Extractie van structurele extracellulaire polymere stoffen van aërobe korrelslib

Samenvatting

Het protocol voorziet in een methodologie om aëroob korrelslib oplosbaar te maken met het oog op alginaat-achtige extracellulaire polymeren (ALE) uit te pakken.

Samenvatting

Om methoden voor de extractie van gelvormende extracellulaire polymere stoffen (EPS) te evalueren en te ontwikkelen, werd EPS uit aërobe granulaire slib (AGS) geëxtraheerd met behulp van zes verschillende methoden (centrifugeren, sonicatie, ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), formamide met natriumhydroxide (NaOH), formaldehyde met NaOH en natriumcarbonaat (Na₂CO₃) met warmte en constant mengen). AGS werd verzameld uit een pilootreactor voor afvalwaterbehandeling. De ionische gelvormende eigenschap van de geëxtraheerde EPS van de zes verschillende extractiemethoden werd getest met calciumionen (Ca²⁺). Van de zes gebruikte extractiemethoden kon alleen de Na₂CO₃-extractie de hydrogelmatrix van AGS solubiliseren. De alginaat-achtige extracellulaire polymeren (ALE) die met deze methode werden teruggewonnen, vormden ionische gelkorrels met Ca²⁺. De Ca²⁺-ALE-korrels waren stabiel in EDTA, formamide met NaOH en formaldehyde met NaOH, wat aangeeft dat ALE een deel zijn van de structurele polymeren in EPS. Het wordt aanbevolen om een extractiemethode te gebruiken die fysische en chemische behandeling combineert om AGS te solubiliseren en structurele EPS te extraheren.

Inleiding

In de afgelopen jaren heeft het aërobe korrelslib (AGS) proces een populaire biologische afvalwaterzuivering proces, met succes toegepast bij verschillende full-scale waterzuiveringsinstallaties ¹ geworden. In tegenstelling tot de conventionele actiefslibproces, in de AGS werkwijze de microorganismen vormen granules plaats van vlokken ^2. Deze korrels hebben een betere bezinkbaarheid, zijn in staat om een hogere organische belastingen te weerstaan, en hebben een hogere tolerantie voor toxiciteit dan actief slib vlokken ^3.

In tegenstelling tot de biofilms, wordt AGS gevormd spontaan, zonder betrokkenheid van elke dragermateriaal ^4. In AGS, zoals in biofilms, microörganismen produceren een aanzienlijke hoeveelheid sterk gehydrateerde extracellulaire polymere stoffen (EPS) ⁵ een hydrogel matrix waarin ze zichzelf geïmmobiliseerde vorm ^{4 - 6.} EPS is een complex mengsel, bestaande uit polysacchariden, proteïnen, nucleïnezuren, (Phospho) lipiden, humusstoffen en enkele intercellulaire polymeren ^5,7,8. Deze polymere stoffen met elkaar door middel van elektrostatische krachten, waterstofbindingen, ionische aantrekkelijke krachten en / of biochemische reacties, enz. ^5, die een dichte en compacte tertiaire netwerkstructuur. De EPS polymeren die in staat zijn hydrogels ^4,9 en draagt bij tot de vorming van de tertiaire netwerkstructuur zijn in dit opzicht beschouwd als structurele EPS, een subset van de totale EPS.

EPS zijn verantwoordelijk voor de chemische structuur en fysische eigenschappen van granules ^5. Daarom is het essentieel om de functie van elk EPS verbinding begrijpen. Verschillende benaderingen worden toegepast voor extractie EPS ^10-15. Vanwege hun extreme complexiteit, is het bijna onmogelijk om alle componenten EPS het extraheren van een enkele methode. Tot op heden is er geen "one size fits all" methode voor het EPS-extractie. De keuze van de extractiewerkwijze beïnvloedt niet alleen de totale hoeveelheid, maar ook de samenstelling van de teruggewonnen polymeren ^{13,16 - 20.} Afhankelijk van het type van slib en de EPS plaats verschillende methoden nodig.

Extraheren gelvormende polymeren, karakteriseren de eigenschappen en het onderzoeken van hun interactie met elkaar en met niet-gelvormende EPS helpt om de rol van EPS in aërobe korrelslib voor vorming. Bovendien is de gelvormende polymeren zijn ook nuttig in industriële toepassingen biopolymeren. Een mogelijke toepassing is reeds aangetoond met gelvormende polymeren uit AGS als bekledingsmateriaal waterbestendigheid papier ²¹ te verhogen.

