Een niet-invasieve en Technisch Niet-intensieve methode voor Inductie en fenotypering van experimentele bacteriële longontsteking in Muizen

Summary

Verscheidene werkwijzen zijn beschreven in de literatuur voor het modelleren van bacteriële pneumonie bij muizen. Hierin beschrijven we een niet-invasieve, goedkope, snelle werkwijze voor het induceren via aspiratie pneumonie (bijvoorbeeld inhalatie) van een bacterieel inoculum gepipetteerd in de orofarynx. Downstream methoden voor de beoordeling van de pulmonaire aangeboren immuunrespons zijn ook gedetailleerd.

Abstract

Hoewel de gemeenschap verworven pneumonie blijft een groot probleem voor de volksgezondheid, hebben muismodellen van bacteriële longontsteking recent gefaciliteerd significante preklinische vooruitgang in ons begrip van de onderliggende moleculaire en cellulaire pathogenese. In vivo muismodellen vastleggen van de geïntegreerde fysiologie en veerkracht van de afweer reactie in een manier die niet onthuld door alternatieve, vereenvoudigde ex vivo benaderingen. Verscheidene werkwijzen zijn beschreven in de literatuur voor intrapulmonale inoculatie van bacteriën bij muizen, met inbegrip aërosolvorming, intranasale afgifte, perorale endotracheale canule onder blinde omstandigheden en gevisualiseerd en transcutane endotracheale canule. Alle methoden relatieve voordelen en beperkingen. Hierin beschrijven we in detail een niet-invasieve, technisch niet-intensieve, goedkope en snelle werkwijze voor intratracheale afgifte van bacteriën die aspiratie (bijvoorbeeld inhalatie) gaat door de muisvan besmettelijke inoculum gepipetteerd in de oropharynx terwijl onder narcose. Deze methode kan worden gebruikt voor pulmonaire afgifte van een groot aantal niet bijtend biologische en chemische agentia, en is relatief eenvoudig te leren, zelfs voor laboratoria met een minimale eerdere ervaring met pulmonale procedures. Naast een beschrijving aspiratie pneumonie methode wij ook stap voor stap procedures voor het testen van de volgende in vivo pulmonaire aangeboren immuunrespons van de muis, in het bijzonder werkwijzen voor het kwantificeren van bacteriële verwijdering en de cellulaire immuunreactie van de geïnfecteerde luchtwegen. Deze geïntegreerde en eenvoudige benadering longontsteking evaluatie maakt een snelle en grondige evaluatie van het effect van genetische en omgevingsfactoren manipulaties op pulmonale aangeboren immuniteit.

Introduction

De gemeenschap verworven longontsteking blijft de belangrijkste oorzaak van de dood van een infectie in de VS, met weinig algehele verandering in sterftecijfers in de afgelopen 40 jaar, ondanks verbeteringen in de vaccinatie en antibiotische strategieën ^1,2. Ondanks het gebrek aan duidelijk vooruitgang op de volksgezondheid niveau de laatste jaren dramatisch vooruitgang geboekt in ons begrip van de moleculaire en cellulaire pathogenese van longontsteking, met veel van deze vooruitgang mogelijk gemaakt door het gebruik van muizenmodellen van longontsteking. De genetische traceerbaarheid van de muis, hebben de gelijkenis van de muizen en menselijke immuunsysteem, en de enorme hoeveelheid-muizen gerichte immunologische reagentia die in de handel verkrijgbaar zijn geworden samen vergemakkelijkt snelle vooruitgang van het veld.

Muismodellen van bacteriële longontsteking in de literatuur beschreven zijn algemeen wordt aangevoerd uit vier technische routes pathogeen inoculatie: i) aërosolvorming; ii) intranasal levering; iii) perorale levering; en iv) chirurgische intratracheale injectie (dwz tracheotomie) ^3. Alle besmettingswegen hebben voor- en nadelen ^3. Vooral relatieve blootstelling van de bovenste luchtwegen, mogelijke vermenging van oronasale flora, vereisten voor algemene anesthesie, variabiliteit van de aan de distale long inoculum, lobaire verdeling van de geleverde pathogenen, technische eisen deskundigheid en procedurele morbiditeit variëren sterk tussen deze benaderingen.

