De adsorptie van peptiden op plastic tijdens traditionele seriële verdunningen met pipetpunten kan de bepaling van de potentie aanzienlijk beïnvloeden en het begrip van structuur-activiteitsrelaties verwarren die worden gebruikt voor fasen van loodidentificatie en loodoptimalisatie in de ontdekking van geneesmiddelen. Hier worden methoden beschreven voor geautomatiseerde akoestische non-contact seriële verdunning van peptidemonsters.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Geautomatiseerde Acoustic Afgifte voor de seriële verdunning van Peptide agonisten in potentie Bepaling Testen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zoals met kleinmoleculige geneesmiddelen, screenen op peptide agonisten vereist seriële verdunning van peptiden naar concentratie-respons curves produceren. Screening peptiden biedt een extra complexiteit conventionele tip gebaseerde steekproef behandelingsmethoden peptiden blootstellen aan een groot oppervlak van plasticware, die een verhoogde kans peptide verlies via adsorptie. Waardoor een overmatige blootstelling aan plasticware peptide vermindert verlies via hechting aan kunststoffen en dus minimaliseert onnauwkeurigheden in potentie voorspelling, en we hebben eerder beschreven voordelen van contactloze akoestische afgifte in vitro high-throughput screening van peptide agonisten 1. Hier bespreken we een volledig geïntegreerde automatiseringsoplossing voor contactloze akoestische bereiding van peptide seriële verdunningen in microtiterplaten met gebruikmaking van het voorbeeld voor het screenen op peptide agonisten bij de muis glucagon-achtige peptide-1 receptor (GLP-1R). Onze methoden zorgen voor een hoge-throughput cell-based assays voor het screenen op agonisten en zijn gemakkelijk schaalbaar naar grotere monsters worden verwerkt ondersteunen of te zorgen voor een verhoogd aantal testplaat kopieën (bijvoorbeeld voor een panel van meer doel cellijnen).
Inleiding
De GLP-1R is een gevestigde drug target in de behandeling van type 2 diabetes 2. Het natieve peptide agonist voor deze receptor, GLP-1 heeft een in vivo halfwaardetijd van 2-3 minuten 3. De binding van GLP-1 zijn G-eiwit gekoppelde receptor leidt tot doel de verwerking tot de tweede boodschapper cAMP met natief G-proteïne koppeling aan de activering van adenylylcyclase. Meting van de geaccumuleerde cAMP werd een degelijke test om receptoractivering controleren en te screenen op actieve GLP-1 analoga met voorkeur fysicochemische eigenschappen. Een dergelijke bepaling vereist seriële verdunning van de monsters concentratie-respons curves construeren, en dit is bijzonder moeilijk bij de afgifte van peptide monsters. Mogelijke fouten uit-tip op basis van seriële verdunning voorbereiding zijn eerder 1,4,5 beschreven. Peptiden zullen adsorberen aan plasticware, wat resulteert in onbetrouwbare potentie schattingen. Peptide verlies kan worden geminimaliseerd dezhij opneming van runderserumalbumine (BSA) in buffers en het gebruik van silicium voorziene plasticware, maar blijft de eiwitbinding onvoorspelbaar. Met name de variatie in binding van GLP-1 experimentele containers beschreven 6. Er is een bijkomende complicatie, dat stabilisatiemiddelen gebruikt in laboratoria plasticware kunnen uitlogen van tips en microtiterplaten in waterige assay buffers en interfereren met eiwitfunctie 7, 8. Daarom methoden om blootstelling aan plasticware nodig om de nauwkeurigheid van de metingen te verbeteren.
Akoestische vloeistof dispensers richten hoogfrequente akoestische signaal op het oppervlak van een vloeistofmonster, waardoor het uitstoten van precieze nanoliter druppeltjes in een aangrenzende testplaat 9. Het gebruik van akoestische ejectie is standaard in de farmaceutische industrie voor de voorbereiding en screening van grote synthetische verbinding bibliotheken, en de technologie is goed gevalideerd voor kleine molecules 10. Voor zover wij weten, zijn wij de eerste groep van akoestische afgifte beschrijven de bereiding van recombinant en synthetische peptiden en we hebben eerder gemeld de verbeterde nauwkeurigheid in vergelijking met conventionele tip gebaseerde methoden 1.
