Methodenartikel

Colorimetrische Detectie van bacteriën met behulp van lakmoesproef

9.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54546

⸱

17 september 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University, 3Department of Medicine, McMaster University

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een protocol voor colorimetrische detectie van E. coli met behulp van een gemodificeerde lakmoestest die gebruikmaakt van een RNA-splitsend DNAzyme, urease en magnetische kralen.

Samenvatting

Er is een toenemende vraag naar eenvoudige maar nog steeds effectieve methoden die kunnen worden gebruikt om specifieke pathogenen te detecteren voor toepassingen op locatie of in het veld. Dergelijke methoden moeten gebruiksvriendelijk zijn en betrouwbare resultaten opleveren die gemakkelijk kunnen worden geïnterpreteerd door zowel specialisten als niet-professionals. De lakmoesproef voor pH is eenvoudig, snel en effectief omdat het de pH van een testmonster rapporteert via een eenvoudige kleurverandering. We hebben een aanpak ontwikkeld om gebruik te maken van de lakmoesproef voor bacteriedetectie. De methode maakt gebruik van een bacteriespecifiek RNA-splitsend DNAzyme om twee functies te bereiken: het herkennen van een bepaalde bacterie en het bieden van een mechanisme om de activiteit van urease te controleren. Door het gebruik van magnetische kralen geïmmobiliseerd met een DNAzyme-urease-conjugaat, wordt de aanwezigheid van bacteriën in een testmonster doorgegeven aan de afgifte van urease van de kralen naar de oplossing. De vrijgekomen urease wordt overgebracht naar een testoplossing om ureum te hydrolyseren tot ammoniak, wat resulteert in een pH-verhoging die kan worden gevisualiseerd met behulp van de klassieke lakmoesproef.

Inleiding

Bacteriele pathogeen zijn een van de belangrijkste oorzaken van wereldwijde morbiditeit en mortaliteit. Uitbraken van ziekenhuisinfecties, door voedsel overgebrachte ziekteverwekkers en bacteriële verontreinigingen in het milieu vormen ernstige en voortdurende bedreigingen voor de volksgezondheid en veiligheid. Om deze uitbraken te voorkomen, zijn effectieve hulpmiddelen nodig die de detectie van pathogeen op tijd mogelijk maken onder verschillende omstandigheden. Eenvoudige maar nog steeds effectieve tests die draagbaar en kosteneffectief zijn, worden zeer gewaardeerd, vooral in regio's die vatbaar zijn voor uitbraken maar zich geen dure testfaciliteiten kunnen veroorloven.1-3 Hoewel er een veelvoud aan methoden bestaat om bacteriën te detecteren, zijn veel van hen niet geschikt als screening- of on-site testhulpmiddelen omdat ze lange testtijden, dure instrumenten en gecompliceerde testprocedures vereisen.

Colorimetrische tests zijn bijzonder aantrekkelijk voor punt-van-zorg of veldtoepassingen, omdat kleurveranderingen gemakkelijk met het blote oog kunnen worden gedetecteerd. De lakmoestest voor pH is eenvoudig, snel en effectief. Hoewel het een zeer oude technologie is, wordt het vandaag de dag nog steeds veel gebruikt vanwege de eenvoud en effectiviteit. Verrassend genoeg is deze eenvoudige test nog nooit gewijzigd om de detectie van andere analyten te bereiken voordat we onlangs een aanpak ontwikkelden om deze test voor E. coli-testen aan te passen.4

De uitgebreide lakmoestest voor E. coli maakt gebruik van drie extra componenten: een E. coli-geactiveerd RNA-klevend DNAzyme (EC1), 5 urease en magnetische kralen. DNAzymes verwijzen naar synthetische enkelstrengs DNA-moleculen met katalytische activiteit.6 Ze kunnen worden geïsoleerd uit willekeurige DNA-sequentiepools met behulp van in vitro selectie.7,8 Ze zijn zeer stabiel en kunnen kosteneffectief worden geproduceerd met behulp van hoogwaardige geautomatiseerde DNA-synthese.9 Om deze redenen zijn DNAzymes, met name RNA-klevende DNAzymes, op grote schaal onderzocht voor biosensing-toepassingen.6,10,11 RNA-klevende DNAzyme-sensoren zijn ontwikkeld om metaalionen te detecteren,12-16 kleine moleculen,17,18 bacteriële pathogeen5,19-21 en kankercellen.22 Gezien de grote beschikbaarheid van doel-geïnduceerde RNA-klevende DNAzymes, kan elk onderzoek dat een DNAzyme gebruikt, mogelijk worden uitgebreid om een ​​diverse reeks analyten te detecteren.

