Methodenartikel

Genereren van tweekleurige Antigen Microarrays voor de simultane detectie van IgG en IgM Autoantistoffen

DOI:

10.3791/54543

⸱

15 september 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Multi-Organ Transplant Program, University Health Network, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Divison of Neurosurgery, University Health Network, 4Division of Cardiac Surgery, University Health Network

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven hier een methode om aanpasbare antigeen-microarrays te genereren die kunnen worden gebruikt voor de gelijktijdige detectie van serum IgG en IgM auto-antilichamen van mensen en muizen. Deze arrays maken een doorvoer en kwantitatieve detectie mogelijk van antilichamen tegen willekeurige antigenen of epitopen van belang.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auto-antilichamen, die antilichamen zijn tegen zelf-antigenen, zijn aanwezig in veel ziektetoestanden en kunnen dienen als markers voor ziekteactiviteit. De niveaus van auto-antilichamen tegen specifieke antigenen worden typisch gedetecteerd met de enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) techniek. Het screenen op meerdere auto-antilichamen met ELISA kan echter tijdrovend zijn en vereist een grote hoeveelheid monsters van patiënten. De antigen microarray techniek is een alternatieve methode die kan worden gebruikt om auto-antilichamen op een multiplex manier te screenen. In deze techniek worden antigenen gearrayd op speciaal gecoate microscoopglazen met een robotische microarrayer. De glazen worden onderzocht met serummonsters van patiënten en vervolgens worden fluorescent-gelabelde secundaire antilichamen toegevoegd om binding van serum auto-antilichamen aan de antigenen te detecteren. De reactiviteit van de auto-antilichamen wordt onthuld en gekwantificeerd door de glazen te scannen met een scanner die fluorescente signalen kan detecteren. Hier beschrijven we methoden om aangepaste antigen microarrays te genereren. Onze huidige arrays worden gedrukt met 9 vaste pins en kunnen tot 162 antigenen bevatten die in duplicaat zijn aangebracht. De arrays kunnen eenvoudig worden aangepast door de antigenen in de bronplaat te veranderen die door de microarrayer wordt gebruikt. We hebben een tweekleurige detectiemethode voor secundaire antilichamen ontwikkeld die IgG en IgM reactiviteit op hetzelfde glazuuroppervlak kan onderscheiden. Het detectiesysteem is geoptimaliseerd om binding van humane en muis-auto-antilichamen te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autoantilichamen zijn aanwezig in veel ziektetoestanden en kunnen vaak direct pathogene activiteit hebben1. Identificatie van autoantilichamen is belangrijk voor de diagnose van bepaalde ziekten, voor de prognose van het verloop van de ziekte en voor de classificatie van patiënten die mogelijk baat hebben bij specifieke therapieën2. Autoantilichamen worden doorgaans in patiëntenserum geïdentificeerd met behulp van de ELISA-techniek; het screenen op meerdere antigenen met deze techniek is echter arbeidsintensief en vereist een grote hoeveelheid monsters. Nieuwe technologieën zijn daarom nodig om autoantilichamen op grotere schaal te profileren.

De antigeenmicroarraytechniek is een proteomische technologie die het mogelijk maakt om autoantilichamen multiplex te profileren3. In de eerste stap van dit proces wordt een antigeenbibliotheek gearrayeerd op een schuifoppervlak met behulp van een robotische microarrayer. De schuiven worden beproefd met verdund serum en vervolgens worden fluorescent gelabelde secundaire antilichamen toegevoegd. Antilichaamreactiviteiten worden gevisualiseerd door de schuiven te scannen met een microarrayscanner en gekwantificeerd door fluorescente intensiteiten. Antigene microarrays bieden meerdere voordelen ten opzichte van de ELISA-techniek bij het screenen op autoantilichamen: 1) ze vereisen slechts microliters serum om autoantilichamen tegen meerdere antigenen gelijktijdig te profileren, 2) ze gebruiken antigeen spaarzaam, aangezien slechts nanoliters antigeen op de arrays worden aangebracht, 3) ze hebben een verbeterde gevoeligheid3 in vergelijking met ELISA en 4) ze maken de gelijktijdige, maar aparte detectie van meer dan één antilichaamisotype mogelijk. Antigene microarrays zijn gebruikt om autoantilichamen in auto-immuunziekten zoals reumatoïde artritis, multiple sclerose en systemische lupus erythematodes4-6 te profileren. In alle drie deze ziekten werd nieuwe inzicht in de ziektepathogenese verkregen door autoantilichamen op grote schaal met de arrays te profileren.

