Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen

14.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54522

⸱

30 september 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Microbiology, Heinrich-Heine University Düsseldorf, 2Bioeconomy Science Center (BioSC), 3Department of Genetics, Institute of Applied Biosciences, Karlsruhe Institute of Technology, 4Cluster of Excellence in Plant Sciences (CEPLAS), Heinrich-Heine University Düsseldorf

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een robuuste gen vervangende strategie om de vuiligheid schimmel Ustilago maydis genetisch te manipuleren. Dit protocol wordt uitgelegd hoe u deletiemutanten genereren om infectie fenotypes onderzoeken. Kan worden uitgebreid tot genen in elke gewenste wijze, bijvoorbeeld wijzigen door toevoeging van een sequentie die codeert voor een fluorescerend eiwit tag.

Samenvatting

Gendeletie speelt een belangrijke rol bij de analyse van genfunctie. Een van de meest efficiënte werkwijzen om genen doelgericht verstoren is de vervanging van het gehele gen met een selecteerbare merker via homologe recombinatie. Tijdens homologe recombinatie, uitwisseling van DNA vindt plaats tussen sequenties met hoge gelijkenis. Daarom kan lineair genomische sequenties die een doelgen worden gebruikt om specifiek richten een selecteerbare marker om de gewenste integratieplaats. Stompe uiteinden van het deletieconstruct activeren DNA herstel systemen van de cel en daarmee integratie van het construct bevorderen hetzij via homologe recombinatie of door niet-homologe-uiteinden. In organismen met een efficiënte homologe recombinatie, kan de snelheid van succesvolle gendeletie oplopen tot meer dan 50% waardoor deze strategie een waardevolle gendisruptie systeem. De vuiligheid schimmel Ustilago maydis is een eukaryotisch micro-organisme model toont een dergelijke efficiënte homologe recombination. Van de ongeveer 6900 genen, vele zijn functioneel gekarakteriseerd met behulp van deletiemutanten en herhaalde niet van genvervanging pogingen wijst op wezenlijke functie van het gen. Daaropvolgende karakterisering van het gen functie door tagging met fluorescerende markers of mutaties van de voorspelde domeinen beroept zich ook op DNA-uitwisseling via homologe recombinatie. Hier presenteren we de U. maydis generatie strategie stam in detail met behulp van de eenvoudigste voorbeeld, het gen deletie.

Inleiding

Ustilago maydis is een model fytopathogene schimmel die uitvoerig is onderzocht voor tientallen jaren 1,2. Het bestaat in twee morfologieën, een gistachtige, niet-pathogene fase en een filamenteuze infectieuze vorm 3. Universal baanbrekende ontdekkingen zoals homologe recombinatie en DNA-herstelmechanismen werden gemaakt in de gist-achtige groeifase van deze schimmel 4. Bovendien is de morfologische schakelaar om de besmettelijke filament en virulentie factoren die van belang zijn voor infectie zijn goed gekarakteriseerd 5,6. De toenemende kennis over moleculaire biologie en de virulentie van deze vuiligheid schimmel is gebaseerd op een eenvoudige gen vervangende strategie 7-9 ondersteund door een uitstekende genoomannotatie 10 en het gemak van het reverse genetics met gebruikmaking van bijvoorbeeld de goed georganiseerde plasmide collectie van ons instituut (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Gestandaardiseerde, snelle infectie assays in maïs seedlings mogelijk gedetailleerde studies van pathogene factoren 11.

