Methodenartikel

Antilichaam Labeling met fluorescente kleurstoffen met behulp van magnetische Proteïne A en Proteïne G Beads

11.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54545

⸱

15 september 2016

 ,  , 
1Promega Corporation

In dit artikel

Samenvatting

De on-bead werkwijze voor het labelen van antilichamen met kleine moleculen maakt het kenmerken van een kleine hoeveelheid antilichamen rechtstreeks uit celmedium. Deze methode is geschikt amine en thiol chemie, en kan meerdere monsters tegelijkertijd, handmatig of met geautomatiseerde platforms.

Samenvatting

Antilichamen die zijn gemerkt met kleine moleculen zoals fluorescerende kleurstoffen, cytostatica en radioactieve tracers zijn essentiële instrumenten in het biomedisch onderzoek, immunodiagnostiek en meer recentelijk als therapeutische middelen. Traditionele methoden voor het labelen van antilichamen met kleine moleculen vereisen gezuiverde antilichamen bij relatief hoge concentratie, betrekking hebben op meerdere dialyse stappen en hebben beperkte verwerkingscapaciteit. Toch zijn er verschillende toepassingen, waaronder het gebied van antilichaam Drug Conjugaten (ADC), zullen profiteren van nieuwe methoden die de etikettering van antilichamen direct van cel media zal toestaan. Dergelijke werkwijzen kunnen toestaan ​​antilichamen worden gescreend in biologisch relevante assays, bijvoorbeeld, de receptor-gemedieerde internalisatie antilichaam assay bij ADCs. Hier beschrijven we een werkwijze (on-bead methode) die kenmerken van kleine hoeveelheden antilichamen maakt rechtstreeks uit celmedium. Deze aanpak maakt gebruik van een hoge capaciteit magnetische proteïne A en proteïne G affiniteit kralen om antilichamen te vangenuit de cel media gevolgd door merken met kleine moleculen met behulp van amine of thiol chemie en daaropvolgende elutie van gelabelde antilichamen. Het nemen van fluorescerende kleurstoffen als surrogaat voor kleine moleculen, tonen we de on-bead etikettering van drie verschillende muis antilichamen direct van cel media met behulp van zowel amine en thiol etikettering chemie. De hoge bindingsaffiniteit van antilichamen aan Proteïne A en Proteïne G zorgt voor een hoge terugwinning en hoge zuiverheid van de gelabelde antilichamen. Bovendien, het gebruik van magnetische korrels kunnen meerdere monsters handmatig worden gehanteerd, waardoor een aanzienlijke verbetering labeling doorvoer.

Inleiding

Antilichamen gelabeld met kleine moleculen zijn misschien de meest gebruikte reagentia in de biologie 1,2. Antilichamen gelabeld met fluorescente kleurstoffen en biotine worden veel gebruikt in de beeldvorming, immunoassays, flowcytometrie, Western blots, immuunprecipitatie en onder andere toepassingen 3-6. Radiogelabelde antilichamen 3,7 vinden veel toepassing bij beeldvorming en therapie, antilichamen gelabeld met cytotoxische geneesmiddelen (ADCs) bieden nieuwe mogelijkheden voor de behandeling van kanker, en twee ADCs zijn reeds goedgekeurd voor therapeutisch gebruik 8. Ondanks hun veelvuldig gebruik zijn de methoden voor het labelen van antilichamen verrassend ongewijzigd gebleven en meestal meerdere reacties te betrekken en ontzouting stappen 9-12. Oplossing methoden werken heel goed in gevallen waar slechts een paar antilichamen moeten worden geëtiketteerd en zijn verkrijgbaar in zeer gezuiverde vorm bij hoge concentratie en in voldoende volumes. Voor nieuwere toepassingen zoals ADC, is er eenmoeten antilichamen etiketteren vroeg stadium hybridoma zodat ze kunnen worden gescreend op biologisch relevante eigenschappen, bijvoorbeeld receptor-gemedieerde internalisatie antilichaam 13-16. Voor deze hybridoma stadium monstervolumes beperkt, antilichamen uitgedrukt bij lage concentraties en een aantal monsters zijn groot, dus oplossing gebaseerde labeling niet geschikt zijn.