Veel gebruikte perorale besmetting technieken omvatten endotracheale (translaryngeal) infusen via ofwel een 'blind' (niet zichtbaar) aanpak, of in direct larynx visualisatie ^3-5. Beide werkwijzen, terwijl robuust, vereisen grote scholing en voeren ook het risico van trauma aan de bovenste luchtwegen. In dit rapport beschrijven we een technisch non-intensieve, niet-invasieve, goedkope en snelle methode van perorale besmetting, whierbij bacteriën (Klebsiella pneumoniae in de verstrekte voorbeeld) gepipetteerd in de oropharynx van een verdoofde muis om de longen wordt geleverd via aspiratie (dat wil zeggen, inhalatie). Wij en anderen hebben de aspiratiepneumonie techniek met succes ^6-9 gebruikt. Deze veelzijdige en makkelijk te leren long-levering werkwijze kan worden uitgebreid tot het leveren van meer extra niet-bijtende middelen aan de longen, met inbegrip van cytokinen en andere proteïnen, pathogeen geassocieerde moleculen (bijvoorbeeld lipopolysaccharide), cellen (dwz adoptieve overdracht), en toxinen (bijvoorbeeld bleomycine). Naast het bespreken van belangrijke technische overwegingen, we beschrijven ook een geïntegreerde, kwantitatieve benadering voor de beoordeling van de daaropvolgende gastheer reactie op longontsteking, met inbegrip van downstream meting van de bacteriële klaring (dwz, kiemgetal [CFU] kwantificering in de longen en perifere organen) en leukocyten accumulatie in het luchtruim.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Animal Welfare Act en de US Public Health Service Beleid inzake Humane zorg en het gebruik van proefdieren na toetsing door de Animal Care en gebruik Comite van de NIEHS.

1. Bereiding van K. pneumoniae Cultuur

Let op: Voer alle stappen in een bioveiligheid van niveau 2 (BSL2) kap of andere BSL2 aangewezen gebied en afval per instituut BSL2 richtlijnen negeren.

1. Voor schorsing groei van K. pneumoniae, ontdooien een glycerol voorraad van bacteriën en het enten van een werkcultuur door de overdracht van 1 ml K. pneumoniae bouillon aan 50 ml tryptische soja bouillon (TSB) in een 500 ml kolf of groter.
2. Maak glycerol voorraden door het toevoegen van 900 ul van gekweekte log-fase K. pneumoniae 100 gl steriel glycerol en bevriezen bij -20 ° C of -80 ° C. Voor de lange termijn opslag is -80 ° C aanbevolen.
3. Cultuur bacteriën uit sTep 1,1 door schudkolf overnacht (14-18 uur) bij 37 ° C bij 200-225 rpm.In om log-fase groei, verdun 1-5 ml van deze kweek overnacht in een kolf die 50 ml TSB in de ochtend en terugplaatsen bij 37 ° C onder schudden ~ 2,5 uur.
4. Transfer 1 ml K. pneumoniae cultuur van de laatste stap in een 1,5 ml buis en draaien op 7500 xg gedurende 2 minuten. Een witte pellet moet zichtbaar zijn. Verwijder supernatant zonder de pellet te verstoren, voorzichtig mengen bacteriën pipet 1 ml steriele zoutoplossing en weer draaien bij 7500 xg gedurende 2 minuten.
   1. Voer deze wasstap 2x, de opvoeding van de finale, gewassen pellet in 1 ml steriele zoutoplossing.
5. Voer log-wise seriële verdunningen van deze keurige entstof. Bijvoorbeeld, voeg 400 ul van het inoculum in 3,6 ml steriele zoutoplossing serieel een 10 -10 ^{-9 -1} verdunningsreeksen.
6. Bepaal de OD ₆₀₀ van gewassen K. pneumoniae door het plaatsen van 1 ml van de1:10 en 1: 100 verdunningen in wegwerpcuvetten en meten van de OD _600, blanking eerst met steriele zoutoplossing. Meet duplicaten om de nauwkeurigheid te waarborgen. Een OD ₆₀₀ van 1,0 is ongeveer gelijk aan 7/4 x 10 ⁸ CFU / ml. Merk op dat de relatie tussen OD en CFU / ml mag niet lineair.
   1. Gebruik de OD ₆₀₀ van de verdunningen tot concentratie van K. te berekenen pneumoniae, het aanbrengen van de OD: CFU / ml conversie boven, en factoring in de verdunning.
7. Gebruik de K. pneumoniae concentratie de gewenste inoculum CFU dosis bereiden in een <100 ul volume voor levering aan muizen (zie hieronder).
8. Plaat ook 100 pl 10 ^-6 -10 ^-9 verdunningen en 100 ul steriele zoutoplossing op afzonderlijke tryptische soja-agar (TSA) platen bij RT. Incubeer bij 37 ° C geïncubeerd en sommen bacteriekolonies Om precieze concentratie die werd gebruikt in experimenten en de controle op vervuiling berekenen.
   OPMERKING: Het werkelijke bacteriële concentratie van de uiteindelijke entstof kan zijn ± 500 CFU / ml dat voorspeld door absorptie. Onderzoekers moet idealiter bevestigen de OD _600: CFU / ml relatie modelstudies voor gebruik in vivo in muizen, empirisch bijstelling van de OD _600: CFU / ml conversie op basis van hun persoonlijke ervaringen.