Het genoom van U. maydis bevat ongeveer 6900 genen 10. Om hun functie te bestuderen, kunnen zij afzonderlijk of in combinatie worden verwijderd door een efficiënte homologe recombinatie systeem. Flankerende gebieden van ongeveer 1 kb dat perfect homologe uiteinden zijn ideaal voor snelheden van homologe recombinatie meer dan 50%, maar reeds 250 bp met niet-homologe uiteinden zodat een zekere correcte integratie van het construct 9. Op dit moment, vijf verschillende weerstand cassettes, hygR, cbxR, natR, G418R en phleoR bemiddelen weerstand tegen hygromycine, carboxin, nourseothricin, G418 en fleomycine, worden gebruikt om te selecteren op transformanten 7,9. Bovendien heeft de hygromycine resistentie ontwikkeld tot een recycleerbare cassette (FRT-hygR) die kan worden verwijderd door de tijdelijke expressie van een heteroloog FLP recombinase 12. Dit maakt verwijdering van het resistentiecassette en daarmee in principe onbeperkte genetische modificaties. Phleomycine mutageen 13, zodat de nieuwe cassettes, met name de recyclebare hygR cassette, het gebruik van phleoR afneemt. Viervoudige mutanten kunnen dus worden gegenereerd via de andere vier cassettes, maar vijfvoudige mutanten, is de FRT-systeem hygR 14 aanbevolen.

Deze algemene strategie gendeletie met succes overgedragen aan andere smut schimmels zoals Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16 of U. esculenta 17 en derhalve biedt het potentieel voor verdere toepassingen nog genetisch hardnekkige organismen met een efficiënte homologe recombinatie systeem. Bovendien kunnen organismen ontbreekt homologe recombinatie worden gemodificeerd gentechnologie verbeteren geïllustreerd door de deletie van genen die betrokken zijn bij niet-homologe end-aansluiting in Neurospora crassa 18,19.

Hier beschrijven we de gepubliceerde gendeletie strategie voor U. maydis 7,9 in experimentele detail met een focus op de snelle en nauwkeurige controle van de kandidaten. Als voorbeeld, gebruiken we de schimmel chitinasen en tonen de vorming van enkele mutanten alsmede verschillende deletiestammen 20,21. Chitinasen zijn interessante voorbeelden, omdat zij optreden in chitine in de starre celwand. Celwand verbouwing is nodig voor morfologische veranderingen tijdens de celdeling, overschakelen naar draadvormige groei, en de vorming spore. Derhalve zijn voor deletiemutanten fenotypes gehele levenscyclus te verwachten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Generatie van deletieconstructen

  1. Genereren van een plasmide dat de deletie construct (Figuur 1) omvattende een respectievelijk 1 kb stroomopwaartse flank (UF) en stroomafwaartse flank (DF) elk en de juiste weerstand geflankeerd door bot snijden restrictieplaatsen.
    OPMERKING: klonen strategie kan worden gebruikt (voor het klonen zie referentie 22) bevelen wij Golden Gate klonen voor dergelijke plasmiden 9.
  2. Accijnzen de schrapping te construeren van het plasmide met een stomp mes tot 1 ug DNA van de deletie te verkrijgen construeren 9. Zuiveren de schrapping construct enzym te elimineren en buffer 22 bijvoorbeeld door het gebruik van commerciële reagentia en volg de instructies van de fabrikant.
    NB: De vector backbone kan in de transformatie mengsel blijven.

2. Bereiding van protoplasten

OPMERKING: Houd steriele omstandigheden tijdens alle momenten van de eXperiment. De celwand is een sterke beschermende barrière voor de toegang van moleculen tot het plasmamembraan beperkt. Om opname van het DNA dat de deletie construct mogelijk maken, de celwand moet worden verwijderd celwand afbrekende enzymen in een protoplasting reactie. Kritische stappen in protoplastbereiding zijn 1) osmotische stabilisatie van het medium en 2) het voorkomen van mechanische belasting van de protoplasten.