Daarom worden extractiemethoden, specifiek voor gelvormende EPS nodig. Het doel van deze studie is om een ​​methodologie om gel-vormende EPS extraheren uit AGS ontwikkelen. Zes extractiemethodes ^10-15,22, die vaak worden gebruikt in de literatuur, werden geselecteerd om EPS te extraheren uit AGS. Het totale bedrag en de gel vormende eigenschappen van de geëxtraheerde EPS werden vergeleken voor elke methode.

Protocol

LET OP: AGS werd verzameld uit de Nereda pilot-reactor bij de afvalwaterzuiveringsinstallatie Utrecht, Nederland. De reactor werd gemeentelijk afvalwater. De korrelslib had een slib volume index (SVI _5min) van 59,5 ml / g _VSS. Het slib werd bemonsterd in april aan het einde van een aërobe cyclus. Na monstername werd het slib direct naar het laboratorium vervoerd, gezeefd en opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik.

1. EPS Extraction

OPMERKING: Centrifugeer korrelslib bij 4000 x g en 4 ° C gedurende 20 minuten en giet het supernatant. Verzamel de korrels in de pellet voor de extractie. De totale vaste stof (TS) en organische stof (VS) van de granules werd bepaald door de standaard werkwijzen ^23. De conversiefactor tussen granule nat gewicht - het gewicht van de rechtstreeks uit de pellet genomen granules - en TS werd bepaald voorafgaand aan de extractie. Alle extracties werden uitgevoerd in drievoud.

LET OP: 3 g natte granules werden voor elke extractiemethode. De TS en VS waarden (0,39 g TS en 0,34 g VS), gemeten in triplo werden gebruikt om de extractie opbrengsten te berekenen.

