palet lagen.
      Opmerking: Om het tempo van deze stap, het wijzigen van een enkele laag op het scherm, klik met de rechtermuisknop op de laag, selecteer "copy layer style", wijs dan alle andere lagen en kies "plakken layer style" om het scherm stijl toe te passen op de andere lagen.
    5. Indien gewenst, verminderen de opaciteit (veranderingswaarde tot 10-40%) van het chromogene laag (dwz toluidine blauw) aan de fluorescentiesignalen beter zichtbaar door de chromogene laag.
      Opmerking: De betegelde scanning microscoop gebruikt in dit protocol houdt de glaasjes op 3 randen, waardoor de hoeveelheid draaiing die kunnen ontstaan ​​aan de slede tijdens elke ronde van beeldvorming minimaliseren. Derhalve is het veel gemakkelijker voor de gebruiker om de afbeeldingen handmatig uitlijnen zonder beelden verkregen roterenuit verschillende rondes van beeldvorming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een algemene Workflow voor de High-throughput, Multi-Beeld Cryohistology

Figuur 1 het algemene werkschema voor deze techniek. Het omvat verschillende stappen van fixatie door verschillende rondes van beeldvorming en uiteindelijk beelduitlijning / analyse. De werkwijze kan vaak minder dan een week te gaan van monster fixatie tot 4 rondes van beeldvorming, die minder tijd dan nodig is om dit soo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier hebben we presenteerde een gedetailleerd cryohistology protocol om samen te lokaliseren en te kwantificeren diverse biologische maatregelen door het gelijktrekken van beelden van meerdere rondes van vlekken / beeldvorming op een enkele sectie. De werkwijze beschreven met behulp van de cryotape is vooral handig als het de morfologie van moeilijk te vinden in hoofdstuk weefsel (bijv gemineraliseerd bot en kraakbeen) onderhoudt. Bovendien wordt het doorgesneden weefsel stevig gehecht op het glaasje, waardoor ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de volgende financieringsbronnen erkennen: NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283 en T90-DE021989.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10% neutraal gebufferd formalinSigma AldrichHT501128-4LMeerdere leveranciers beschikbaar. Giftig. Kan worden vervangen door 4% paraformaldehyde.
SucroseSigma AldrichS9378Meerdere leveranciers beschikbaar.
PBSSigma AldrichP5368Meerdere leveranciers beschikbaar.
CryomoldsFisher ScientificFisherbrand #22-363-554Er kunnen verschillende maten worden gebruikt, afhankelijk van het weefsel
CryomatrixThermo Scientific6769006Kan worden vervangen door andere cryomatrices. PVA/PEG-gebaseerde harsen hebben echter het beste gewerkt in onze handen.
2-methyl-butaanSigma AldrichM32631Meerdere leveranciers beschikbaar.
CryostatLeica Biosystems3050sKan worden vervangen door andere merken/modellen.
Specimen discLeica Biosystems14037008587Kan worden vervangen door andere merken/modellen.
Cryostat bladesThermo Scientific3051835Kan worden vervangen door andere merken/modellen.
CryotapeSection LabCryofilm 2C
RollerElectron Microscopy Sciences62800-46Kan worden vervangen door andere merken/modellen.
Kunststof microscoopglazenElectron Microscopy Sciences71890-01Kan worden vervangen door andere merken/modellen.
Glazen microscoopglazenThermo Scientific3051Kan worden vervangen door andere merken/modellen.
Norland Optical Adhesive, 61Norland OpticalNorland Optical Adhesive, 61
UV Black LightGeneral ElectricF15T8-BLB
Glazuur azijnzuurSigma AldrichARK2183Meerdere leveranciers beschikbaar.
ChitosanSigma AldrichC3646Meerdere leveranciers beschikbaar.
InSpeck rode microscoopbolletjesThermoFisher ScientificI-14787
InSpeck groene bolletjesThermoFisher ScientificI-14785
Calcein BlauwSigma AldrichM1255Meerdere leveranciers beschikbaar.
CalceinSigma AldrichC0875 Meerdere leveranciers beschikbaar.
Alizarine complexonSigma AldrichA3882 Meerdere leveranciers beschikbaar.
DemeclocyclineSigma AldrichD6140 Meerdere leveranciers beschikbaar.
NaHCO3Sigma AldrichS5761Meerdere leveranciers beschikbaar.
GlycerolSigma AldrichG5516Meerdere leveranciers beschikbaar.
ELF 97 gele fluorescente zure fosfatase substraatThermoFisher ScientificE-6588