Ter vereenvoudiging en verbetering van de doorvoer van de traditionele labeling antilichamen gebaseerde methoden, hebben een aantal alternatieve benaderingen voorgesteld 17,18. Een benadering is niet-magnetische proteïne A gebruikt affiniteitskorrels verpakt in kleine kolommen antilichamen gevolgd door de labelingsreactie en elutie van gelabelde en gezuiverd eiwit vangen. Deze methode kan worden gebruikt om antilichamen direct labelen van cel media, is het gebruik van kolommen moeizaam. Een magnetische korrel gebaseerde werkwijze is recentelijk gerapporteerd dat 19 het gebruik van kolommen elimineert en verbetert de doorvoer maar doorde beperkte antilichaambinding capaciteit van de korrels konden alleen lage nanogram tot microgram hoeveelheden van de antilichamen worden gelabeld.

We hebben onlangs ontwikkeld en gebruikt hoge capaciteit magnetische Proteïne A en Proteïne G parels (> 20 mg humaan IgG / ml vaste korrels) antilichamen aanwezig in celmedium met 20 kleine moleculen te labelen. De hoge capaciteit van de korrels maakt tientallen tot honderden microgram antilichaam gemakkelijk worden gemerkt en de snelle respons van de magnetische kralen vereenvoudigt behandeling en verwerking van een groot aantal monsters in parallel. Het gebruik van fluorescerende kleurstoffen als surrogaat voor kleine moleculen, laten we zien dat de methode is compatibel met de etikettering chemie amine en thiol en biedt een hoge terugvorderingen van gemerkt en zeer zuiver antilichamen.

Dit protocol en de bijbehorende video beschrijven on-bead etikettering van muizenantilichamen in de cel media met magnetische Proteïne A en Proteïne G parels. Het protocol isverdeeld in vier delen: Deel 1 beschrijft de verovering van antilichamen op de hiel van biologische monsters. Naar aanleiding van capture, wordt de etikettering van antilichamen met een fluorescerende kleurstof met behulp van amine chemie of met behulp van thiol chemie beschreven in rubriek 2 en deel 3, respectievelijk. Tenslotte worden in hoofdstuk 4 beschrijft de werkwijze voor de berekening van de antilichaamconcentratie en de kleurstof antilichaam verhouding.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Antibody Capture naar High Capacity Magnetic Proteïne A of magnetische proteïne G Beads

  1. Gelijkmatig opnieuw te schorten magnetische korrels door zacht schudden. Houd de schorsing uniform wanneer aliquoting kralen.
  2. Voeg 50 ul kraal slurry naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Plaats de magnetische standaard voor 10 sec. Verwijder de opslag buffer voorzichtig.
  3. Voeg 250 gl antilichaam bindingsbuffer.
  4. Mengen en in de magnetische standaard voor 10 sec. Verwijder de binding buffer voorzichtig.
  5. Voeg 1,0 ml van het monster met 50-100 ug antilichaam aan de beads. De monsters kunnen worden gezuiverd antilichamen of antilichamen in celmedium.
  6. Meng monster gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een vortex mixer of end-over-end mixer.
  7. Plaats de buis in de magnetische stand gedurende 10 seconden en verwijder het supernatant.
  8. Voeg 250 ul antilichaam binding / wasbuffer en meng. Plaats in de magnetische stand gedurende 10 seconden en verwijder binding / wasbuffer. Herhaal dit sTep voor een totaal van twee wassen.
  9. Ga verder naar deel 2 te label antilichamen met behulp van amine chemie of hoofdstuk 3 tot en met label antilichamen met behulp van thiol chemie.