1. Centrifugeren extractie ¹¹
   1. Overdracht 3 g (nat gewicht) van de korrels in een centrifugebuis en vullen de centrifugebuis met 50 ml met gedemineraliseerd water.
   2. Iets schud de centrifugebuis met de hand.
   3. Centrifugeer de centrifugebuis bevattende het mengsel bij 4000 x g en 4 ° C gedurende 20 min.
   4. Verzamel de bovenstaande vloeistof in een glazen beker, gooi de pellet en zet het supernatant zoals beschreven in paragraaf 1.7.
2. Sonicatie extractie ¹⁰
   1. Overdracht 3 g (nat gewicht) van de korrels in een centrifugebuis en vullen de centrifugebuis met 50 ml met gedemineraliseerd water.
   2. Toepassen gepulseerde sonicatie op ijs gedurende 2,5 min bij 40 W aan het mengsel.
   3. Centrifugeer de centrifugatiebuis met het mengsel bij 4000 x g en 4 ° C gedurende 20 min.
   4. Verzamel de bovenstaande vloeistof in een glazen beker, gooi de pellet en zet het supernatant zoals beschreven in paragraaf 1.7.
3. Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) extractie ¹¹
   1. Overdracht 3 g (nat gewicht) van de korrels in een 100 ml glazen fles en vul de fles 50 ml van 2% (w / v) EDTA oplossing.
   2. Iets schud de fles met de hand en op te slaan in de koelkast bij 4 ° C gedurende 3 uur.
   3. Breng het mengsel in een 50 ml centrifugebuis.
   4. Centrifugeer de centrifugebuis bevattende het mengsel bij 4000 x g en 4 ° C gedurende 20 min.
   5. Verzamel de bovenstaande vloeistof in een glazen beker, gooi de pellet en zet het supernatant zoals beschreven in paragraaf 1.7.
4. Formamide - natriumhydroxide extractie (NaOH) ¹³
   1. Transfer 3 g (nat gewicht) van de korrels in een 100ml glazen fles en vul de fles 50 ml met gedemineraliseerd water.
   2. Voeg 0,3 ml 99% formamide.
   3. Iets schud de fles met de hand en op te slaan in de koelkast bij 4 ° C gedurende 1 uur.
   4. Voeg 20 ml 1 M NaOH aan de korrels suspensie.
   5. Iets schud de fles met de hand en op te slaan in de koelkast bij 4 ° C gedurende 3 uur.
   6. Breng het mengsel gelijkmatig in twee 50 ml centrifugebuis.
   7. Centrifugeer de buizen met centrifugatie van het mengsel bij 4000 x g en 4 ° C gedurende 20 min.
   8. Verzamel de bovenstaande vloeistof in een glazen beker, gooi de pellet en zet het supernatant zoals beschreven in paragraaf 1.7.
5. Formaldehyde - NaOH extractie ¹¹
   1. Overdracht 3 g (nat gewicht) van de korrels in een 100 ml glazen fles en vul de fles 50 ml met gedemineraliseerd water.
   2. Voeg 0,3 ml 37% formaldehyde.
   3. Iets schud de fles met de hand en op te slaanin de koelkast bij 4 ° C gedurende 1 uur.
   4. Voeg 20 ml 1 M NaOH aan de korrels suspensie.
   5. Iets schud de fles met de hand en op te slaan in de koelkast bij 4 ° C gedurende 3 uur.
   6. Breng het mengsel gelijkmatig in twee 50 ml centrifugebuis.
   7. Centrifugeer de buizen met centrifugatie van het mengsel bij 4000 x g en 4 ° C gedurende 20 min.
   8. Verzamel de bovenstaande vloeistof in een glazen beker, gooi de pellet en zet het supernatant zoals beschreven in paragraaf 1.7.
6. Een hoge temperatuur - natriumcarbonaat extractie (Na ₂ CO ₃₎ ^9,22,24
   1. Voorverwarmen 150 ml leidingwater in een 1000 ml glazen beker op een magnetische roerder bij 80 ° C.
   2. Overdracht 3 g (nat gewicht) van granules in een 250 ml kolf war en vul de kolf met 50 ml met gedemineraliseerd water.
   3. Voeg 0,25 g Na ₂ CO ₃ of 0,67 g watervrij Na ₂ CO ₃ • 10H _{2 O in de kolf een 0,5% verkrijgen (w / v) Na 2 CO 3 concentratie.}
   4. Plaats de kolf die het mengsel in het waterbad. Bedek de kolf en bekerglas afzonderlijk in aluminiumfolie om verdamping te voorkomen.
   5. Roer het mengsel gedurende 35 minuten bij 400 rpm en 80 ° C.
   6. Breng het mengsel in een 50 ml centrifugebuis.
   7. Centrifugeer de centrifugebuis bevattende het mengsel bij 4000 x g en 4 ° C gedurende 20 min.
   8. Verzamel de bovenstaande vloeistof en gooi de pellet.
7. TS en VS meting van extracten volgens de standaardmethoden ^23.
   1. Neem de bovenstaande en dialyze het voor 24 uur tegen 1000 ml ultrapuur water (dialyse zak met 3500 Da molecuulgewicht cut off (MWCO)) ^11,12. Wijzig de dialyse water na 12 uur om het effect van de dialyse te verbeteren.
   2. Transfer een redelijk deel (ongeveer 1/3) van de gedialyseerde supernatanteen aluminium schotel voor TS en VS meting ^23.
      OPMERKING: nacht bij 105 ° C Droog het monster. Het verschil in gewicht van de lege aluminium gerecht en de aluminium schaaltje met het gedroogde monster is de TS inhoud. Brand vervolgens dezelfde aluminium schaaltje met het monster bij 550 ° C gedurende 2 uur. Het verschil in gewicht tussen de lege aluminium gerecht en de aluminium schaaltje met het verbrande monster is het asgehalte. Het verschil tussen TS en asgehalte is de VS content.
   3. Voor elk extract, breng de resterende fractie van de gedialyseerd supernatant aan 10 ml glazen bekers. Dikker het supernatant gedurende 2 dagen bij 60 ° C tot een uiteindelijk volume van 1-2 ml aan de polymeerconcentratie in het supernatant te verhogen.