  1. Cijfer 2 ml buizen met ronde bodem de protoplasten bevriezen en koelen ze op bij -20 ° C. Start een pre-cultuur in 3 ml Yeps-Licht van een nieuwe plaat van de stam met de gewenste genetische achtergrond. Incubeer op een roterend wiel gedurende 24 uur bij 28 ° C.
    LET OP: De stam kan de solopathogenic stam SG200 10, wild-type stammen, tester stammen zoals AB33 23, of een mutant achtergrond voor de generatie van de dubbele mutanten zijn. Controleer de spanning vrij is van de gewenste weerstand.
  2. Verdun de cultuur in 50 ml Yeps-Light in een verbijsterd flask en incubeer op een orbitale schudder bij 28 ° C met 200 rpm.
    LET OP: De verdubbeling is ongeveer 2 uur voor wildtype stammen. Laat drie duplicaties minimum.
  3. Groeien tot exponentiële fase. Waarborgen dat de optische dichtheid, gemeten bij een golflengte van 600 nm (OD 600), ongeveer 0,8 (0,6-1,0 zijn). Een OD 600 van 1,0 komt overeen met ongeveer 1 tot 2 x 10 7 U. maydis cellen per ml.
  4. Controleer de cellen voor besmetting onder een microscoop. Gebruik 40x vergroting. Pellet de cellen van de volledige 50 ml kweek gedurende 5 min, 1500 x g en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in 25 ml natriumcitraat, sorbitoloplossing (SCS), centrifugeer 5 min, 1500 x g en verwijder het supernatant.
    OPMERKING: De bacteriële besmettingen kunnen worden geïdentificeerd als kleine en vaak ontroerende cellen. Schimmels verontreinigingen kunnen worden geïdentificeerd op basis van een andere cel vorm of afmeting vergeleken met de sigaar gevormde cellen U. maydis.
  5. tijdens het centrifugation bereiden protoplasting oplossing (12,5 mg / ml Trichoderma lyserende enzymen, in SCS, bereidt 3 ml per celpellet; Filter steriliseer door een 22 urn filter; oplossing vers optimale enzymatische activiteit te zijn). SCS is een osmotische stabilisator breuk van protoplasten na verwijdering van de celwand te verhinderen.
  6. Resuspendeer de pellet in 2 ml protoplasting oplossing. Incubeer gedurende 5 tot 20 minuten bij kamertemperatuur en laat onder de microscoop tot 30 tot 40% van de cellen zijn rond of dergelijke speldekoppen (figuur 2).
    OPMERKING: Voer alle stappen op het ijs van nu af aan en greep protoplasten met zorg!
  7. 3x wassen in 10 ml koude (4 ° C) SCS, centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten.
  8. Resuspendeer de pellet in 10 ml koude sorbitol, TrisHCl, CaCl2 oplossing (STC), draaien op 1000 g gedurende 5 min, gooi supernatant. Resuspendeer de pellet in 1 ml koud STC, maken 100 ul fracties in de gekoelde buizen. Bevries de porties bij -80 ° C tot verder gebruik.

3. Transformatie van U. maydis

LET OP: De transformatie van U. maydis protoplasten gebaseerd op polyethyleenglycol (PEG) gemedieerde transformatie werkwijze die technisch eenvoudig en tegen elektroporatie of biolistische transformatie vereist geen gespecialiseerde apparatuur.

  1. Bereid de twee lagen selectie platen (2 platen per transformatie reactie). De onderlaag bevat het antibioticum in een concentratie verdubbeld. Pipetteer 12 ml van RegLight bevattende 400 ug / ml hygromycine (of 300 ug / ml nourseothricin of 4 ug / ml carboxin of 1 mg / ml G418) in een petrischaal. Vermijd bubbels.
    OPMERKING: Onderlaag platen kunnen worden opgeslagen een paar dagen bij 4 ° C, maar bereid de bovenlaag pas tijdens de transformatie (zie hieronder).
  2. Dooi protoplasten op ijs (1 tube / transformatie). Voeg 1 ul heparine (15 mg / ml). Voeg 1 ug DNA (gelineariseerd construct) of 10 gl H 2 O (water control). Incubeer gedurende 10 min op ijs.
  3. Gedurende deze tijd, de bovenlaag verdeeld 12 ml vloeibaar RegLight (koken en afkoelen tot 60 ° C) op de RegLight bodemplaat.
    LET OP: Deze laag heeft geen antibiotica bevatten.
  4. Voeg 500 gl STC / PEG (polyethyleenglycol) aan de transformatie buis (3 2) en meng voorzichtig door het buisje. Incubeer 15 min op ijs.
  5. Verdeel elke transformatie reactie op twee van de twee lagen RegLight platen. Verspreid voorzichtig en langzaam met een glazen pipet. Incubeer de platen rechtop bij 28 ° C gedurende 5 tot 7 dagen tot transformanten groeien als kolonies. Het verkrijgen van ongeveer 100-200 kolonies per plaat.
    OPMERKING: Lagere waarden kan worden veroorzaakt door "slechte" protoplasten die ofwel bevatten te veel celwand en daarom niet opnemen DNA of kunnen regenereren. De eerste kan worden getest door transformatie met een zelf-replicerend plasmide, betwisting per regeneratie testen op platen zonder antibiotica.
  6. Bereid Yeps-Light platen die het geschikte antibioticum bij 200 ug / ml hygromycine (of 150 ug / ml nourseothricin of 2 ug / ml carboxin of 500 ug / ml G418, deze concentratie gelijk helft van die waarmee bodemplaten). Opnieuw zuiveren ten minste 24 vermeende transformant kolonies op deze platen. Enkele kolonies worden verkregen. Tegelijkertijd streak uit de oorspronkelijke druk op niet-selectieve media.
    OPMERKING: Platen kunnen 1-2 weken worden bewaard bij 4 ° C.