2. Antibody Labeling Met behulp van Amine Chemie

  1. conjugaat Antibody
    1. Voeg 100 gl buffer amine conjugatie aan de korrels.
    2. Los het amine-reactieve fluorescerende kleurstoffen (AlexaFluor 532-SE) en 10 mg / ml door toevoeging van 100 gl dimethylsulfoxide (DMSO) om 1,0 mg kleurstof. Meng door vortexen. Maak deze oplossing vlak voor gebruik.
    3. Voeg 2,5 ul van amine-reactieve kleurstof van 100 ug antilichaam.
      Noot: Typisch een 5-20 molaire overmaat reactieve kleurstof wordt aanbevolen. Echter hoeveelheid reactieve kleurstof toegevoegd aan het reactiemengsel moet empirisch worden geoptimaliseerd afhankelijk van de gewenste kleurstof antilichaam verhouding en intrinsieke eigenschappen antilichaam.
    4. Meng monster gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een vortex mixer of end-over-end mixer. Zorg ervoor dat de kralen in suspensio blijvenn.
    5. Plaats de buis in de magnetische stand gedurende 10 seconden en verwijder het supernatant.
    6. Voeg 250 ul antilichaam binding / wasbuffer en meng. Plaats de magnetische standaard voor 10 sec. Verwijder en gooi binding / wasbuffer. Herhaal deze stap voor een totaal van twee wassen.
  2. antilichaam Recovery
    1. Voeg 50 ul elutiebuffer aan de korrels.
    2. Meng gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een vortex mixer of end-over-end mixer. Zorg ervoor dat de parels in suspensie blijven.
    3. Plaats buis in de magnetische stand voor 10 sec. Verwijder geëlueerde monster en overdracht naar een nieuwe micro-centrifugebuis met 5 pl neutralisatie buffer.
    4. Herhaal dit proces nog een keer en het zwembad het geëlueerde monsters.
    5. Kwantificeren het antilichaam concentratie en kleurstof-to-antilichaam-verhouding, zoals beschreven in hoofdstuk 4.

3. Antibody Labeling Met behulp van thiol chemie

  1. antilichaam Reduction
    1. Voeg 250 ulvan thiol vervoeging buffer en mix. Plaats de buis in de magnetische stand voor 10 sec. Verwijder de buffer. Herhaal deze stap twee keer.
    2. Voeg 100 ul van thiol vervoeging buffer.
    3. Voeg dithiothreitol (DTT) tot een uiteindelijke concentratie van 2,5 mM.
    4. Meng monster gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een vortex mixer of end-over-end mixer. Zorg ervoor dat de parels in suspensie blijven.
    5. Plaats de buis in de magnetische stand voor 10 sec en gooi de buffer.
    6. Voeg 250 gl thiol conjugatie buffer en meng. Plaats de buis in de magnetische stand voor 10 sec. Verwijder de buffer. Herhaal deze stap voor een totaal van twee wassen.
    7. Voeg 100 ul van thiol vervoeging buffer.
  2. conjugaat Antibody
    1. Los het thiol-reactieve kleurstof bij 10 mg / ml door toevoeging van 100 ul DMSO 1,0 mg kleurstof. Meng door vortexen. Maak deze oplossing vlak voor gebruik.
    2. Voeg 2,5 pl thiol-reactieve kleurstof van 100 ug antilichaam.
      Noot: Typisch een 5-20 molaire overmaat reactieve kleurstof wordt aanbevolen. Echter hoeveelheid reactieve kleurstof toegevoegd aan het reactiemengsel moet empirisch worden geoptimaliseerd afhankelijk van de gewenste kleurstof antilichaam verhouding en intrinsieke eigenschappen antilichaam.
    3. Meng monster gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een vortex mixer of end-over-end mixer. Zorg ervoor dat de parels in suspensie blijven.
    4. Plaats de buis in de magnetische stand voor 10 sec en verwijder supernatant.
    5. Voeg 250 gl thiol conjugatie buffer en meng. Plaats de magnetische standaard voor 10 sec en verwijder de buffer. Herhaal deze stap voor een totaal van twee wassen.
  3. Elueer Antibody
    1. Voeg 50 ul elutiebuffer aan de korrels.
    2. Meng gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een vortex mixer of end-over-end mixer. Zorg ervoor dat de parels in suspensie blijven.
    3. Plaats buis in de magnetische stand voor 10 sec. Verwijder geëlueerde monster en overdracht naar een nieuwe micro-centrifugebuis bevattende 5 ui neutralization buffer.
    4. Herhaal dit proces nog een keer en het zwembad het geëlueerde monsters.
    5. Kwantificeren het antilichaam concentratie en kleurstof-to-antilichaam-verhouding, zoals beschreven in hoofdstuk 4.