Urease is gekozen vanwege zijn vermogen om ureum te hydrolyseren tot ammoniak,23,24 wat resulteert in een pH-verhoging. Urease is ook zeer efficiënt, stabiel en geschikt voor conjugatie met andere biomoleculen. Daarom postuleerden we dat een conjugaat van een RNA-klevende DNAzyme met urease het gebruik van de lakmoestest zou toestaan ​​voor de detectie van andere doelen.5

De werking van het RNA-klevende DNAzyme wordt overgebracht naar de urease-gemedieerde pH-verhoging door het gebruik van magnetische kralen die geïmmobiliseerd zijn met het DNAzyme-ureumconjugaat. Omdat de activiteit van het onderzochte DNAzyme strikt afhankelijk is van E. coli, zal de aanwezigheid van deze bacterie in de testoplossing resulteren in de afgifte van urease uit de magnetische kralen naar de oplossing, die vervolgens wordt genomen en gebruikt om ureum te hydrolyseren in een reporteroplossing die een pH-gevoelige kleurstof bevat. Het uiteindelijke resultaat van deze procedure is een kleurverandering die gemakkelijk kan worden gemeld door de kleurstof of pH-papier.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van reagentia en buffers

  1. 0,5 M ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)
    1. In een 2 L beker, voeg 186,1 g EDTA tot 800 ml gedeïoniseerd-gedestilleerd water (DDH 2 O). Stel de pH van de oplossing op 8,0 met behulp NaOH pellets. Voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 1,0 L en breng de oplossing een autoclaveerbare glazen fles voor autoclaaf en bewaar bij 4 ° C.
  2. 10 × Tris-boraat EDTA (10x TBE)
    1. In een 4 L kunststof beker, voeg 432 g Tris-base, 200 g boorzuur, 80 ml ​​0,5 M EDTA (pH 8,0) en DDH 2 O tot een eindvolume van 4 L. Mix met een roerstaafje totdat alle componenten opgelost. Breng de oplossing 1 L glazen flessen voor autoclaaf en bewaar bij 4 ° C.
  3. 10% Denaturing Polyacrylamide Stock
    1. In een 4 L plastic beker, voeg 1681,7 g ureum, 400 ml 10x TBE, 1 liter van 40% acrylamide / bisacrylamide (29: 1) oplossing en DDH 2 O tot de fspronkelijke volume 4 L. Meng met behulp van een roerstaafje totdat het ureum wordt opgelost. Breng de oplossing 1 L amberkleurige glazen flessen en bewaar bij 4 ° C.
  4. 2x Gel laadbuffer (2x GLB)
    1. In een 200 ml bekerglas, voeg 44 g ureum, 8 g sucrose, 10 mg broomfenol blauw, 10 mg xyleencyanol FF, 400 ui 10% natriumdodecylsulfaat en 4 ml 10 x TBE. Voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 40 ml en los de bestanddelen met milde verwarming bij 50 ° C onder mengen met een magnetische roerstaaf. Breng 1 ml aliquot 1,5 ml microfuge buizen en bewaar bij 4 ° C.
      OPMERKING: Voor gebruik vereist momentane verhitting op 90 ° C om alle vaste stof opnieuw op te lossen.
  5. 1 M Tris-hydrochloride (Tris-HCl) (pH 7,5)