2. Muizen Intratracheaal (it) Aspiration van K. pneumoniae uit oropharynx

1. Zorg ervoor dat muizen worden op unieke wijze geïdentificeerd door staart merk, tattoo, of een andere goedgekeurde identifier.
2. Opstellen dosering inoculum van bacteriën met behulp P200 pipet voorafgaand aan het verwijderen van muizen uit isofluraan om de procedure te bespoedigen. Voor de beste resultaten mee aspiratie, gebruik dan een volume van <100 ul om overlopen te voorkomen. Hierin Gebruik 2000 CFU / 50 pi K. pneumoniae.
3. Verdoven muizen in een heldere kamer met isofluraan gas (bijvoorbeeld 2% isofluraan in stroomsnelheid van 1 l / min) of vanaf institutional richtlijnen. Het aantal muizen samen verdoven wordt bepaald comfortniveau van de experimentator, kenmerkend 1-2 tegelijk. Let op de ademhaling en bevestig niveau van anesthesie eens diep adem zijn zichtbaar en 2-3 sec kunnen worden geteld tussen ademhalingen.
   LET OP: Als er bezorgdheid over de mogelijke verstorende effecten van volatiele (inhalatie) anesthetica, kan anesthesie in plaats daarvan worden bereikt met intraperitoneale injectie van ketamine / xylazine. Met de hierboven beschreven werkwijze, diepe verdoving duurt slechts enkele minuten. Als langduriger verdoving geïnduceerd, moet oogzalf worden gebruikt om oculaire uitdroging te voorkomen.
4. Zodra de muis wordt verdoofd, plaatst het in een semirecumbent rugligging, geschorst door de bovenfront van een rubberen band gespannen tussen pinnen op een hellend plexiglas plaat (figuur 1).
5. Trek de muis tong aan de kant met een paar stompe niet-geribbeld pincet en deposito dosering in de mondholte met een P200 pipette. Wees uiterst voorzichtig om te voorkomen dat het induceren van trauma aan ofwel de tong of de orofarynx.
6. Terwijl de tong teruggetrokken, zachtjes af te sluiten van de neus met een gehandschoende vinger tot de muis inhaleert. Blijf de neus dekken tot de muis twee of meer inhalaties heeft genomen en geen vloeistof zichtbaar is in de mondholte. Het behandelen van de neus zorgt ervoor dat de muis de bacteriën inademen in de longen, zoals muizen zijn obligate neus breathers.
7. Verwijder de muis uit de inenting raad van bestuur en terug te keren naar zijn kooi, het plaatsen van de muis op zijn rug naar beddengoed of vuil te voorkomen dat het blokkeren van de neusgaten, terwijl de muis is herstellende van anesthesie.
8. Zodra alle muizen werden gedoseerd en zijn ontwaakt uit narcose, huis muizen in een kast / kamer met alleen muizen die zijn gedoseerd met K. pneumoniae. Monitor muizen per dag, met inbegrip van het lichaamsgewicht als die verder gaan dan 48 uur na infectie.
9. Gebruik dagelijks puree en / of extra warmte als zodat de muizen verder te gaan dan 48hr.