2. Alginaat-achtige extracellulaire Polymer (ALE) Extraction

1. Dialyseren het extract verkregen in stap 1.6.8 volgens stap 1.7.1.
2. Breng het extract gedialyseerd in een 250 ml glazen beker. Langzaamly roer de extractie bij 100 rpm en kamertemperatuur. Voortdurend op pH-veranderingen met een pH-elektrode, terwijl het toevoegen van 1 M zoutzuur (HCl) tot een uiteindelijke pH van 2,2 ± 0,05 tot ALE verkrijgen in de zure vorm.
3. Nadat de pH op 2,2, breng het filtraat over in een 50 ml centrifugebuis en gecentrifugeerd bij 4000 x g en 4 ° C gedurende 20 min.
4. Verwijder het supernatant en verzamel de gelachtige pellet. De gelachtige pellet ALE in de zure vorm.
5. Om de natrium (of kalium) vorm van ALE verkrijgen, langzaam 0,5 M NaOH (of 0,5 M kaliumhydroxyde) toe te voegen aan de gel verkregen in stap 2,4, terwijl het mengen van de gel langzaam met een glas stok met de hand tot een pH van 8,5 is bereikt.

3. Ionische Hydrogel Formation Test

LET OP: Om te controleren of de uitgepakte EPS had ionische hydrogel vorming eigenschappen, een test kraal formatie met Ca ²⁺ -ionen werd gebruikt ^25.

1. Na verdikking van het extract in stap 1.7.3 omeen volume van 1-2 ml, langzaam roeren van het mengsel met een glazen staafje en pas de pH tot 8,5 met 0,5 M NaOH.
2. Neem het extract van stap 3,1 of natrium- ALE van stap 2,5 en langzaam druppelen het extract met een Pasteur pipet in een 2,5% (w / v) calciumchloride _(CaCl2) oplossing.
   LET OP: Als de uitgepakte EPS heeft ionische hydrogel gelvormende eigenschappen, druppelvormige (bolvormige) kralen zal worden gevormd. Indien de geëxtraheerde EPS geen ionische hydrogel gelvormende eigenschappen, wordt het extract oplost in de _{CaCl2-oplossing.}

4. Stabiliteit Test van de Ionische Hydrogel

Opmerking: Om de rol van de ionische EPS hydrogel AGS structuurvorming verder te begrijpen, werden stabiliteitstesten uitgevoerd op de ionische hydrogel kralen van de Na ₂ CO ₃ extractie, verzameld in stap 3,2.

1. Houd de hydrogel kralen voor 30 min in CaCl _2-oplossing.
2. Gebruik een lepel tot het afsluiten van de hydrogel kralen uit de _CaCl2 oplossing en splitsing van de kralen in vier gelijke fracties.
3. WINKEL fractie 1 in 10 ml gedemineraliseerd water gedurende 4 uur bij 4 ° C.
   De volgende stabiliteitstesten werden uitgevoerd op dezelfde wijze als beschreven in de extractiemethoden 1,3-1,5.
4. WINKEL fractie 2 in 10 ml 2% (w / v) oplossing EDTA gedurende 3 uur bij 4 ° C.
5. WINKEL fractie 3 in 7,15 ml gedemineraliseerd water met 60 pi 99% formamide gedurende 1 uur bij 4 ° C. Voeg vervolgens 2,85 ml 1 M NaOH en opslag fractie 3 gedurende 3 uur bij 4 ° C.
6. Store fractie 4 in 7,15 ml gedemineraliseerd water met 60 pi 37% formaldehyde gedurende 1 uur bij 4 ° C. Voeg vervolgens 2,85 ml 1 M NaOH en fractie opslag 4 voor 3 uur bij 4 ° C.
7. Controleren of er toegankelijk desintegratie van de korrels tijdens de opslag onder de beschreven omstandigheden in 4,3 - 4,6 te beoordelen of de korrels bestand tegen de extractiecondities.