    1. In een glazen fles, voeg 12,1 g Tris-base en 70 ml DDH 2 O en meng totdat de vaste stof is opgelost. Op pH 7,5 onder toepassing van 1 M zoutzuur (HCl). Voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 100 ml autoclaaf en store bij 4 ° C
  6. 5 M natriumchloride (NaCl)
    1. In een glazen fles, los 58,4 g NaCl in 150 ml van DDH 2 O. Stel het volume tot 200 ml met DDH 2 O. Bewaren bij 4 ° C.
  7. DNA Elution Buffer
    1. In een glazen fles, meng 2,0 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8,0 ml van 5 M NaCl en 0,4 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0). Stel het volume tot 200 ml met DDH 2 O, autoclaaf en bewaar bij 4 ° C.
  8. 1 M 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) (pH 7,4)
    1. In een glazen fles, los 2,38 g HEPES in 80 ml ​​DDH 2 O. Op pH 7,4 onder toepassing van 5 N NaOH en voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 100 ml.
  9. 1 M magnesiumchloride (MgCl2)
    1. In een glazen fles, voeg 2,03 g MgCl 6H 2 O 2 en breng het volume op 100 ml met DDH 2 O.
  10. Reaction Buffer (RB)
    1. In een 50 ml conische buis, voeg 50 ul van 1 M HEPES (pH 7,4), 1,5 ml van 5 M NaCl, 0,75 ml 1 M MgCl2 en 5 ul Tween-20. Voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 50 ml. Meng de oplossing en filtreer in een conische buis met een injectiespuit aangedreven filter (0,22 pm) en bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
  11. Binding Buffer (BB)
    1. In een 50 ml conische buis, voeg 500 ul van 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8,8 g NaCl, 50 pl 1 M MgCl2 en 5 ul Tween 20. Voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 50 ml. Meng de oplossing en filtreer in een conische buis met een injectiespuit aangedreven filter (0,22 pm) en bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
  12. Substrate Solution (SS)
    1. In een 50 ml conische buis, voeg 5,8 g NaCl, 3 ml 1 M MgCl2, 1,5 g ureum en 40 ml DDH 2 O. Stel de pH van de oplossing op 5,0 onder toepassing van 10 mM HCl. Omdat de oplossing niet wordt gebufferd, aan te passen pH met behulp van HClvoorzichtig door de toevoeging van kleine hoeveelheden HCl. Voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 50 ml.
    2. Meng de oplossing en filtreer in een conische buis met een injectiespuit aangedreven filter (0,22 pm) en bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
  13. Luria Bertani (LB) bouillon
    1. In een beker, los 20,0 g LB poeder in 1 L van DDH 2 O. Transfer naar een glazen fles, autoclaaf, en bewaar bij 4 ° C.
  14. 1,5% LB agar
    1. In een 250 ml kolf, voeg 1,5 g agar en 100 ml LB-bouillon. Autoclaaf en bewaar bij 4 ° C.
  15. agarplaten
    1. Los het LB agar in een magnetron en koel de oplossing tot -50 ° C. Giet de oplossing in petrischalen, waardoor ~ 5 platen en laten stollen.