4. Controle van de juiste verwijdering Events

OPMERKING: De mutaties worden geverifieerd een drietrapsprocedure (figuur 1). Enerzijds kandidaten die de wildtype kopie van het gen bevatten, worden uitgesloten PCR. Ten tweede is de integratie van de resistentiecassette in de locus geverifieerd door PCR. Ten derde is de integratie van de resistentie cassette uitsluitend in de gewenste locus geverifieerd door Southern blot analyse. Zorgvuldige stam verificatie is essential, zodat mutante fenotypes echt correleren met de schrapping.

  1. Eerste Diagnostic PCR 20
    1. Ontwerp primers koppelen aan het gen te verwijderen die leiden tot een product van 250-600 bp (Figuur 1). Dergelijke kleine producten gemakkelijk te amplificeren in een kolonie PCR en lang genoeg voor detectie in standaard gelelektroforese.
    2. Voor elke kandidaat en de originele stam als positieve controle resuspendeer een beetje (hoeveelheid van een speldekop) celmateriaal van een enkele kolonie met een tandenstoker in 20 gl 0,02 M NaOH. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
      OPMERKING: Gebruik verse kolonies. Als de platen zijn ouder dan 1 week re-streak tot een nieuwe kolonie te verkrijgen.
    3. Met 1 pl van de celsuspensie voor de PCR onmiddellijk. Voer een standaard PCR reactie en analyseren resulterende fragmenten.
      Opmerking: Deze monsters kunnen niet worden opgeslagen.
      LET OP: Deze PCR-test op de aanwezigheid van de wild-type-gen en daardoor maakt snelle identificatie van negatieve candidates waarin het gen van interesse niet vervangen. Klonen waarbij bands in deze PCR reactie zal worden weggegooid. Een dergelijke negatieve kloon dient immers mee als extra negatieve controle worden uitgevoerd. Kandidaten zonder PCR product verder worden geanalyseerd. Genen zonder nadelige gevolgen ongeveer de helft van de kandidaten moet het wildtype gen bevatten, terwijl de andere helft niet resulteren in een band. Dit zou overeenstemmen met een homologe recombinatie van 50%.
  2. Tweede Diagnostische PCR
    1. Bereiding van genomisch DNA.
      OPMERKING: Genomisch DNA (gDNA) kunnen worden bereid met twee verschillende protocollen. De eerste betreft giftige reagentia zoals fenol en chloroform en dus mag alleen door ervaren onderzoekers (in 4.2.1.1 beschreven 4.2.1.5), terwijl de tweede ook door minder ervaren studenten (in 4.2.1.6 beschreven 4.2 kunnen worden behandeld worden behandeld. 1.11). Beide protocollen worden betrouwbaar werken. Stap 4.2.1.1 is identiek voor beide protocOLS.
      1. Inoculeer 5 ml Yeps-Light met elke kandidaat en incubeer op een roterend wiel gedurende 24 uur bij 28 ° C. Drop 2 pl van de kweek op een CM plaat. Houd de cultuur steriel.
        LET OP: Na is een standaard protocol (LET OP: giftig stappen).
      2. Doe 1 lepel (~ 200 pl) van HCl-gewassen glazen kralen tot 2 ml buizen. Voeg 2 ml van de U. maydis cultuur. Spin 12.000 xg gedurende 5 minuten. Gooi supernatant (pellet kan worden ingevroren in dit stadium). Voeg 500 ul fenol / chloroform / isoamylalcohol (25: 24: 1) aan de pellet. VOORZICHTIGHEID! Fenol GIFTIG!
      3. Voeg 500 ul Usti-lysis-buffer 1. Schud gedurende 6-10 minuten op een Vibrax bij 1000 rpm. Controleer of de cel pellet volledig geresuspendeerd, maar vermijd verlengde schudden om afschuiven van de gDNA te voorkomen. Spin bij 12.000 xg gedurende 15 min. Transfer 400 ul van de waterige fase in de nieuwe reactiebuis (niet de interfase raken).
      4. Voeg 1 ml 100% (v / v) ethanol. Keren de tube 3x te mengen, let op de cluid DNA dat kort weergegeven. Spin bij 12.000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en wassen met 200 pi 70% EtOH. Laat de pellet in dit stadium niet mengen.
      5. Verwijder supernatant volledig (niet laten de pellet volledig drogen). Voeg 50 ul TE / RNase. Ontbinden gDNA door schudden bij 400 tpm bij 50 ° C gedurende 10 minuten. Analyseer 2 pi van de gDNA op een 0,8% agarosegel 20.
        OPMERKING: De volgende stappen omvatten een alternatieve niet-toxisch protocol.
    2. Alternatieve bereiding van genomisch DNA