Resultaten

EPS-extractie
Het uiterlijk van de korrels na het aanbrengen van verschillende EPS extractiemethoden is getoond in figuur 1. De vorm en de gelstructuur van granules intact na centrifugeren (figuur 1a) en EDTA-extractie (figuur 1c). Korrels werden gebroken in fragmenten van verschillende afmetingen door sonicatie. De troebelheid in de vloeistoffase kan het gevolg suspensie van kleine fragmenten (figuur 1b) de troebelheid zeer verzwakte na centrifugeren. Formamide en formaldehyde alleen geen invloed op het veranderen van de vorm van de korrel en de gelstructuur hebben (gegevens niet getoond). Na toevoeging van NaOH, de vloeibare fase bleek geelachtig. Sommige pluizig materiaal werd losgemaakt van het oppervlak van de korrels en vormde een laag boven op de vaste korrels (figuur 1d en 1e). Toch is de vorm van degranules was niet veranderd. De toevoeging van NaOH blijkbaar verbeterde EPS oplosbaar, maar kon niet de gel matrixstructuur beschadigen. In vergelijking, granules volledig verdwenen na Na ₂ CO ₃ extractie (Figuur 1f). In plaats van een mengsel van sol-achtige vloeistof en kleine gelachtige deeltjes werden gevormd met de gelmatrix korrels inderdaad opgelost.

Figuur 1. aërobe korrelslib EPS extracties. Voor een betere visualisatie van het effect van elke extractiemethode op de granules experimenten werden uitgevoerd in 25 ml glazen flesjes. Na de extractieprocedure, de extracten werden 1 uur bij kamertemperatuur bewaard om zwevend stof bezinken. (A) Centrifugeren extractie, (b) Sonicatie extractie, (c) EDTA-extractie, (d) formamide - NaOH extraction, (e) Formaldehyde - NaOH extractie, (f) Een hoge temperatuur -. Na ₂ CO ₃ extractie Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

EPS rendement ten opzichte van de VS fractie elke methode wordt geïllustreerd in Figuur 2. De opbrengst is weergegeven in mg VS _EPS per gram aanvankelijke VS _granule. De hoeveelheid EPS verkregen door formaldehyde + NaOH, formamide + NaOH en Na ₂ CO ₃ + warmte + mengen was hoger dan die van centrifugatie, sonificatie en EDTA-extractie. Vergelijkbare resultaten voor deze extractie technieken werden ook uit eerdere studies ^{11 - 13,15} aangeeft dat alkalische omstandigheden verbeteren EPS oplosbaarheid ^26,27. De hoeveelheid EPS gewonnen door Na ₂ CO ₃ was de hoogste, meer dan 20 keer die van alleen verkregen door centrifugeren. Bovendien kan de totale opbrengst van de EPS Na ₂ CO ₃ extractie verder worden verbeterd door meerdere extracties. Een tweede extractie met behulp van de pellet weggegooid in stap 1.6.8 (protocol deel) van de eerste extractie steeg de totale opbrengst met 28%, een viervoudige extractie zelfs de totale opbrengst steeg met 46%.

Figuur 2. Resultaten van alle extractiemethodes met betrekking tot de VS opbrengst en asgehalte. Voor elke extractie de eerste balk geeft de VS opbrengst in mg VS _EPS per gram aanvankelijke VS _korrel. De tweede balk geeft het gewichtspercentage as in de geëxtraheerde TS. De foutbalken tonen de standaarddeviatie van de drie extracties uitgevoerd voor elke extractietechniek."_blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Alginaat-achtige extracellulaire polymeer (ALE) extractie
Nadat de pH van de EPS extracten volgens de Na ₂ CO ₃ extractie werd bijgesteld tot 2,2, werd 63% van de totale VS neergeslagen. Het neerslag zure ALE ^25. De restfractie zou waarschijnlijk EPS die onder de extractiecondities oplosbaar gemaakt kan worden, maar kan een neerslag bij pH 2,2 vormen.

Ionische hydrogel formatie-test
Aerobic korrels zijn beschreven als vergelijkbaar met een hydrogel. Het granulatieproces is beschouwd als een gelvormende verschijnsel glycosiden als geleermiddel ^4,9,25,28. Normaal, Ca2 ⁺ is een van de meest voorkomende kationen in afvalwater. Bovendien gemakkelijk bindt met zure polysacchariden (bvalginaten en poly-galacturonzuur), vermoedelijk als een contra-ion gelering ²⁹ bemiddelen. Hetgeen resulteert in een ionisch verknoopte hydrogel. Waargenomen werd dat de toevoeging van Ca2 ⁺ -ionen aëroob granulering ³⁰ kan versnellen. Daarom kan Ca2 ⁺ EPS (ionische hydrogel) een belangrijke rol bij de opbouw van de gel matrixstructuur aërobe korrelslib spelen. In dit verband, of de geëxtraheerde EPS vormt een ionische hydrogel met Ca2 ⁺ -ionen kunnen worden gebruikt als een test om te controleren of de geëxtraheerde EPS is een structureel polymeer bijdragen tot de vorming van de gelmatrix in aërobe korrelslib ^9.