2. Synthese en zuivering van E. coli- responsieve DNAzym EC1

  1. Synthese van EC1 door Template Mediated enzymatische Ligatie
    1. Zuiver commercially gesynthetiseerde oligonucleotiden BS1, DE1 en T1 (sequenties gegeven in tabel 1) met 10% denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (dPAGE) volgens standaardprotocollen.
    2. Bereid een 100 uM voorraad BS1, DE1, en T1. Bewaren bij -20 ° C tot gebruik.
    3. In een 1,5 ml microfugebuis, voeg 38,5 ul van DDH 2 O, 5 pl DE1 en 5 ui 10 x T4 polynucleotide kinase reactiebuffer geleverd met enzym leverancier (500 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM MgCl2, 50 mM dithiothreïtol (DTT), 1,0 mM spermidine).
    4. Voeg 1 pl adenosine trifosfaat (ATP) (100 mM). Voeg 5 eenheden T4 polynucleotidekinase (10 U / pl). Meng door voorzichtig pipetteren het reactiemengsel.
    5. Incubeer de reactie bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
    6. Schrik de reactie af door verwarming tot 90 ° C gedurende 5 minuten.
    7. Voeg 118 ul van DDH 2 O, 5 pl BS1 en 5 ui T1. Verwarm de reactie op 90 ° C gedurende 2 min en daarna afkoelen tot kamertemperatuur gedurende 10 min.
    8. Voeg 20 ul van 10 x T4 DNA ligase reactiebuffer geleverd door de leverancier enzym (400 mM Tris-HCl (pH 7,8), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP). Voeg 10 eenheden T4 DNA ligase (5 U / pl) en meng voorzichtig door pipetteren.
    9. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
    10. Voeg 20 pl 3 M natriumacetaat (NaOAc) (pH 5,2), 500 ul koude 100% ethanol. Meng de oplossing door vortexen en plaatst de buis in een -20 ° C vriezer gedurende 30 minuten.
    11. Centrifugeer de microfuge bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig door pipetteren.
    12. Was de pellet met koude 70% ethanol en centrifugeer opnieuw bij 20.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Opnieuw verwijder het supernatant en droog de pellet onder vacuüm gedurende 10 min.
    13. Resuspendeer de DNA met 15 ul van DDH 2 O en voeg dan 15 ul van 2x GLB.
    14. Vortex krachtig en verhit tot 90 ° C2 min. Zuiver het volledige DNA met 10% dPAGE zoals hieronder beschreven.
  2. Opstellen 10% dPAGE
    1. Clean twee glasplaten (een vol bord en een getande), twee 0,75 mm dik spacers, en een 12-well kam. Leg één glasplaat op een vlakke ondergrond met twee afstandhouders aan elke kant en de schuine plaat op de top. Clip de twee platen samen met behulp van de vier clips van de leverancier.
    2. In een 150 ml plastic beker, giet 40 ml 10% dPAGE, 40 gl tetramethylethyleendiamine (TEMED) en 400 gl 10% ammoniumpersulfaat (APS). Meng de componenten en giet de oplossing tussen de platen langzaam.
    3. Plaats de kam en laat de gel gedurende 10 minuten polymeriseren. Zodra de gel is gepolymeriseerd, langzaam verwijderen van de kam en spoel de putten met DDH 2 O.
    4. Monteer de platen op de gel-elektroforese apparaat. Gebruik een metalen plaat om warmte gegenereerd om oververhitting te voorkomen verdrijven.
    5. Giet 1x TBE op de bovenste en onderste kamersen zorgen dat de putjes goed ondergedompeld in de buffer. Spoel de putjes met 1x TBE met behulp van een pipet of spuit.
    6. Stel het apparaat te draaien op 35 mA en pre-run voor 15 minuten vóór het laden samples.
  3. Elutie van Geligeerd EC1 van 10% dPAGE
    1. Na stap 2.2.6, voert u de gel op 35 mA totdat de onderste kleurstof (broomfenolblauw) de bodem van het glas plaat is gekomen. Dit duurt ongeveer 1,5 uur duren. Schakel de stroom uit en verwijder de platen uit het apparaat.
    2. Leg de platen op een paar vellen papier handdoeken en zorgvuldig de afstandhouders verwijderen uit de glasplaten. Verwijder voorzichtig de bovenste glasplaat en wikkel de gel met plasticfolie.
    3. Flip de gel over naar de tweede glasplaat te verwijderen en behandel met plastic omslag opnieuw. Zorg ervoor dat de rimpels van de plastic verpakking te vermijden.
    4. Visualiseer de geligeerde product met behulp van UV-shadowing (260 nm), die zal produceren 4 verschillende DNA-banden (Volledig geligeerde EC1, DE1, BS1 en T1).
    5. Accijnzen de bovenste band (EC1) met een steriel scheermesje en transfer naar een 1,5 ml microfugebuis. Plet de gel met een steriele pipet (200 ul tip grootte) tot deze overgaat in een fijne pasta. Voeg 550 ul van DNA elutiebuffer, hebben betrekking op de buis met aluminiumfolie om de embedded fluorofoor te beschermen, en schud gedurende 15 min.
    6. Centrifugeer de geloplossing bij 20.000 xg gedurende 5 min voorzichtig overdracht 400 ul van de supernatant aan een andere 1,5 ml microfugebuis. Vermijd het onttrekken gel stukken tijdens pipetteren.
    7. De microfuge buis met de supernatant overgebracht voeg 40 pl 3 M NaOAc (pH 5,2) en 1,0 ml koude 100% ethanol. Meng de oplossing door vortexen en plaatst de buis in een -20 ° C vriezer gedurende 30 minuten.
    8. Centrifugeer de microfuge bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig door pipetteren.
    9. Was de pellet met koude 70% ethanol en centrifugeer opnieuw bij 20.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Nogmaals, verwijder desupernatant en droog de pellet onder vacuüm gedurende 10 min.
    10. Bepaal de concentratie van EC1 door het meten van UV-absorptie bij 260 nm. Wordt 10 uM voorraad- en bewaar het monster bij -20 ° C tot gebruik.