      1. Doe 1 lepel (~ 200 pl) van HCl glasparels gewassen tot 2 ml buizen. Voeg 2 ml van de U. maydis cultuur en draaien op 12.000 xg gedurende 5 minuten. Gooi supernatant (pellets worden ingevroren in dit stadium).
      2. Voeg 500 ul lysisbuffer Usti 2 aan de pellet. Schud gedurende 5 tot 15 minuten op een Vibrax bij 1000 rpm. Controleer of de cel pellet volledig geresuspendeerd.
      3. Incubeer de buizen bij 65 ° C gedurende 15 tot 20 min. Met behulp voorkomendgeval incubators bedoeld voor het hosten 2 ml buisjes is van cruciaal belang. Dan, plaats het op ijs gedurende 5 minuten.
      4. Voeg 100 ul 8 M kaliumacetaat, vortex of invertsuiker 8 tot 10 keer. Spin 12.000 xg gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
      5. Overdracht 500 pi van het supernatant naar een nieuwe 1,5 ml buis en voeg 400 pl isopropanol. Vortex invertsiropen 8 tot 10 keer. Spin 12.000 xg gedurende 15 min. Verwijder supernatant en was met 500 pl 70% EtOH. Spin 12.000 xg gedurende 5 minuten.
      6. Losweken bovendrijvende helemaal! Uiteindelijk, voeg kort centrifugeren (10 sec) om resterende vloeistof te verwijderen. Laat de DNA pellet drogen 3-5 minuten. Voeg 50 ul TE / RNase en incubeer bij 50 ° C gedurende 10 tot 15 minuten bij 400 rpm.
    3. PCR
      1. Ontwerp twee primerparen met een van hen bindende buiten de flanken en de corresponderende binding binnen de resistentiecassette (UF-f, RC-R, RC-f, DF-r, Figuur 1) 9.
      2. Met 1 pl van een 1:10 verdunning van de gDNA elke cKANDIDAAT als een sjabloon in 2 PCR reacties verificatie van de juiste installatie upstream en downstream 9.
      3. Gebruik standaard PCR-reacties voor elke kandidaat en analyseren van resulterende fragmenten 22.
        Opmerking: Deze PCRs testen voor het inbrengen van de resistentie cassette in de juiste genomische locus. Als producten worden verkregen voor beide partijen, de kandidaat is waarschijnlijk een correct inbrengen. Echter ook kandidaten wanneer slechts één zijde (stroomopwaarts of stroomafwaarts) worden bevestigd worden meegenomen voor verdere analyse bij de PCR-reacties die gewoon niet één flank.
  3. Controle van de juiste Genomic Insertion door Southern Blot Analyse 22
    1. Digest 15 pl gDNA (4.2.1) van de mutant gegadigden met corresponderende wildtype / progenitor stam met een geschikt enzym dat knipt buiten de locus / bouwen en bovendien snijdt hetzij in het gen of de resistentie cassette leidt tot duidelijk distinguishable patronen (figuur 1) 8.
      OPMERKING: Geen van de verwachte band moet groter zijn dan 10 kb, zodat ze duidelijk van gedigereerde DNA.
    2. Gebruik de upstream en downstream flank als probes. Om ze te labelen bijvoorbeeld gebruik maken van de PCR DIG labeling Kit of een soortgelijke standaard methode. Meng de gelabelde probes in een 1: 1 moleculaire ratio en het uitvoeren van de Southern blot. Houd ten minste twee onafhankelijke juiste transformanten.
      LET OP: De wildkleur patroon moet duidelijk waarneembaar in de oorspronkelijke stam en de juiste klonen mag alleen de verwachte bands bevatten. Extra banden alleen aanwezig in de andere kandidaten geven inserties van het construct in een verkeerde locus. Dergelijke klonen moet worden weggegooid. De negatieve kandidaat die in de eerste diagnostische PCR zou de wild-type banden en de banden (onvoorspelbare in grootte) van het wederrechtelijk geïntegreerde verwijdering construct bevatten.
  4. glycerol Stocks
    OPMERKING: Glycerol voorraden dienen om de klonen te behouden voor de komende jaren in stam collecties. Ten minste twee onafhankelijke transformanten te bewaren voor elke mutant. Dit maakt het vergelijken fenotypes die identiek moeten zijn.
    1. Groeien 5 ml kweken van de bevestigde mutante stammen Yeps-Light op een roterend wiel gedurende 24 uur bij 28 ° C Mix 500 pi van elke cultuur met 500 pi NSY-glycerol-medium. Omkeren buis tot cultuur en medium zijn goed gemengd. Glycerol in het medium voorkomt de vorming van ijskristallen.
    2. Invriezen bij -80 ° C. Re-streak een deel van de bevroren cultuur om te testen of de voorraad is functioneel.