DAPIThermoFisher Scientific62247Meerdere leveranciers beschikbaar. Kan worden vervangen door Hoechst 33342 of andere nucleaire kleurstoffen.
TO-PRO-3 (Cy5 nucleaire tegenkleuring)ThermoFisher ScientificT3605
PropidiumjodideThermoFisher ScientificR37108Meerdere leveranciers beschikbaar.
Natriumacetaat anhydrousSigma AldrichS2889Meerdere leveranciers beschikbaar.
natriumtartraat dibasisch dihydraat Sigma AldrichT6521Meerdere leveranciers beschikbaar.
NatriumnitrietSigma AldrichS2252Meerdere leveranciers beschikbaar.
TrisSigma Aldrich15504Meerdere leveranciers beschikbaar.
MgCl2 hexahydraatSigma AldrichM9272Meerdere leveranciers beschikbaar.
NaClSigma AldrichS7653Meerdere leveranciers beschikbaar.
Fast Red TR SaltSigma AldrichF8764Meerdere leveranciers beschikbaar. Kan ook worden vervangen door andere substraatkits zoals Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naftol AS-MX Sigma AldrichN4875Meerdere leveranciers beschikbaar.
N,N dimethylformamideSigma AldrichD158550Meerdere leveranciers beschikbaar.
Toluidine blauw OSigma AldrichT3260Meerdere leveranciers beschikbaar.
Axio Scan.Z1Carl Zeiss AGAxio Scan.Z1Ook andere lineaire of betegelde scanners kunnen worden gebruikt.
DAPI Filter SetChroma Technology Corp.49000
CFP Filter SetChroma Technology Corp.49001
GFP Filter SetChroma Technology Corp.49020
YFP Filter SetChroma Technology Corp.49003
Aangepaste gele (ELF 97) Filter SetChroma Technology Corp.custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
TRITC Filter SetChroma Technology Corp.49004
Cy5 Filter SetChroma Technology Corp.49009
CryoJane Tape Transfer SystemElectron Microscopy Sciences62800-10Meerdere leveranciers beschikbaar.
CryoJane Tape WindowsElectron Microscopy Sciences62800-72Meerdere leveranciers beschikbaar.
CryoJane Adhesive SlidesElectron Microscopy Sciences62800-4XMeerdere leveranciers beschikbaar.

Referenties

  1. Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice. Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).
  2. Adissu, H. A., et al. Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen. Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).
  3. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).
  4. Ayadi, A., et al. Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project. Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).
  5. Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
  6. Dyment, N. A., et al. Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis. Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).
  7. Lalley, A. L., et al. Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury. J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).
  8. Breidenbach, A. P., et al. Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis. J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).
  9. Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage. J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).
  10. Matthews, B. G., et al. Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing. J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).
  11. Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).
  12. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
  13. Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry. J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004(2012).
  14. Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells. Bone. 84, 69-77 (2016).
  15. Hagiwara, Y., et al. Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair. J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).
  16. Jiang, X., et al. Histological analysis of GFP expression in murine bone. J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).
  17. Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. Cryosectioning distortion reduction using tape support. Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).
  18. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

met tape gestabiliseerde cryosectieUV-uithardende lijmseriële sectiebeeldvormingfluorescentiesignaal kwantificeringslide-scanning microscoopuitlijning van referentiemarkershigh-throughput fenotyperinganalyse van musculoskeletaal weefsel
High-throughput, Multi-Beeld Cryohistology gemineraliseerde weefsels
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.