3. Conjugatie van urease DNA

  1. Bereiding van succinimidyl 4- (N-maleïmidomethyl) cyclohexaan-1-carboxylaat (SMCC) Stock
    1. Los 1 mg SMCC in 676 ui DMSO. Vortex en plaats op ijs tot gebruik.
  2. Bereiding van urease Stock
    1. Los 1 mg urease in 1 ml 1 x PBS (zonder Mg2 + of Ca2 +). Plaats op ijs tot gebruik.
      LET OP: De gekristalliseerde urease is traag om op te lossen en voorzichtig mengen is nodig om denaturatie te voorkomen.
  3. Synthese urease-DNA (UrDNA)
    1. Voeg 10 ul van 100 uM LD1 een 2,5 ml microfugebuis. Voeg 140 ul van DDH 2 O, 40 ui 10X PBS en vortex.
    2. Voeg 80,5 ul van SMCC stock, 159,5 pl DMSO, vortex, en in het kort centrifuge met behulp van een benchtop centrifuge.
    3. Incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten. Vermijd condensatie onder de microfuge dop.
    4. Voeg 200 ul van 1 x PBS, 60 gl 3 M NaOAc (pH 5,2) en 1,5 ml koude 100% ethanol. Meng de oplossing door vortexen en incuberen bij -20 ° C gedurende 30 minuten.
    5. Centrifugeer de oplossing bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en droog de pellet onder vacuüm. Vermijd over-drogen.
    6. De gedroogde pellet voeg 400 pl urease voorraad en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 uur.
    7. Transfer 200 ul van ruwe conjugaat een voorgewassen 100K MWCO centrifugale filterkolom. Centrifugeer de kolom bij 14.000 xg gedurende 5 minuten.
    8. Draagt ​​de resterende 200 pl van ruwe conjugaat aan de kolom en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder de kolom en plaats hem ondersteboven in een nieuwe 2,0 ml microfugebuis ( "collectie tube").
    9. CENTRIFUGE de verzamelbuis (met omgekeerde kolom) bij 1000 g gedurende 2 min. Verwijder de verzamelbuis en voeg 30 ul van 1 x PBS om de centrifugale kolom membraan wassen extra terugwinning van conjugaten.
    10. Opnieuw keren de kolom en zet terug in de verzamelbuis. Centrifugeer de verzamelbuis (met omgekeerde kolom) bij 1000 g gedurende 2 min. Verwijder en gooi de kolom.
    11. Bewaar de UrDNA bij 4 ° C tot gebruik.

4. Montage van de EC1 en UrDNA op Magnetic Beads

  1. Meng de magnetische bead (MB) stock goed en breng 100 ui MB suspensie tot een 1,5 ml microfugebuis. Plaats de microfugebuis op een magnetische rek houder voor het isoleren van de MB.
  2. Verwijder het supernatant door pipetteren en voeg 150 ul bindingsbuffer (BB) naar de buis. Haal de buis uit de houder en tik voorzichtig de tube naar MB mengen om een ​​homogene oplossing. Vermijd spatten van de schorsing van de top van de buis of pet. Als dit gebeurt, gebruik dan een benchtop centrifuge kort draaien de rest terug naar de opschorting.
  3. Herhaal stap 4.2 nog twee keer.
  4. Aan deze suspensie voeg 10 ul van 10 uM EC1. Zorgvuldig mengen door te tikken op de buis.
  5. Incubeer de oplossing met milde schudden gedurende 30 minuten. Tik de buis om de 2-3 minuten om het neerslaan van de MB te voorkomen.
  6. Plaats de microfugebuis terug op de magnetische rek aan de MB te isoleren en verwijder het supernatant door pipetteren. Was de MB driemaal met 150 ui BB (zoals beschreven in stap 4.2).
  7. Zodra het wassen is voltooid, schorten de MB in een totaal van 150 ul van BB. Aan deze oplossing, voeg 15 ul UrDNA en verwarm de oplossing tot 45 ° C gedurende 2 minuten. Koel de oplossing af tot kamertemperatuur en incubeer gedurende 2 uur.
  8. Plaats de microfugebuis terug op de magnetische rek aan de MB te isoleren en verwijder het supernatant door pipetteren.
  9. Voeg 100 ul van de reactie buffer (RB). Verwijder tHij microfugebuisje uit de magnetische rek en voorzichtig resuspendeer de MB.
  10. Was de MB meer drie keer, herhaalt u stap 4.9.
    OPMERKING: De gewassen supernatant kan snel worden getest om te bepalen of gehybridiseerde UrDNA aanhoudt, hetgeen kan leiden tot een vals positief signaal. De test kan worden uitgevoerd door het toevoegen van 10 ui 50 mM ureum en 10 pl 0,04% fenolrood aan het wassop. Blijf de MB wassen totdat de wasoplossing een kleurverandering veroorzaakt. De 100 gl suspensie wordt opgeslagen bij 4 ° C tot gebruik.