5. Microscopische fenotypes

  1. Groeien 5 ml culturen van wildtype en mutante stammen Yeps-Light op een roterend wiel gedurende 12 uur bij 28 ° C.
  2. De volgende dag, verdunnen de cultuur tot een OD 600 van ongeveer 0,1 en groeien tot een OD 600 tussen 0,5 en 0,7. Een OD 600 van 1,0 correspconden tot ongeveer 1 tot 2 x 10 7 U. maydis cellen per ml.
  3. Inspecteer de cel morfologie microscopisch.
    LET OP: Gezonde cellen blijken sigaar vormige (Figuur 4, WT). Uitgesproken vacuolen of vorming filament aangeven dat de cellen zijn benadrukt.
    Opmerking: Afhankelijk van het verwachte mutante fenotype, kan de analyse worden aangepast, bijvoorbeeld wanneer reporter stammen worden gebruikt om de geschikte test kan in dit stadium worden uitgevoerd. Als celmorfologie wijzigt statistische analyse worden uitgevoerd, bijvoorbeeld de lengte gemiddelde cel bepalen.

6. Infectie Assay

LET OP: De zaailing infectie assay is eerder gevisualiseerd in dit tijdschrift 11. Het kan zowel met behulp van een haploïde, solopathogenic stam achtergrond zoals SG200 10 of door het mengen van compatibele paring partners die zowel het uitvoeren van de mutatie worden uitgevoerd.