3. bronchoalveolaire lavage Fluid (BALF) Verzamelen en analyseren

1. Euthanaseren muizen per institutionele richtlijnen. Hier, Gebruik een dodelijke injectie van 150 mg / kg natriumpentobarbital of equivalente dosis commerciële euthanasie oplossing gevolgd door verbloeding, aangezien dit voorkomt mogelijke complicaties aan de longen geassocieerd met CO ₂ inademing en cervicale dislocatie.
2. Positie muis op de rug en steriliseer de muis door het sproeien van bont met 70% ethanol in het bijzonder over de borst en nek.
3. Voeg een longitudinale juist onder het borstbeen, dan houdt het borstbeen met een tang, nick het membraan, waardoor de longen om terug te vallen in de borstholte. Knip met de borstholte aan weerszijden van het vaatstelsel en vervolgens door de hals, waardoor de luchtpijp.
4. Aangezien de trachea wordt omgeven door longitudinale spieren aan weerszijden voorzichtig snijden door het midden duwen weefsel aan de zijkanten, alsDit vermijdt het snijden van de omringende vasculatuur, die bloed in de luchtpijp kan introduceren. Als het vaatstelsel wordt gejat, het reinigen van de omgeving met een gaasje voorafgaand aan de toegang tot tracheale lumen.
5. Gebruik chirurgische schaar of naald nick de luchtpijp ongeveer een kwart van de weg naar beneden van het hoofd en plaats een canule bevestigd aan een 1 ml spuit voorgeladen met 1 ml 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) caudaal in de luchtpijp. Bij gebruik van muizen <8 weken oud of vrouwen, vermindering van de lavaging volume 600-800 pi.
6. Duw de volume in de longen langzaam, waardoor alle lobben te blazen en trek het volume terug met de spuit, het herhalen van 3x. Als PBS komt uit de neusgaten de canule heeft niet ver genoeg is geduwd in de luchtpijp of de inflatie te snel optreedt. Als alternatief, als de longen niet goed opblazen, de canule werd geduwd te ver, zo iets te trekken.
7. Verzamel gepoolde wast in een 15 ml buis op ijs.
8. spinnenhet luchtruim spoelvloeistof bij 1200 g gedurende 5 minuten, laat supernatant in een 1,5 ml buis en invriezen bij -80 ° C. Vervolgens gebruikt de supernatant (bijv BALF) voor het meten van eiwitten, cytokines, en voor verschillende andere biochemische assays. De pellet vertegenwoordigt cellen uit de bronchoalveolaire ruimte.
9. Indien rode bloedcellen (RBC's) zijn duidelijk in de celpellet basis van kleur, lyse met 1 ml ACK lysisbuffer gedurende 1 min, gevolgd door toevoeging van 5 ml van 1 x PBS om de reactie te stoppen lysis en verdun de buffer. Behandel alle exemplaren identiek, hetzij behandeld of niet met ACK lysis buffer.
10. Spin cellen bij 1200 g gedurende 5 minuten, giet het supernatant en breng de cellen in 1 ml 1X PBS.
11. Vortex en tellen cellen op een hemocytometer voor de telling van het totale luchtruim cellen.
12. Gebaseerd op de dichtheid van cellen, voeg ongeveer 80-150 ui (80 ul van een geïnfecteerde muis en ~ 150 voor een naïeve muis) een schijfjeskamer op een Cytospin centrifuge. Spin cels op microscoopglaasjes voor daaropvolgende kleuring cellen differentiële populaties bepalen.
13. Sta cellen een nacht drogen op objectglaasjes. Vlek cellen met tri-vlek (bijvoorbeeld Hema 3 [zie tabel]) door dompelen de dia's 7 keer in fixatief, 9 keer in vlek 1, en 7 keer in vlek 2 (geen spoelen tussen vlekken), en laten drogen. Na de vlek is opgedroogd, dekglaasje dia's en handmatig tellen differentiëlen door microscoop. In het algemeen worden neutrofielen en monocyten / macrofagen herkenbaar aan hun grootte en nucleaire morfologie.