In dit onderzoek, de EPS onttrokken AGS (figuur 3a) met verschillende methoden, alleen de EPS geëxtraheerd Na ₂ CO ₃ bezit de vorm van een druppel in 2,5% (w / v) _CaCl2 oplossing en vormde stabiele ionische hydrogel kralen .Bovendien is de natrium ALE verkregen uit dit EPS door extra stappen (ALE polymeer extractie, figuur 3b) weergegeven hetzelfde terrein als goed. De kleur en morfologie van de Ca2 ⁺ -ALE gelparels (figuur 3c) gelijk aan aërobe korrelslib (figuur 3a). Blijkbaar is de EPS extracten volgens de Na ₂ CO ₃ werkwijze bijdraagt aan de vorming van de gelmatrix aërobe korrelslib. ALE, hetgeen een hoofdcomponent van het EPS structurele polymeren kunnen een ionische hydrogel.

Stabiliteitstest van de ionische hydrogel
Waargenomen werd dat bij EPS extractie aërobe granules hielden hun bolvorm in EDTA, formaldehyde en formamide + NaOH NaOH + (figuur 1). Om te begrijpen als de geëxtraheerde structurele polymeren een rol in de stabiliteit van de granules spelen, Ca ²⁺ waren -ALE kralenprecies op dezelfde manier behandeld als aërobe granules tijdens de extractie. Interessant is weergegeven Ca ²⁺ -ALE kralen de soortgelijke stabiliteiten als die van AGS (figuur 3d - 3f), dat wil zeggen, Ca ²⁺ -ALE kralen waren zeer stabiel in EDTA. Er was weinig hoeveelheid ALE los van het oppervlak van Ca2 ⁺ -ALE kralen (kleine bruine floc in figuur 3e en 3f), wanneer de Ca2 ⁺ -ALE kralen waren gedrenkt in formaldehyde en formamide + NaOH NaOH + drie uur respectievelijk. Deze gelijkenis in termen van stabiliteit tussen Ca ²⁺ -ALE kralen en aerobic korrels geeft aan dat ALE zijn een deel van de belangrijke structurele polymeren die de AGS gel matrix.

Figuur 3. Aerobic korrels en geëxtraheerd ALE. (A) korrels in gedemineraliseerd water prIOR extractie. (B) Zure ALE (geëxtraheerd overeenkomstig de punten 1.6 en 2) na centrifugeren bij 4000 x g en 4 ° C gedurende 20 min. Resultaten van de stabiliteitstest van de ionische hydrogel. (C) Ca ²⁺ -ALE-korrels opgeslagen in gedemineraliseerd water gedurende 4 uur bij 4 ° C. (D) Ca2 ⁺ -ALE-kralen bewaard in 2% EDTA, gedurende 3 uur bij 4 ° C. (E) Ca2 ⁺ -ALE-korrels opgeslagen in formamide + NaOH gedurende 4 uur bij 4 ° C. (F) Ca ²⁺ -ALE-kralen opgeslagen in formaldehyde + NaOH gedurende 4 uur bij 4 ° C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Aanwijzingen voor de sectie protocol
De winning van EPS / ALE beschreven voor een volume van 50 ml en 3 g granulaat. Deze waarden zijn bedoeld als richtlijnen. Extracties met hogere concentraties granule kan de opbrengst van de geëxtraheerde EPS verlagen. Tijdens de extractie van ALE gelijkblijvende temperatuur gedurende 30 minuten worden bewaard bij 80 ° C. De tijd die het mengsel te verwarmen (ongeveer 5 minuten) is opgenomen in het protocol. Bovendien wordt de extractie efficiëntie verbeterd door gebruik van een magnetische roerstaaf van dezelfde grootte als de diameter van de bodem kolf. Dit zal resulteren in goede menging eigenschappen en effecten frezen, bevorderen de winning van EPS.