Dit artikel beschrijft de integratie van de voorbereiding van de peptide seriële en directe verdunningen van non-contact akoestische overgang naar een volledig geautomatiseerde plaat omgaan met robotica-systeem. Een aantal werkwijzen omvattende akoestische monsteroverdracht zijn eerder 11 beschreven. We gebruiken een tweestapswerkwijze tussenliggende stock concentraties bereiden en serieel verdund peptide analogen voor de vorming van de volledige dosis-responscurve. De bereide peptiden worden geïncubeerd met cellen die het doelwit muis GLP-1R, en we gebruiken een commercieel verkrijgbare homogene-time fluorescentie (HTRF) test om cAMP ophoping binnen deze cellen te meten als een uitlezing van de peptide-agonist activteit. De test is robuust en vatbaar voor een hoge doorvoer 384 putjes en routinematig toegepast op zowel assay ontwikkeling en het screenen van geneesmiddelen 12 projecteert.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Peptide seriële verdunning
- Bereid testbuffer: Hanks gebufferde zoutoplossing (HBSS), aangevuld met 25 mM HEPES, 0,1% BSA en 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), pH 7,4.
- Gebruik een bulk reagens dispenser systematisch toe 5 pl testbuffer aan elk putje van 384 putjes vijf low volume testplaten.
- Gebruik interne software om een afgifte programma creëren 5 ul volume toevoeging aan elk putje van een 384-putjes volgens de instructies van de fabrikant.
- Dompel het afgeven cassette slang in testbuffer en prime vloeistof.
- Plaats 384-wells laag volume assay plaat op plaat carrier.
- Druk op start.
- Verdunnen alle peptide monsters, ongeacht de opslag voertuig in assay buffer tot een 100x peptide voorraad te produceren.
OPMERKING: Peptiden die screening kan in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) of dimethylsulfoxide (DMSO) als passend wordt geacht (bijvoorbeeld DMSO whebben slecht een schadelijke werking op peptiden met secundaire modificaties zoals PEGylatie). - Verdeel 25 ul 100x peptide voorraden in kolommen 1-5 van een akoestisch gekwalificeerde 384-well polypropyleen microplaat. Deze plaat wordt aangeduid als 'bron plaat A'. Zorg ervoor dat de bron platen, maar niet de bestemming platen, zijn platte bodem en voldoen aan de specifieke akoestische toleranties zoals gedefinieerd door de fabrikant van akoestische instrumenten.
- Verdeel 25 ul 100x verwijzing controle in putten A23 en A24 van de bron plaat A.
- Verdeel 10 ul assaybuffer in kolommen 11-15 en 30 pi testbuffer in kolommen 21-22 van de bron plaat A.
- Verdeel 10 ul assaybuffer in kolommen 6-10 en kolommen 16-20 van een tweede akoestisch gekwalificeerde 384-well polypropyleen microplaat. Deze plaat wordt aangeduid als 'bron plaat B'.
- Centrifuge bronplaten A en B bij 300 xg gedurende 1 min. Omvatten een passend evenwicht plaat.
- Gebruik akoestische fluid dispensers geïntegreerd in een geautomatiseerd robotsysteem drie opeenvolgende bereiden 1: 100 verdunningen tussenproduct (in testbuffer) van de 100x peptide bestanden uit kolom 1 in bron A.
OPMERKING: Programmeren vereist plaat opnieuw te formatteren en dosis-respons-software (zoals bepaald door de fabrikant van de akoestische vloeistof dispenser) tot drie akoestische overdracht tussen bron A en bron B (zie figuur 1 voor de plaat lay-outs) mogelijk te maken. Stap 1.9 Gegevens specifiek het gebruik van vloeistof dispensers die in dit laboratorium onder geautomatiseerde robotische controle (zie Materialen tabel):- Load bron borden en assay platen in plaat hotel deel van de robotica.