Hier beschrijven we een protocol om antigeenmicroarrays te genereren met behulp van met nitrocellulose beklede schuiven. Een verscheidenheid aan antigenen, waaronder eiwitten, peptiden en celextracten, kan met deze techniek op de schuiven worden gearrayeerd. De arrays kunnen eenvoudig worden aangepast door antigenen van belang in de bronplaat die de antigeenbibliotheek bevat op te nemen. Bovendien laten we zien hoe een paar secundaire antilichamen kan worden gebruikt om IgG- en IgM-reactiviteiten op hetzelfde schuifoppervlak te scheiden. We hebben deze techniek nu geoptimaliseerd om autoantilichamen bij zowel mensen als muizen te meten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Verdunning antigenen en genereren Antigen Microarrays

  1. Verdun antigenen in PBS tot een eindconcentratie van 0,2 mg / ml. Druk tot 162 unieke antigenen in tweevoud met een microarrayprinter configuratie met 9 pinnen. Onder IgG en IgM antigenen in het antigeen bibliotheek als positieve controles. Omvatten PBS alleen als een negatieve controle.
  2. Voeg 20 ul van elk antigeen aan de 384 goed bronplaat. Antigenen toevoegen bronplaat in groepen die de instelling van de printkop spiegel (bv regelen antigenen in groepen van 9 bij 9 kunnen worden gebruikt voor het afdrukken).
  3. Cover bron plaat met folie en bevriezen bij -80 ° C tot klaar om arrays te drukken.
  4. Reinig solide microarrayprinter pinnen door hen te incuberen in een sonicatie bad met gedemineraliseerd water gedurende 3 x 1 min. Plaats pinnen in rack te drogen en te regelen dan pinnen in microarray printkop. 9 pinnen, gebruik dan een 3 x 3-configuratie.
  5. Programma microarrayprinter voor print gerund door het instellen van het aantal pinnen op de printkop,aantal dia's af te drukken, het aantal kussentjes op elke dia, en het aantal herhaalde plekken voor elk antigeen. Gewoonlijk gebruiken 9 pins, 70 dia's, 2 pads / glijbaan, en 2 herhaalde plekken voor elk antigeen. Programma microarrayprinter pinnen ultrasone trillingen in het water tussen verschillende groepen antigenen.
  6. Dooi bron plaat en vervolgens centrifuge plaat gedurende 1 minuut bij 100 x g. Plaats de bron plaat in de aangewezen plek in microarrayprinter. Neem de snij folie die over de eerste groep van antigenen te drukken.
  7. Schik onbedrukte dia's op Arrayer oppervlak en run druk programma. Print slides bij RT met vocht zich op de Arrayer bij 55-60% met de ingebouwde bevochtiger van de array machine.
  8. Nadat elke groep antigenen op de objectglaasjes geprint, pauzeren microarrayprinter. Bedek de antigenen die net waren bedrukt met folie (om verdamping te voorkomen) en onthullen de volgende groep antigenen te drukken. Doorgaan druk programma.
  9. Nadat alle antigenen zijn afgedrukt, cover bron plat met nieuw stuk folie en bevriezen bij -80 ° C. Plaats gedrukt dia's in dia doos en vacuüm afdichting. Slides kunnen de volgende dag tot een maand later worden gebruikt of niet.