Later in het gedeelte protocol, TS en VS opbrengsten van alle extracties (supernatant verzameld in stappen 1.1-1.6) bepaald. Dialyse moet worden uitgevoerd voorafgaand aan TS en VS meting mogelijke fouten door de aanwezigheid van chemische stoffen die voor extracties verminderen. EENMWCO van 3500 Da wordt aanbevolen om deze stoffen te verwijderen met behoud van de EPS macromoleculen binnen de dialyse zak. De dialyse zak moet een groter volume dan het volume van het extract zijn. Dit is nodig omdat de volume van het extract zal verhogen tijdens de dialyse (bijvoorbeeld voor extractie EDTA tot 40% volumetoename). De mate van chemische verwijdering door dialyse kan worden bepaald door meting van de pH in het monster voor en na dialyse. Als alternatief, geleidbaarheid metingen van de dialyse water geven de omvang van de ionen te verwijderen.

Om ALE krijgen van het totaal geëxtraheerde EPS (stap 1,6 en 2) de dialyse is optioneel. Niettemin dialyse drie voordelen: het vermindert de hoeveelheid HCl nodig voor het neerslaan, verbetert het zuur stofoverdracht in het extract afneemt en het asgehalte van het verkregen ALE. Voor de precipitatie van ALE wordt aanbevolen een glazen beker gebruiken met een veel groter volume dan de winningt. Na ₂ CO ₃ wordt normaal overdosis bij de extractie. De toegevoegde HCl eerst reageren met de Na ₂ CO ₃ links in het extract, als gevolg de vorming van kooldioxide en, indien het monster niet eerder werd gedialyseerd in schuimen. Tijdens de toevoeging van HCl, moet het extract langzaam geroerd met een magnetische roerstaaf van dezelfde grootte als de bodem van het bekerglas. Een roerstaaf van deze omvang en langzaam roeren zal resulteren in nog mengen zonder de structuur van het neerslag. Als zure gel klontjes gevormd in het extract, moet de beker iets worden gedraaid met de hand. De precipitatie wordt uitgevoerd met een zuur concentratie van 1 M tot een grote volumetoename van het extract vermijden terwijl toch een homogene verdeling van het zuur in het monster wordt verkregen. Hogere concentraties zuur kan resulteren in een regionaal pH daling en zure gel klonten vormen. Een pH hoger dan 2,0 vermindert de hoeveelheid ALE die kunnen worden hersteld, waarschijnlijk door structurele veranderingenvan de polymeren bij lagere pH. Het is daarom belangrijk om de uiteindelijke pH op 2,20 ± 0,05 te houden.

beperkingen
De ALE extractiemethode op structurele wijze extracellulaire polymeren van het EPS van AGS of biofilms in het algemeen extraheren en is niet bedoeld om alle aanwezige EPS extraheren. Alle EPS extract, een combinatie van meerdere extractiemethode noodzakelijk. Zoals getoond met de toename van de opbrengst VS _EPS door een dubbele en viervoudige extractie, één extractie niet pak het structurele EPS. ALE-extractie is een harde EPS extractie methode, een combinatie van constant mengen met warmte en alkalische omstandigheden. Daarom is het mogelijk dat sommige intracellulair materiaal samen wordt geëxtraheerd met EPS. Hoewel cellysis kan worden veroorzaakt door fysische en chemische extractietechnieken (sonicatie ^{31,32, 31,32} NaOH, ^11,32 EDTA, CER ^{32, 32} warmte en hoge afschuifsnelheden door mixing ^19), de aanwezigheid van intracellulair materiaal teruggewonnen EPS moet nog worden geverifieerd. De ionische gelvormende eigenschap van het gewonnen EPS is de belangrijkste focus van dit onderzoek of de herstelde EPS bevat intracellulaire materiaal werd niet geanalyseerd. Toekomstig onderzoek zal zich richten op het identificeren van intracellulaire materiaal in de uitgepakte EPS.

Oplossen van de hydrogel matrix van AGS cruciaal structurele EPS extraheren
EPS vormt een dichte en compacte hydrogel matrix AGS. Hoewel EPS bevat verschillende klassen van organische macromoleculen zoals polysacchariden, eiwitten, nucleïnezuren, (fosfo) lipide, humusstoffen en sommige polymeren intercellulaire ^7,5,8, niet allemaal een gel vormen. Alleen die gelvormende polymeren worden hier beschouwd als structurele polymeren EPS.