4. Vaststellen van bacteriën in de longen en perifere weefsels

1. Vóór aanvang: bereiden verdunningsbuizen met 900 pl 1x PBS long- en milt en 90 pl 1x PBS bloed. Label platen voor het kweken van bacteriën en op kamertemperatuur is gebracht; Daarom wordt eenmaal weefsel is verzameld tijd geminimaliseerd tussen homogenisatie en coating voor bacteriegroei.
   Let op: Als gevolg van de heterogene depositaristie van bacteriën in de longen die kan optreden bij aspiratie, wordt aanbevolen dat individuele muizen worden gebruikt voor de analyse van hetzij de totale cellulariteit luchtwegen of totale (bilaterale) long bacteriële belasting.
2. Euthanaseren de muis als per stap 3.1 en vervolgens het bloed te verzamelen van de linker hartkamer, het plaatsen in een gehepariniseerde buis om stolling te voorkomen. Verwijderen longkwabben en in een 15 ml buis met 5 ml 1x PBS, gevolgd door verwijdering van de milt en het onderbrengen 2 ml 1x PBS. Plaats de buizen op ijs. Zorg om instrumenten te reinigen met ethanol tussen elk weefsel / muis.
3. Homogeniseren het weefsel op ijs, bij voorkeur met wegwerp Homogenisatie kan worden gewijzigd tussen elk monster. Wegwerp homogenisator tips kunnen worden geautoclaveerd voor hergebruik tussen de experimenten.
4. Zodra weefsel is gehomogeniseerd, uit te voeren seriële verdunningen en plaat. Plate monsters van een bepaald weefsel / verdunning in tweevoud op één TSA plaat door het tekenen van een scheidslijn op het plastic. Plating en dilutie resultaten worden hieronder getoond (in alle gevallen wordt 10 ul monster uitgespreid op plaat) en gebaseerd op 24 uur na infectie necropsie. Als analyseren monsters 48-72 uur, kan een groter aantal verdunningen moeten worden uitgeplaat door toegenomen aantal bacteriën op latere tijdstippen.
   1. Voor Blood - 1:10 verdunnen door toevoeging van 10 pi van bloed in 90 uit steriel 1x PBS. Plaat netjes en 1:10 verdunde monsters in tweevoud. Zodra bloed is geplateerd, draaien resterende bloed bij 9300 xg gedurende 10 min plasma extract voor het meten van cytokines en chemokines.
   2. Voor Lung - verdunnen 1:10 - 1: 100 door toevoeging van 100 pl gehomogeniseerde longen in 900 pi steriel PBS 1x serieel. Plaat netjes homogenaat en alle verdunningen in tweevoud.
   3. Voor Spleen - verdund 1: 10-1: 100 door toevoeging van 100 pl gehomogeniseerde milt in 900 pi steriel PBS 1x serieel. Plaat netjes homogenaat en beide verdunningen in tweevoud.
5. Sta spread monsters kort drogen.
6. Omkeren TSA platen en plaats in een statische 37 ° C incubator 's nachts.
7. Bepaal het aantal koloniserende bacteriën door het middelen van de bacteriële kolonies van beide zijden van de plaat en van elke verdunning. Factor in de initiële verdunningen van 5 ml long- en 2 ml voor milt aan totale weefsel CFU te bepalen.

Results

C57BL / 6-muizen werden geïnfecteerd met 2000 CFU K. pneumoniae 43.816 (serotype 2) via oropharyngeal inademing in de longen. Bij deze dosis muizen beginnen meestal klinische symptomen vertonen 12-24 uur na infectie zoals lethargie, gegolfde vacht en gewichtsverlies van 5-10% (Figuur 2A). Binnen 48-72 uur na infectie veel van de muizen tonen ziektesymptomen en morbiditeit die typisch wordt voorafgegaan door een gemiddeld 20% gewichtsverlies en resulteert in gebo...

Discussion

Muismodellen van bacteriële longontsteking, samen met gen-targeting en in vivo biologische en farmacologische interventies, zijn kritische inzichten in de pulmonaire afweer reactie. Grote vooruitgang is geboekt in het bijzonder in ons begrip van de chemokines en adhesie moleculen die de aanwerving van neutrofielen regeren tot de geïnfecteerde luchtruim ^10,11. In vivo modellen van longontsteking, in tegenstelling tot de cel-gebaseerde of alternatieve benaderingen, hebben ook belangrijke inzic...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Klebsiella pneumoniae, serotype 2	ATCC	43816
Tryptic soy broth	Becton Dickenson	211825
Excel Safelet IV Catheters, 18 G x 1 1/4"	Claflin Medical Equipment	MEDC-031122
Hema 3 Solution 1	Fisher	23-122-937
Hema 3 Solution 2	Fisher	23-122-952
Hema 3 Fixative	Fisher	23-122-929
27½ gauge tuberculin syringes	Fisher	14-826-87
Lithium heparin plasma collectors	Fisher	2675187
L-shaped disposable spreaders	Lab Scientific	DSC
1x PBS, pH 7.4	prepared in-house	n/a	Gedistilleerde water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5,75 g), KH2PO4 (1 g)
ACK lysis buffer	prepared in-house	n/a	NH4Cl (4,145 g), KHCO3 (0,5 g), EDTA (18,6 mg), opbrengen tot 500 ml met gedistilleerd water en pH tot 7,4