  1. Groeien tenminste 40 maïszaailingen perstam gedurende 7 dagen bij een lichtcyclus van 16 uur, 200 uE, 28 ° C / 22 ° C (dag / nacht). Zij dienen in het 3-bladstadium en 10-15 cm lang bij de dag van infectie.
  2. Twee dagen voor infectie, start een voorkweek van de stammen in 5 ml Yeps-Light op een roterend wiel gedurende 24 uur bij 28 ° C. Grow een van de belangrijkste cultuur in 50 ml Yeps-Light tot OD600 = 1,0 (celdeling tarief = 2 uur, laat 3 divisies minimum, kan worden gedaan O / N).
  3. Spin down de cellen van 50 ml cultuur bij 1.500 xg gedurende 5 minuten en gooi de supernatant. 3x wassen met steriel H2O Resuspendeer de cellen in steriele H 2 O tot een OD 600 van 3,0. Eventueel mengen de paring partners.
  4. Injecteer 250-500 ul van de celsuspensies in de steel van 7 dagen oude maïszaailingen met een kleine spuit. Gebruik steriele H 2 O als controle. Houd besmette zaailingen voor een extra 7-14 dagen in hetzelfde licht en temperatuur. Score het fenotype van elke plant eenolgens gezonde, chlorose, anthocyaan formatie, kleine tumoren, grote tumoren, dode planten 10.
    LET OP: Scoren kan zo vroeg als 7 dagen worden uitgevoerd en herhaald na 14 dagen om infectie te volgen in de tijd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De schrapping constructies voor alle vier chitinolytische genen gecodeerd in het U. maydis genoom werden gegenereerd door Golden Gate klonen met behulp van de hygR cassette voor het verwijderen van CTS1, de natR voor verwijdering van CTS2, de G418R cassette voor het verwijderen van cts3 en de cbxR voor het verwijderen van cts4 20. Een algemeen overzicht van de vervangingsstrategie gen wordt geïllu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft hoe deletiemutanten voor reverse genetische studies in U. genereren maydis. Uitgangspunt is een deletie construct dat flankerende sequenties van het gen-van-belang bevattende sequenties van ongeveer 1 kb stroomopwaarts van de start en na het stopcodon en een voldoende weerstand cassette bevat zoals eerder geoptimaliseerd 7,9 . De constructen afzonderlijk worden gegenereerd voor elk gen en zorgvuldig gecontroleerd voor sequentiefouten vóór het gen te verwijderen. Puntm...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Met speciale dank aan Dr. Benedikt Steuten voor kritische lezing van het manuscript. Het originele werk op het chitinasen werd uitgevoerd door Dr. Thorsten Langner uitgevoerd. Het laboratorium van VG wordt ondersteund door de Cluster of Excellence in Plant Sciences (CEPLAS, DFG EXC 1028) en BioSC, wordt het laboratorium van KS ondersteund door BioSC. KB wordt ondersteund door BioSC. De wetenschappelijke activiteiten van de bio-economie Science Center (BioSC) werden financieel ondersteund door het ministerie van Innovatie, Wetenschap en Onderzoek in het kader van de NRW Strategieprojekt BioSC (nr 313 / 323-400-00213). LF wordt ondersteund door een doctoraatsbeurs van de DFG International Research Training Group 1525 iGRADplant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Aminobenzoeenzuur (vrije zuur)Sigma AldrichA-9878
Bacto agar BD214010alternatief lokale leverancier gebruiken
Bacto peptonBD211677alternatief lokale leverancier gebruiken
Bacto gistextract BD212750alternatief lokale leverancier gebruiken
CaCl2*2H2OGrüssing GmbH10234alternatief lokale leverancier gebruiken
Ca-Pantothenaat (Hemi-Ca. zout)Sigma AldrichP-2250
Carboxin Sigma Aldrich45371
Casamino zuren BD223050
CholinchlorideSigma AldrichC-1879
CitroenzuurChemSolute24.321.000alternatief lokale leverancier gebruiken
CuSO4*5H2OFluka61240alternatief lokale leverancier gebruiken
D(+)Sucrose Roth4621.1alternatief lokale leverancier gebruiken
DNA degr. vrij zuur Sigma-AldrichD-3159
EDTASigma AldrichE4378
FeCl3*6H2OGrüssing GmbH10288alternatief lokale leverancier gebruiken
Geneticin (G418) disulfaat zoutSigma AldrichA1720
Trichoderma lysing enzymenSigma AldrichL1412
D(+) GlucoseCaelo2580alternatief lokale leverancier gebruiken
Glycerin Fisher ChemicalG065015alternatief lokale leverancier gebruiken
H3BO3AppliChemA2940Gevaarlijke stof. Raadpleeg de veiligheidsinstructies van de fabrikant.
Heparine natriumzoutSigma AldrichH3393-50KU
Hygromycine B-oplossingRoth1287.2Gevaarlijke stof. 
KClVWR26764298alternatief lokale leverancier gebruiken