2. Probing Antigen Microarrays met verdunde Sera

  1. Plaats de dia's in frames met behulp van incubatie kamers. Voeg 700 pl blokkerende buffer (2,5% [v / v] Foetaal kalfsserum (FCS), 0,1% [vol / vol] Tween 20 in PBS) aan elk array-oppervlak.
  2. Plaats de zelfklevende folie over frame en plaats in een afgesloten container met een stukje natte weefsel. Incubate O / N bij 4 ° C op een rocker.
  3. Verdunde serummonsters 1: 100 in het blokkeren van buffer. Aspireren blokkeeroplossing van arrays en voeg 500 pl verdund monster op elke array oppervlak.
  4. Dek af met zelfklevende folie en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C met schommelen.
  5. Verdun secundaire antilichamen in het blokkeren van buffer. Menselijke studies, verdun een Cy3 gelabeld geit anti-humaan IgG antilichaam tegen 0,33 ug / ml en een Cy5 gelabeld geit anti-human IgM-antilichaam tot 0,25 ug / ml. Voor muizen hebben verdun een Cy3 gelabeld geit anti-muis IgG antilichaam tegen 0,38 ug / ml en een Cy5 gelabeld geit anti-muis IgM antilichaam aan 0,7 ug / ml.
  6. Aspireren monsters van arrays en spoel matrix oppervlakken 4 keer met spoelbuffer (0,1% Tween 20 in PBS). Pour buffer op om dia's en flick snel af.
  7. Voeg 700 ul van het blokkeren van buffer aan elke array oppervlak wassen en incubeer 10 min bij RT met schommelen. Herhaal wasstap nog twee keer.
  8. Voeg 500 ul van verdund secundair antilichaam aan elke dia oppervlak en dek af met zelfklevende folie. Incubeer 45 min bij 4 ° C met schommelen.
  9. Zuig secundair antilichaam mengsel van dia's en spoel 4 keer als hierboven. Wassen slides 3 maal met 700 ui blokkerende / verdunningsbuffer als hierboven.
  10. Verwijder dia's uit frames en plaats in de metalen schuif rack dat is ondergedompeld in PBS. Incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur met orbitaal schudden. Plaats in nieuwe container van PBS en incubeer nog eens 20 min met schudden.
  11. Plaats dia rek in container van gedemineraliseerd water 15 sec. Plaats rek in een nieuwe bak met water en incubeer nog eens 15 sec.
  12. Om droge dia's, dia plaats rek op een ELISA-plaat adapter in centrifuge en draaien op 220 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  13. Plaats de dia's in lichtdichte doos tot klaar om te scannen.

3. Scanning Antigen Microarrays en Gegevens exporteren

  1. Scan dia's met behulp van een microarray scanner die Cy3 en Cy5 fluorescente signalen kan detecteren. Om de fotomultiplicatorbuis (PMT) niveau van de scanner passen, pre-scan één dia die alleen werd geprobed met secundaire antilichamen.
    Opmerking: Deze schuif is moeten de antigeen library erop gedrukt waaronder positieve (IgG en IgM) en negatieve (PBS) controlegroep. De pre-scan is een lage resolutie scan dat de gebruiker snel maakt het mogelijk om de optimale PMT instellingen te vinden.
  2. Stel de PMT waarden, zodat het menselijk IgG-functies (op de Cy3 kanaal) en de bromeen IgM kenmerken (de Cy5 kanaal) dezelfde mediane fluorescentie-intensiteit minus achtergrond (MFI-B) (typisch 40.000). De PMT niveaus worden door op de 'hardware' knop in te stellen. Eenmaal ingesteld, constant te houden deze PMT instellingen.
  3. Scan de experimentele dia's op de twee kanalen door te drukken op de knop "Scannen". Sla de dia's (beide kanalen) na elke scan.
  4. Plaats de dia te analyseren in de microarray-software met behulp van de "file" knop.
  5. Laad het bestand gen-array lijst (GAL) met behulp van de "file" knop. GAL bestand heeft de indeling van de array met de identiteit van de matrix functies.
  6. Plaats de arraysjabloon via gescande afbeelding zodat de arrays kenmerken overeenkomen met de sjabloon zo dicht mogelijk.
  7. Lijn functies in alle blokken met de sjabloon door op de "align" knop. Het programma zal in het algemeen vindt de omtrek van de cirkelvormige functies maar handmatige aanpassingen nodig zijn. Deze aanpassingen kunnen worden gemaakt door lopen de toepassingsmode. De software berekent dan een MFI-B voor elk van de antigenen.
  8. Gebruik de "file" knop om deze resultaten te exporteren als een tekstbestand.

