Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Om Fungal Biology and Plant Microbe Interactions Studie

Kristin Bösch; Lamprinos Frantzeskakis; Miroslav Vraneš; Jörg Kämper; Kerstin Schipper; Vera Göhre

doi:10.3791/54522

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen

14.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54522

⸱

30 september 2016

Kristin Bösch^*¹^,² , Lamprinos Frantzeskakis^*¹ , Miroslav Vraneš³ , Jörg Kämper³ , Kerstin Schipper¹^,² , Vera Göhre¹^,²^,⁴

¹Institute for Microbiology, Heinrich-Heine University Düsseldorf, ²Bioeconomy Science Center (BioSC), ³Department of Genetics, Institute of Applied Biosciences, Karlsruhe Institute of Technology, ⁴Cluster of Excellence in Plant Sciences (CEPLAS), Heinrich-Heine University Düsseldorf

^* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een robuuste gen vervangende strategie om de vuiligheid schimmel Ustilago maydis genetisch te manipuleren. Dit protocol wordt uitgelegd hoe u deletiemutanten genereren om infectie fenotypes onderzoeken. Kan worden uitgebreid tot genen in elke gewenste wijze, bijvoorbeeld wijzigen door toevoeging van een sequentie die codeert voor een fluorescerend eiwit tag.

Samenvatting

Gendeletie speelt een belangrijke rol bij de analyse van genfunctie. Een van de meest efficiënte werkwijzen om genen doelgericht verstoren is de vervanging van het gehele gen met een selecteerbare merker via homologe recombinatie. Tijdens homologe recombinatie, uitwisseling van DNA vindt plaats tussen sequenties met hoge gelijkenis. Daarom kan lineair genomische sequenties die een doelgen worden gebruikt om specifiek richten een selecteerbare marker om de gewenste integratieplaats. Stompe uiteinden van het deletieconstruct activeren DNA herstel systemen van de cel en daarmee integratie van het construct bevorderen hetzij via homologe recombinatie of door niet-homologe-uiteinden. In organismen met een efficiënte homologe recombinatie, kan de snelheid van succesvolle gendeletie oplopen tot meer dan 50% waardoor deze strategie een waardevolle gendisruptie systeem. De vuiligheid schimmel Ustilago maydis is een eukaryotisch micro-organisme model toont een dergelijke efficiënte homologe recombination. Van de ongeveer 6900 genen, vele zijn functioneel gekarakteriseerd met behulp van deletiemutanten en herhaalde niet van genvervanging pogingen wijst op wezenlijke functie van het gen. Daaropvolgende karakterisering van het gen functie door tagging met fluorescerende markers of mutaties van de voorspelde domeinen beroept zich ook op DNA-uitwisseling via homologe recombinatie. Hier presenteren we de U. maydis generatie strategie stam in detail met behulp van de eenvoudigste voorbeeld, het gen deletie.

Inleiding

Ustilago maydis is een model fytopathogene schimmel die uitvoerig is onderzocht voor tientallen jaren ^1,2. Het bestaat in twee morfologieën, een gistachtige, niet-pathogene fase en een filamenteuze infectieuze vorm ^3. Universal baanbrekende ontdekkingen zoals homologe recombinatie en DNA-herstelmechanismen werden gemaakt in de gist-achtige groeifase van deze schimmel ^4. Bovendien is de morfologische schakelaar om de besmettelijke filament en virulentie factoren die van belang zijn voor infectie zijn goed gekarakteriseerd ^5,6. De toenemende kennis over moleculaire biologie en de virulentie van deze vuiligheid schimm....