- Open geautomatiseerde robot software en de belasting plaat opnieuw te formatteren en dosis-respons-programma uitbreiding protocollen. Klik op 'Uitvoeren'.
LET OP: Automation instrueert een akoestische vloeistof dispenser tot 250 nl overbrengen van kolommen 1-5 van de bron plaat Een in kolommen 6-10 van de bron plaat B, en een tweede Acoustic vloeistof dispenser staat de behandeling van grotere volumes vloeistof om opvulling met 15 ul assaybuffer te mengen. Automation draagt dan bron plaat B geïntegreerde centrifuge en centrifuges bij 300 g gedurende 1 min (een goed evenwicht plaat is opgenomen voor alle centrifugeren stappen). Bronplaat B wordt teruggevoerd naar de akoestische vloeistofhouder voor de overdracht van 250 nl van kolommen 6-10 bronplaat B in kolommen 11-15 bronplaat A en opvulling met 15 pi testbuffer te mengen. Automatisering transfers bronplaat Een geïntegreerde centrifuge en centrifuges bij 300 xg gedurende 1 min. Bronplaat A wordt vervolgens naar de akoestische vloeistofhouder voor de overdracht van 250 nl van kolommen 11-15 bronplaat A in kolommen 16-20 bronplaat B opvulling met 15 pi testbuffer te mengen. Automation draagt dan bron plaat B geïntegreerde centrifuge en centrifuges bij 300 g gedurende 1 minuut.
LET OP: Tenslotte is de dosis-respons-protocol stuurt akoestische afgifte over te dragende vereiste hoeveelheid van elk van de 4 serieel verdund bronplaat putjes (zowel bronplaat A en bronplaat B) om een volledig 11-curve te construeren in tweevoud in testplaten (voorgevuld met 5 pl assaybuffer in stap 1.2 ). Automatisering transfers testplaat geïntegreerde centrifuge en centrifuges bij 300 xg gedurende 1 min.
2. Celbereiding
- Dooi gecryopreserveerde Chinese hamster ovarium (CHO) cellen die het doelwit muis GLP-1 receptor snel in een 37 ° C waterbad en resuspendeer in 20 ml assaybuffer.
- Centrifugeer celsuspensie gedurende 5 minuten bij 200 xg bij kamertemperatuur (RT). Omvatten een passend evenwicht.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer celpellet in 10 ml assaybuffer.
- Verdun cel voorraad 1: 1 in trypan blauw en bepalen levensvatbare celdichtheid met behulp van een geautomatiseerde cel teller. Resuspendeer cellen in assaybuffer bij 1,6 x 10 6 cellen per ml (equivalent aan 8000 cellen per well testplaten).
- Gebruik een bulk reagens dispenser 5 gl celsuspensie toe aan elk putje van de assay platen (die serieel verdund peptiden in 5 pl testbuffer) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
3. HTRF cAMP Detection Assay
- Breng HTRF cAMP assay kit tot kamertemperatuur gedurende 30 min vóór gebruik.
- Bereid elke HTRF reagens (cryptaat en d2) afzonderlijk op 1:20 verdunning in lysisbuffer (eigen formulering, die door de fabrikant van cAMP detectie assay).
LET OP: LET OP: Lysis buffer bevat kaliumfluoride (KF), die giftig is en een teratogeen 13. Voor het afvoeren, moet assay platen met KF worden verzegeld en verbrand, en alle vloeibare afvalstoffen moet worden verdund tot <1 mmol / l met water voordat het wordt afgevoerd door de gootsteen. - Gebruik een bulk reagens dispenser tot 5 pl cryptaat reagens toe te voegen aan alle putjes van de testplaten.
- Gebruik een bulk reagens dispenser tot 5 pl d2 reagens toe te voegen aan columns 1-22 van de testplaten.
- Onmiddellijk handmatig pipet 5 ul lysisbuffer in putten A23-D24 van de testplaten om niet-specifieke binding (NSB) controleputjes en 5 ui d2 reagens in putten E23-P24 geven.