4. Bereken Dye-to-Antibody Ratio

  1. Meet de absorptie van het antilichaam-conjugaat kleurstof bij 280 nm (A280) en bij de Amax van de kleurstof (Amax).
  2. Bereken het antilichaam concentratie:
    Antilichaam Concentratie (mg / ml) = A280 - (Amax x CF) / 1,4
    waarbij CF = correctiefactor van de kleurstof (verstrekt door de fabrikant).
  3. Bereken de kleurstof tot antilichaam verhouding:
    Dye-to-antilichaam verhouding (DAR) = (A max x 150.000) / Ab Concentratie (mg / ml) x ε kleurstof
    wanneer kleurstof ε = de extinctiecoëfficiënt van de kleurstof op zijn maximale absorptie en molecuulgewicht van antilichaam = 150.000 Da.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een schema voor het labelen van antilichamen met kleine moleculen met behulp van hoge capaciteit magnetische Proteïne A en Proteïne G parels wordt getoond in figuur 1. Antilichamen gevangen op de magnetische proteïne G kralen kunnen met kleine moleculen worden gelabeld, bijvoorbeeld fluorescente kleurstoffen, met behulp van aminechemie welke labels primaire aminen met de lysine aminozuren of middels thiolchemie welke labels aan de gereduceerde thiolen in het scharniergeb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het doel van deze studie was om een ​​methode om antilichamen aanwezig in het celmedium bij lage concentraties label, met een verscheidenheid aan kleine moleculen te ontwikkelen. Een dergelijke werkwijze zal een groot aantal antilichamen, tijdens de vroege stadia van antilichaam ontdekking mogelijk, te voorzien van kleine moleculen en gezeefd onder toepassing van een biologisch relevante assay. Een dergelijke test is de receptor-gemedieerde internalisatie antilichaam assay waarbij internalisatie kan variëren tussen anti...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Auteurs zijn werknemers van Promega Corporation.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Magne Protein A BeadsPromega Corporation G8781
Magne Protein G BeadsPromega Corporation  G7471
AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)Life TechnologiesA20001
AlexaFluor 532-ME (Malemide)Life TechnologiesA10255
AlexaFluor 647-ME (Maleimide)Life TechnologiesA20347
Fluorescein-ME (Maleimide)Life TechnologiesF-150
Magnetic StandPromegaZ5332

Referenties

  1. Colwill, K., Graslund, S. Renewable Binder Working Group. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).
  2. Silverstein, A. M. Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets. Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).
  3. Day, J. J., et al. Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).
  4. Cunningham, R. E. Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry. Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).
  5. Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099(2014).
  6. Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).
  7. Kraeber-Bodere, F., et al. Radioimmunoconjugates for the treatment of cancer. Semin Oncol. 41 (5), 613-622 (2014).
  8. Leal, M., et al. Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer. Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).
  9. Drachman, J. G., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).
  10. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. 380-382 (1996).
  11. Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies. Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).
  12. Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).
  13. Isa, M., et al. High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2. ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).
  14. Liao-Chan, S., et al. Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores. PLoS One. 10 (4), e0124708(2015).
  15. Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe. J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).
  16. Nath, N., et al. Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye. J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).
  17. Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase. J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).
  18. Strachan, E., et al. Solid-phase biotinylation of antibodies. J Mol Recognit. 17 (3), 268-276 (2004).
  19. Dezfouli, M., et al. Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale. Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).
  20. Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads. J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).
  21. Lund, L. N., et al. Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry. J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).
  22. Safarik, I., Safarikova, M. Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides. Biomagn Res Technol. 2 (1), 7(2004).
  23. Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer. Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).
  24. Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
  25. Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates. MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Magnetische kraaltjesProte ne A kraaltjesaminechemiethiolchemiecelmediumantilichaamzuiveringelutie van kraaltjes

Gerelateerde artikelen