Doel van EPS extracties is om eerst oplosbaar EPS en vervolgens de opgeloste EPS verzamelen. Als de structurele EPS (dat wil zeggen, thij EPS vormen van een hydrogel) is het doel van de extractie, de gelmatrix van AGS moet eerst worden opgelost. Alleen methoden die de gelmatrix kunnen oplosbaar zijn kunnen extraheren structurele EPS. In dit onderzoek, een aantal veel gebruikte EPS extractiemethodes zoals centrifugeren ^10-15, sonicatie ^10,14,15, EDTA ^{10 - 12,14,15,} formaldehyde + NaOH ^10-15 en formamide + NaOH ¹³ kon niet op efficiënte wijze de structurele isoleren EPS. Dit komt door het feit dat de hydrogel matrix van de aërobe granules niet werd opgelost met deze werkwijzen. Om deze reden werden de stabiliteit testen in hoofdstuk 4 alleen uitgevoerd met voorwaarden aanwezig in EDTA, formamide + NaOH en formaldehyde + NaOH extractie. Deze drie extracties waren niet in staat isoleren structurele EPS, maar verkregen de hoogste VS _EPS opbrengst naast de Na ₂ CO ₃ extractie. voorwaarden of de Na ₂ CO _3-extractie werden niet toegepast als deze extractie methode duidelijk oplosbaar de AGS matrix. Vandaar dat de toegepaste omstandigheden tijdens de stabiliteit proef representatief geacht.

Extractie met kationuitwisselingshars (CER), een andere veelgebruikte EPS extractiemethode, werd niet in aanmerking voor deze vergelijking, zoals eerdere studies over EPS extractie met CER geen betere resultaten dan de chemische extracties hier gebruikt opleverde.

Gel-vormende EPS in AGS
Gelvormende EPS worden beschouwd als structurele EPS in de hydrogel matrix van AGS. Het is de moeite waard erop te wijzen dat er verschillende soorten hydrogels zoals ionische gels, temperatuur geïnduceerde gels en pH geïnduceerde gels. Dit onderzoek richt zich alleen op EPS dat ionische gels vormen. Wat de grote fractie structurele gelmateriaal geëxtraheerd, dit wordt waarschijnlijk het overheersende structurele EPS. Er zijn zeker mogelijkheden die andere vormen van EPSdie vorm verschillende hydrogels (bijvoorbeeld pH geïnduceerde gel ²⁸⁾ bestaan in dezelfde of andere soort van aërobe granules. Niettemin, het maakt niet uit wat voor soort hydrogel is gericht, oplossen van de EPS gelmatrix is ​​de belangrijkste stap om gelvormende EPS halen.

Op dit moment is er weinig onderzoek gedaan naar structurele winst per aandeel van korrelslib. De ALE extractie beschreven in dit protocol kan extraheren gelvormende EPS van AGS en worden gebruikt in toekomstige studies structurele EPS karakteriseren. Meer onderzoek moet worden gedaan op de AGS, structurele EPS en niet-structurele EPS om beter te begrijpen van het proces en de functie van granulatie en EPS. Vooral de volgende drie punten moeten worden onderzocht waarom micro- organismen een grote hoeveelheid EPS, wat de exacte samenstelling van EPS en hoe de samenstelling van EPS bijgesteld worden op omgevingsveranderingen produceren. Detecteren en analyseren van alle betrokken verbindingen en hun interactions zal helpen om biofilms en hoe ze te gebruiken in ons voordeel te begrijpen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
250 ml baffled flask	Kimble	25630-250
1,000 ml glass beaker	VWR	213-1128
RCT basic, magnetic stirrer with thermometer	IKA	3810000
sodium carbonate decahydrate	Merck KGaA	1063911000
50 ml centrifugation tubes	greiner bio-one	227261
Multifuge 1 S-R, centrifuge	Heraeus/Thermo Scientific	-
hydrochloric acid, 37%	Sigma-Aldrich	30721-1L-GL-D
250 ml glass beaker	VWR	213-1124
calcium chloride dihydrate	Merck KGaA	1023821000
1 ml Pasteur Pipette	Copan	201C