Een niet-invasieve en Technisch Niet-intensieve methode voor Inductie en fenotypering van experimentele bacteriële longontsteking in Muizen

Summary

Verscheidene werkwijzen zijn beschreven in de literatuur voor het modelleren van bacteriële pneumonie bij muizen. Hierin beschrijven we een niet-invasieve, goedkope, snelle werkwijze voor het induceren via aspiratie pneumonie (bijvoorbeeld inhalatie) van een bacterieel inoculum gepipetteerd in de orofarynx. Downstream methoden voor de beoordeling van de pulmonaire aangeboren immuunrespons zijn ook gedetailleerd.

Abstract

Hoewel de gemeenschap verworven pneumonie blijft een groot probleem voor de volksgezondheid, hebben muismodellen van bacteriële longontsteking recent gefaciliteerd significante preklinische vooruitgang in ons begrip van de onderliggende moleculaire en cellulaire pathogenese. In vivo muismodellen vastleggen van de geïntegreerde fysiologie en veerkracht van de afweer reactie in een manier die niet onthuld door alternatieve, vereenvoudigde ex vivo benaderingen. Verscheidene werkwijzen zijn beschreven in de literatuur voor intrapulmonale inoculatie van bacteriën bij muizen, met inbegrip aërosolvorming, intranasale afgifte, perorale endotracheale canule onder blinde omstandigheden en gevisualiseerd en transcutane endotracheale canule. Alle methoden relatieve voordelen en beperkingen. Hierin beschrijven we in detail een niet-invasieve, technisch niet-intensieve, goedkope en snelle werkwijze voor intratracheale afgifte van bacteriën die aspiratie (bijvoorbeeld inhalatie) gaat door de muisvan besmettelijke inoculum gepipetteerd in de oropharynx terwijl onder narcose. Deze methode kan worden gebruikt voor pulmonaire afgifte van een groot aantal niet bijtend biologische en chemische agentia, en is relatief eenvoudig te leren, zelfs voor laboratoria met een minimale eerdere ervaring met pulmonale procedures. Naast een beschrijving aspiratie pneumonie methode wij ook stap voor stap procedures voor het testen van de volgende in vivo pulmonaire aangeboren immuunrespons van de muis, in het bijzonder werkwijzen voor het kwantificeren van bacteriële verwijdering en de cellulaire immuunreactie van de geïnfecteerde luchtwegen. Deze geïntegreerde en eenvoudige benadering longontsteking evaluatie maakt een snelle en grondige evaluatie van het effect van genetische en omgevingsfactoren manipulaties op pulmonale aangeboren immuniteit.

Introduction

De gemeenschap verworven longontsteking blijft de belangrijkste oorzaak van de dood van een infectie in de VS, met weinig algehele verandering in sterftecijfers in de afgelopen 40 jaar, ondanks verbeteringen in de vaccinatie en antibiotische strategieën ^1,2. Ondanks het gebrek aan duidelijk vooruitgang op de volksgezondheid niveau de laatste jaren dramatisch vooruitgang geboekt in ons begrip van de moleculaire en cellulaire pathogenese van longontsteking, met veel van deze vooruitgang mogelijk gemaakt door het gebruik van muizenmodellen van longontsteking. De genetische traceerbaarheid van de muis, hebben de gelijkenis van de muizen en menselijke immuunsys....

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Animal Welfare Act en de US Public Health Service Beleid inzake Humane zorg en het gebruik van proefdieren na toetsing door de Animal Care en gebruik Comite van de NIEHS.

1. Bereiding van K. pneumoniae Cultuur

Let op: Voer alle stappen in een bioveiligheid van niveau 2 (BSL2) kap of andere BSL2 aangewezen gebied en afval per instituut BSL2 richtlijnen negeren.

1. Voor schorsing groei van K. pneumoniae, ontdooien een glycerol voorraad van bacteriën en het enten van een werkcultuur door de overdracht van 1 ml K. pneumonia....

Results

C57BL / 6-muizen werden geïnfecteerd met 2000 CFU K. pneumoniae 43.816 (serotype 2) via oropharyngeal inademing in de longen. Bij deze dosis muizen beginnen meestal klinische symptomen vertonen 12-24 uur na infectie zoals lethargie, gegolfde vacht en gewichtsverlies van 5-10% (Figuur 2A). Binnen 48-72 uur na infectie veel van de muizen tonen ziektesymptomen en morbiditeit die typisch wordt voorafgegaan door een gemiddeld 20% gewichtsverlies en resulteert in gebo.......

Discussion

Muismodellen van bacteriële longontsteking, samen met gen-targeting en in vivo biologische en farmacologische interventies, zijn kritische inzichten in de pulmonaire afweer reactie. Grote vooruitgang is geboekt in het bijzonder in ons begrip van de chemokines en adhesie moleculen die de aanwerving van neutrofielen regeren tot de geïnfecteerde luchtruim ^10,11. In vivo modellen van longontsteking, in tegenstelling tot de cel-gebaseerde of alternatieve benaderingen, hebben ook belangrijke inzic.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Klebsiella pneumoniae, serotype 2	ATCC	43816
Tryptic soy broth	Becton Dickenson	211825
Excel Safelet IV Catheters, 18 G x 1 1/4"	Claflin Medical Equipment	MEDC-031122
Hema 3 Solution 1	Fisher	23-122-937
Hema 3 Solution 2	Fisher	23-122-952
Hema 3 Fixative	Fisher	23-122-929
27½ gauge tuberculin syringes	Fisher	14-826-87
Lithium heparin plasma collectors	Fisher	2675187
L-shaped disposable spreaders	Lab Scientific	DSC
1x PBS, pH 7.4	prepared in-house	n/a	Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)
ACK lysis buffer	prepared in-house	n/a	NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4