- Centrifugeer de assay platen gedurende 1 min bij 200 x g bij kamertemperatuur aan de putjes te mengen.
- Bedek de assayplaten verdamping en foto-bleken minimaliseren en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Meet de fluorescentie-resonantie-energie-overdracht (FRET) signaal met behulp van excitatie bij 320 nm en emissie bij 620 nm en 665 nm met behulp van een plaat lezer.
4. Data Analysis
- Gebruik betekenen NSB op de achtergrond af te trekken van alle putjes.
- Bereken% Delta F van de 665 nm / nm-verhouding 620 als volgt:
Ratio = (A 665nm / A 620 nm) x 10 4
Delta F = ((Sample Ratio - Ratio NSB) / Ratio NSB)) x 100
waarbij Ratio NSB = putten zonder d2 reagens. - Bereken% activation tussen niet gestimuleerde cellen en cellen gestimuleerd met maximum GLP-1 ligand als volgt:
% Activering = (% Delta Fsample -% DeltaFunstimulated cellen) / (% DeltaFGLP-1 gestimuleerde cellen -% DeltaF ongestimuleerde cellen) x 100 - Analyseer concentratie-respons curves via 4-parameter logistieke analyse, en de grafiek zo% activering, zoals gedefinieerd door verwijzing controle 1.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We routinematig gebruik van een twee-staps methode om peptiden te verdunnen via akoestische overdracht. Voor de eerste stap, wordt een akoestische dispenser afgestemd automatisering gebruikt vier stock peptide tussenliggende verdunningen over twee bronplaten maken (figuur 1a, b). Voor de tweede stap, gebruiken we een akoestische dispenser verder verdunnen stock verdunningen van bronplaten A en B een 11-punts concentratiebereik voor elke test peptid...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft de succesvolle toepassing van geautomatiseerde akoestische afgifte aan peptide monsters serieel verdunnen over een concentratiegebied van 3 x 10 6 die minder dan 1 pl monster. Het grote voordeel van deze methode is de gegevenskwaliteit verhogen door het minimaliseren peptide adsorptie aan plasticware via verminderde blootstelling monsters experimentele containers en plasticware (zoals pipetpunten) die normaal voor reagensoverdracht en mengen vereist. Terwijl de akoestische afgifte niet...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Bereidt als 0,5 M stock in DMSO |
| GLP-1 (7-36) amide | Bachem | H-6795 | Bereidt als 1 mg/ml stock in PBS, aangeduid als '100x referentiële controle' |
| Testpeptiden | Geproduceerd in-house bij MedImmune | Geleverd in verschillende concentraties in DMSO of PBS, afhankelijk van het geval | |
| 100x peptide stock | Geproduceerd in-house bij MedImmune | Testpeptiden verdund tot 100x in de uiteindelijk vereiste concentratie in de assaybuffer | |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Cedex XS Cell Analyzer | Innovatis | ||
| Corning 384 well plates, low volume | Sigma-Aldrich | 4514 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate | Labcyte Inc. | P-05525 | |
| Echo Qualified Reservoir | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
| Echo 550 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Druppeltransfervolumes in stappen van 2,5 nl | |
| Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Druppeltransfervolumes in stappen van 25 nl | |
| ACell Benchtop Automation | HighRes Biosolutions | MC522 | |
| Cellario Lab Automation Scheduling software voor Life Science Robotics | HighRes Biosolutions | ||
| MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermoFisher Scientific | 5840300 | Aangeduid als 'bulk reagent dispenser' |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer |
Referenties
- Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow. J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).
- Campbell, J. E., Drucker, D. J. Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action. Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).
- Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects. Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).
- Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments. J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
- Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses. PLoS ONE. 8 (5), 62325(2013).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
- McDonald, G. R., et al. Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware. Science. 322 (5903), 917(2008).
- Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I. Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).
- Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).
- Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).
- Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology. J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).
- Butler, R., et al. Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery. J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).
- Panchal, S., Verma, R. J. Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration. Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).
- Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies. J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).
- Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments. J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
- Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing. J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).
- Roberts, K., et al. Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays. J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
