We beschrijven een high-throughput, multiplex en gerichte proteomische cerebrospinale vloeistof (CSF) test ontwikkeld met potentieel voor klinische toepassing. De test kan kwantificeren potentiële markers en risicofactoren voor neurodegeneratie zoals de apolipoproteïne E varianten (E2, E3 en E4), en de allelische expressie te meten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een High Throughput, multiplexverzending en Gerichte Proteomic CSF Assay te kwantificeren neurodegeneratieve Biomarkers en apolipoproteïne E isovormen Status
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Veel neurodegeneratieve ziekten nog ontbreken effectieve behandelingen. Betrouwbare biomarkers voor het identificeren en classificeren van deze ziekten is belangrijk in de ontwikkeling van toekomstige nieuwe therapieën. Vaak potentiële nieuwe biomarkers niet maken in de kliniek als gevolg van beperkingen in hun ontwikkeling en hoge kosten. Echter, gerichte proteomics behulp Multiple Reaction Monitoring vloeistofchromatografie-tandem / massaspectrometrie (MRM LC-MS / MS), in het bijzonder via triple quadrupole massaspectrometers, is een methode die kan worden gebruikt om snel evalueren en valideren van biomarkers voor klinische toepassing in diagnostische laboratoria . Traditioneel is dit platform uitgebreid gebruikt voor het meten van kleine moleculen in klinische laboratoria, maar het is de mogelijkheid om eiwitten te analyseren, waardoor het een aantrekkelijk alternatief voor ELISA (Enzyme-Linked Immunosorgebogen Assay) gebaseerde methoden. We beschrijven hier hoe gerichte proteomics kan worden gebruikt om multiplex merkers van dementie, waaronder de detectie en kwantificering van het bekende risicofactor apolipoproteïne E isoform 4 (ApoE4) te meten.
Om de test geschikt is voor translatie te maken, is het ontworpen snelle, eenvoudige, zeer specifiek te zijn en kosteneffectief. Hiertoe moet elke stap in de ontwikkeling van de test worden geoptimaliseerd voor de individuele eiwitten en weefsels ze geanalyseerd. Deze methode beschrijft een typische workflow waaronder diverse tips en trucs om een gerichte proteomics MRM LC-MS / MS vertaling .
De methode ontwikkeling is geoptimaliseerd met behulp van aangepaste gesynthetiseerde versies van tryptische quantotypic peptiden, waarbij de MS kalibreren voor detectie en vervolgens verrijkt in CSF om correcte identificatie van de endogene peptide te bepalen in de chromatografische scheiding vóór de analyse in de MS. Om absolu te bereikente kwantificering stabiele isotoop gemerkte interne standaard versies van de peptiden met korte aminozuursequentie labels en met een trypsine splitsingsplaats, zijn opgenomen in de test.
Inleiding
De groeiende invloed van neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer, Lewy Body dementie en de ziekte van Parkinson, wordt een sociaal-economisch probleem in veel landen 1. Er is behoefte aan extra biomarkers die kunnen worden gebruikt voor het identificeren en classificeren van patiënten in de vroege stadia van de ziekte, en eventuele nieuwe behandelingen te volgen. Het algemene doel van deze methode is om een generieke pipeline een gestroomlijnde, economische en snellere manier valideren potentiële CSF markers van neurodegeneratie. 'Logisch gerichte proteomics of peptide MRM LC-MS / MS als een gemakkelijk wijzigbaar methode meerdere po....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
LET OP:. Een schema van de totale protocol hier beschreven wordt gegeven in Fi guur 1 All gebruikt voor de ontwikkeling van deze methode monsters zijn surplus klinische diagnostische monsters en hebben ethische goedkeuring van de London Bloomsbury ethische commissie.
Figuur 1. Schematische illustratie van het totale proces van het creëren van een gerichte CSF MRM LC-MS / MS Assay. Candidate marker peptiden voor de evaluatie zijn geselecteerd uit eiwit....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Volgens de methode hierboven beschreven een high throughput 10 min multiplex assay bestaat uit 74 peptiden uit 54 eiwitten werd ontwikkeld als een test voor markers van neurodegeneratieve aandoeningen de ziekte van Alzheimer en Lewy Body Dementie (LBD) 8. Figuur 3 toont een multiplex chromatogram gepubliceerd eerder 8 van de belangrijke peptide markers van de test. De peptiden in de assay en de kwantitatieve overgangen worden in tabel 2.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Zoals bij alle MS gebaseerde testen, de kritische stappen in de werkwijze de bepaling van de juiste en nauwkeurige hoeveelheden interne standaarden. Als absolute kwantificatie wordt gebruikt, dan is de juiste hoeveelheden spiked peptiden in de standaardkromme zijn ook kritisch.
Onze assay niet het neerslaan van het CSF of het gebruik van elke soort opruimen of ontzouting stappen voorafgaand aan MS analyse nodig - het is een volledig éénpotsreactie methode. Door de geringe omvang van CSF en d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd en mogelijk gemaakt door de GOSomics-onderzoeksinitiatief van het National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre bij Great Ormond Street Hospital en het UCL Biological Mass Spectrometry Centre bij het UCL Institute of Child Health met vriendelijke donaties van de Szeban Peto Foundation. Het Dementia Research Centre is een coördinerend centrum van Alzheimer's Research UK. De auteurs erkennen de steun van Alzheimer's Research UK, de NIHR Queen Square Dementia Biomedical Research Unit, UCL/H Biomedical Research Centre en het Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 | |
| Formic acid, LC-MS grade, | Fisher | A117-50 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 - 5 g | |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028 - 2.5 LG | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149 - 5 g | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 | |
| Urea | Sigma | U0631- 500 g | |
| Water, LC-MS ULTRA Chromasolv | Fluka | 14263 | |
| Custom synthesised peptides desalted 1-4 mg | Genscript | custom | |
| heavy labeled amino acid [13C; 15N] custom peptides | Genscript | custom | |
| ASB 14 | Merck Millipore | 182750 - 25 g | |
| Thiourea | Sigma | T7875 - 500 g | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| VanGuard precolumn | Waters | 186007125 | |
| Cortecs UPLC C18 + 1.6 μm 2.1 x 50 mm column | Waters | 186007114 | |
| Yeast Enolase | Sigma | E6126 | |
| 300 μl clear screw top glass vials | Fisher scientific | 03-FISV | |
| Y slit screw caps | Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X | |
| Freeze dryer | Edwards Mudulyo | Mudulyo system | |
| Concentrator/Speed vaccum | Eppendof | concentrator plus 5301 | |
| Xevo -TQ-S mass spectrometer | Waters | ||
| Acquity UPLC system | Waters |
Referenties
- Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050. , Alzheimers Disease International. Available from: http://www.alz.co.uk/research/G8-policy-brief (2013).
- Hirtz, C., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