4. analyseren Array gegevens met de Betekenis Analyse van Microarrays (SAM)

  1. Laad individuele tekstbestanden in Excel en identificeren van de kolommen die MFI-B voor de Cy3 en Cy5 kanalen.
  2. Bereken het gemiddelde van de dubbele functies.
  3. Voor eventuele negatieve MFI-B, vervang de negatief getal met 10. Transformeer gegevens door te delen raw MFI-B met 100 en vervolgens door het berekenen van log base 2.
  4. Analyseer log-getransformeerde gegevens Betekenis Analyse van Microarrays (SAM) zoals eerder 7 beschreven.
  5. Voor een onderzoek met behulp van twee groepen (bijvoorbeeld gezonde controles vs. patiënten), label één groep "1" en de groep "2." Gebruik een twee-klasse, ongepaarde analyse in SAM antigenen reactiviteiten die s te identificerenignificantly verschillend tussen beide groepen (q-waarde <0,05).
  6. Gebruik clustering en warmte-map genererende software om foto's te maken voor de presentatie 8.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antigenen zijn aangebracht in een plaat met 384 putjes en gedrukt op objectglaasjes door een robot microarrayprinter zie figuur 1. Figuur 2 toont glaasjes geplaatst in een frame met incubatie kamers en een gescande dia na verwerking. Figuur 3 toont positieve en negatieve controleglaasjes. De negatieve schuif alleen maar geprobed met secundaire antilichamen, en de positieve controle dia geprobed met serum van een patiënt met systemische l...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier beschreven protocol maakt de kwantificering van auto-antilichamen met het antigeen microarray techniek. Antigeen microarrays bieden verscheidene voordelen boven conventionele ELISA screening voor autoantilichamen. Allereerst een grote antigenen zoals nucleïnezuren, eiwitten, peptiden, en cellysaten worden opgesteld op de met nitrocellulose gecoate glaasjes, hetgeen aldus gemultiplexte screenen van autoantilichamen. Bovendien, slechts microgram antigeen nodig om de arrays genereren aangezien nanoliters antigeendo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.C. werd ondersteund door een postdoctorale beurs van de Heart and Stroke Foundation of Canada en het Training Program in Regenerative Medicine (Canadian Institutes of Health Research). F.Y.Y.H. werd ondersteund door het Training Program in Regenerative Medicine. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van Astellas Pharma Canada. We willen ook Dr. Mark Menenghini (University of Toronto) bedanken voor het gebruik van zijn Axon microarray scanner.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ribosomal P0Diarect14100verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS
human IgGJackson Immuno009-000-003verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS
human IgMJackson Immuno009-000-012verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS
mouse IgGSigma-AldrichI5381verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS
mouse IgMBiolegend401601verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS
double-stranded DNASigma-AldrichD1626verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS
single-stranded DNASigma-AldrichD8899verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS
microarrayerVirtekVersArray Chipwriter Proveel soorten arrayers zijn geschikt
solid printing pinsArrayit CorporationSSP015
software voor robotische microarrayerVirtekChipwriter Pro 
FAST slides (2 Pad)GVS Northa America10485317
FAST frameGVS Northa America10486001
FAST incubation chambers (2 Pad)GVS Northa America10486242
384 well platesWhatman7701-5101
plate sealersVWR60941-062
foil plate coversVWR60941-124
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
Fetal calf serumInvitrogen12483020
Cy3 goat anti-human IgGJackson Immuno109-165-096gebruik werkstock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-human IgMJackson Immuno109-175-129gebruik werkstock in 50% glyercol
Cy3 goat anti-mouse IgGJackson Immuno115-165-071gebruik werkstock in 50% glyercol
Cy5 goat anti-mouse IgMJackson Immuno115-175-075gebruik werkstock in 50% glyercol
Microarray ScannerMolecular DevicesAxon 4200A
Microarray softwareMolecular DevicesGenepix 6.1
Clustering softwareeisenlab.orgCluster 3.0
Heatmap softwareeisenlab.orgTreeview 1.60
Microarray statistische softwareStanford UniversitySAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
  2. Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention. Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).
  3. Robinson, W. H., et al. Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses. Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).
  4. Quintana, F. J., et al. Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).
  5. Hueber, W., et al. Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).
  6. Price, J. V., et al. Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).
  7. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).
  8. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).
  9. Chruscinski, A., et al. Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation. PloS one. 11, e0151224(2016).
  10. Price, J. V., et al. Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays. PloS one. 8, e64555(2013).
  11. Singh, H., et al. Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies. Aids. 25, 1247-1257 (2011).
  12. Porcheray, F., et al. Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses. Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).
  13. Haddon, D. J., et al. Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution. Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).
  14. Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. Structure and function of immunoglobulins. J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Antigen MicroarrayAutoantibody DetectionTwo color DetectionIgG IgM DetectionMicroarray PrintingSerum ProbingFluorescent ScanningPBS BlockingSecondary AntibodySlide Alignment

Gerelateerde artikelen