KH2PO4AppliChemA3620alternatief lokale leverancier gebruiken
MgSO4 watervrijMerck7487-88-9Watervrij is kritiek. Alternatief lokale leverancier gebruiken
MnCl2*4H2OAppliChemA2087alternatief lokale leverancier gebruiken
myo-InositolSigma AldrichI-5125
Na2-EDTA*2H2OAppliChemA2937alternatief lokale leverancier gebruiken
Na2MoO4*2H2ORoth0274.2alternatief lokale leverancier gebruiken
Na2SO4Grüssing GmbH12174alternatief lokale leverancier gebruiken
NaClFisher ChemicalS316060alternatief lokale leverancier gebruiken
NaOHChemSolute13.751.000alternatief lokale leverancier gebruiken
NH4NO3RothK299.1alternatief lokale leverancier gebruiken
Nicotinezuur (vrij zuur)Sigma AldrichN-4126
Nourseothricine dihydrogesulfaat  Werner BioAgents5.001.000
Voedingsbouillon Difcolokale leveranciers
Fenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7Sigma AldrichP3803Gevaarlijke stof. Raadpleeg de veiligheidsinstructies van de fabrikant.
polyethyleenglycol (PEG)Sigma AldrichP-3640
KaliumacetaatAppliChem121479alternatief lokale leverancier gebruiken
Pyridoxine (monohydrochloride)Sigma AldrichP-9755
Riboflavine Sigma AldrichR4500
RNaseASigma AldrichR5503
SDSRothCn30.3alternatief lokale leverancier gebruiken
kleine spuitBD300300alternatief lokale leverancier gebruiken
steriele filter, 22 µmVWR28145-477alternatief lokale leverancier gebruiken
SorbitolRoth6213.1alternatief lokale leverancier gebruiken
Thiamin-hydrochlorideServa36020.02alternatief lokale leverancier gebruiken
tri-Na-CitraatFisher ChemicalS332060alternatief lokale leverancier gebruiken
Tris- (hydroxymethyl) aminomethaanVWR103156Xalternatief lokale leverancier gebruiken
Tris hydrochlorideRoth9090.4alternatief lokale leverancier gebruiken
Triton X-100 Serva 37240alternatief lokale leverancier gebruiken
ZnCl2Fluka96470alternatief lokale leverancier gebruiken
Samenstelling van oplossingen/voorbereiding van materiaalSamenstelling van oplossingen
CarboxinVoorraad: 5 mg/ml in methanol, eindconcentratie: 2 µg/ml
CM platen0,25 % (w/v) Casamino zuren, 0,1 % (w/v) Gistextract, 1,0 % (v/v) Holliday vitamineoplossing, 6,25 % (v/v); Holliday zout oplossing, 0,05 % (w/v) DNA degr

Referenties

  1. Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
  2. Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
  3. Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
  4. Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
  5. Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
  6. Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
  7. Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
  8. Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
  9. Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
  10. Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
  11. Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712(2014).
  12. Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
  13. van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
  14. Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
  15. Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
  16. Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
  17. Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
  18. Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
  19. Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
  20. Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
  21. Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
  22. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloining: a laboratry manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  23. Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
  24. Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
  25. Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
  26. Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
  27. Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
  28. Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
  29. Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
  30. Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
  31. Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
  32. Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Gen deletiehomologe recombinatieprotoplasttransformatieSouthern blot-analysePCR-verificatiechitinasegenenschimmelgeneticastamgeneratie
Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.