Rapid One-step enzymatische synthese en All-waterige Zuivering van Trehalose analogen

Lisa M. Meints; Anne W. Poston; Brent F. Piligian; Claire D. Olson; Katherine S. Badger; Peter J. Woodruff; Benjamin M. Swarts

doi:10.3791/54485

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Rapid One-step enzymatische synthese en All-waterige Zuivering van Trehalose analogen

9.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54485

⸱

17 februari 2017

Lisa M. Meints¹ , Anne W. Poston¹ , Brent F. Piligian¹ , Claire D. Olson¹ , Katherine S. Badger² , Peter J. Woodruff² , Benjamin M. Swarts¹

¹Department of Chemistry and Biochemistry, Central Michigan University, ²Department of Chemistry, University of Southern Maine

In dit artikel

Samenvatting

Trehalose-analogen duiken op als belangrijke moleculen voor bio(techno)logische en biomedische toepassingen. We beschrijven een geoptimaliseerd protocol voor het enzymatisch synthetiseren en zuiveren van trehalose-analogen dat eenvoudig, efficiënt, snel en milieuvriendelijk is. De toepassing ervan voor de snelle productie en toediening van een sonde voor de detectie van mycobacteriën wordt gedemonstreerd.

Samenvatting

Chemisch gemodificeerde versies van trehalose, trehalose of analoga hebben toepassingen in de biologie, biotechnologie en farmaceutische wetenschappen, onder andere gebieden. Zo hebben trehalose analogen richting detecteerbare labels gebruikt om Mycobacterium tuberculosis te detecteren en kunnen applicaties tuberculose diagnostische beeldvormingsmiddelen hebben. Hydrolytisch stabiele versies van trehalose worden ook nagestreefd vanwege hun potentieel voor toepassing als niet-calorische zoetstoffen en bioprotectieve middelen. Ondanks de aantrekkingskracht van deze klasse van verbindingen voor verschillende toepassingen, in potentie groot onvervulde door het ontbreken van een solide route voor hun productie. Hier melden wij een gedetailleerd protocol voor de snelle en efficiënte one-step biokatalytische synthese van trehalose analogen dat de problemen in verband met chemische synthese omzeilt. Door gebruikmaking van de thermostabiele trehalose synthase (TRUE) enzym uit Thermoproteus tenax, kan trehalose analogen generated in een enkele stap uit glucose analogen en uridine difosfaat glucose in hoge opbrengst (tot kwantitatieve conversie) in 15-60 min. Een eenvoudige en snelle niet-chromatografische zuivering protocol waarbij spin dialyse en ionenuitwisseling veel trehalose analogen van bekende concentratie te leveren in waterige oplossing in slechts 45 minuten. Wanneer ongereageerde glucose-analoog blijft, kan chromatografische zuivering van het trehalose analoge product worden uitgevoerd. Over het algemeen is deze methode zorgt voor een "groene" biokatalytische platform voor de versnelde synthese en zuivering van trehalose analogen die efficiënt en toegankelijk voor niet-chemici. Om de toepasbaarheid van deze methode illustreren, beschrijven we een protocol voor de synthese volledig waterige zuivering en toediening van trehalose-gebaseerde click chemie probe mycobacteriën, hetgeen alles minder dan 1 uur nodig fluorescentiedetectie van mycobacteriën. In de toekomst voor ogen dat we, onder OTHer toepassingen Dit protocol kan worden toegepast op de snelle synthese van trehalose-probes voor tuberculose diagnostiek. Bijvoorbeeld kortlevende radionuclide trehalose gemodificeerde analogen (bijvoorbeeld ¹⁸ F-gemodificeerde trehalose) kunnen worden gebruikt voor geavanceerde klinische beeldvormingsmodaliteiten zoals positron emissie tomografie-computed tomografie (PET-CT).

Inleiding

Trehalose is een symmetrische niet-reducerende disaccharide bestaande uit twee glucose eenheden die zijn verbonden door een 1,1-α, α-glycosidische binding (Figuur 1A). Terwijl trehalose ontbreekt in mensen en andere zoogdieren wordt aangetroffen bij bacteriën, schimmels, planten en invertebraten ^1. De primaire rol van trehalose in de meeste organismen te beschermen tegen milieu-invloeden, zoals uitdroging ^1. Bovendien hebben sommige humane pathogenen vereist trehalose voor virulentie, waaronder tuberculose veroorzaakt Mycobacterium tuberculosis, die trehalose gebruikt als een mediator van celwa....