5. Bereiding van bacteriële cellen 20

  1. Kweken E. coli van Voorraden
    1. Plate E. coli K12 (MG1655) op LB agarplaten uit een glycerol voorraad onder een vlam of in een biologisch veiligheidskabinet.
    2. Met behulp van een steriele pipet tip, zachtjes aanraken de glycerol voorraad en licht streak het oppervlak van een agarplaat om te voorkomen dat aanprikken van de LB-agar.
    3. Keren de weggeschotenplaat en incubeer bij 37 ° C gedurende 14 uur.
    4. Verzegel de plaat met Parafilm en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 3 weken.
  2. Kweken E. coli for Cell Counting
    1. In een steriele 14 ml cultuur buis, afzien van 2 ml LB-bouillon.
    2. Met behulp van een steriele pipet tip, kies een enkele kolonie van de uitgestreken agarplaat bereid in stap 5.1 en over te dragen aan de cultuur buis.
    3. Incubeer de kweek bij 37 ° C en schudden bij 230 rpm gedurende 14 uur.
    4. Serieel verdunnen de bacteriecultuur in 10-voudige intervallen.
    5. Voor elk verdund monster gelijkmatig plaat vijf 100 ul aliquots op afzonderlijke LB agarplaten. De platen om en incubeer bij 37 ° C gedurende 14 uur.
    6. Tel de cellen van elk monster met het gemiddelde celconcentratie van elke verdunning te verkrijgen.
      LET OP: 10 7 cellen worden vaak gebruikt voor het opzetten van een verwijzing lakmoesproef voor E. coli als dit niveau van E. coli kan een snelle kleur chan triggerenge. Toch kan een goed uitgevoerde lakmoesproef detecteren vanaf 500 cellen, zoals besproken bij de Resultaten.
  3. Het voorbereiden van E. coli cellen voor het testen
    1. Voor een gewenste celsuspensie overdracht 1 ml van gekweekte bouillon aan een 1,5 ml microfugebuis.
    2. Centrifugeer de cellen bij 6000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder voorzichtig de bovenstaande vloeistof zonder de cel pellet.
    3. Voeg 10 ul reactiebuffer aan de cel pellet en resuspendeer de cellen. Ultrasone trillingen de celsuspensie gedurende 5 minuten. Breng de celsuspensie een ijs doos voor 5 min.
    4. Ultrasone trillingen de celsuspensie gedurende nog 5 min.
    5. Centrifugeer de celsuspensie bij 13.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Met de bovenstaande vloeistof te testen (10 ui).

6. lakmoesproef

  1. In een 1,5 ml microfugebuis, voorwas de buis door het toevoegen en vortexen 100 gl reactiebuffer (RB) in de microfugebuis engooi de buffer.
  2. Overdracht 15 ul van geassembleerde EC1 (protocol 4) aan de gewassen microfugebuis.
  3. Was de magnetische korrels door het plaatsen van de microfugebuis op een magnetisch rek. Verwijder het supernatant door pipetteren. Verwijder de microfuge buis uit het rek, voeg 100 pl RB en voorzichtig resuspendeer de magnetische korrels.
  4. Was de MB meer twee keer door het herhalen van stap 6.3.
  5. Plaats de microfugebuis terug op de magnetische rek, de bovenstaande vloeistof en voeg de 10 ul E. coli monster bereid uit stap 5.3.
  6. Meng het monster en magnetische bolletjes zorgvuldig door zachtjes tikken op de microfugebuis.
  7. Incubeer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  8. Aan het reactiemengsel, voeg 90 ul van DDH 2 O en plaats de microcentrifugebuis op een magnetisch rek.
  9. Na ongeveer 3 minuten van magnetische scheiding, zorgvuldig overdracht 85 ul van de supernatant aan een 0,5 ml microfugebuis. Trek de supernatant langzaam naarvoorkomen dat het verzamelen van alle magnetische bolletjes.
  10. Om het bovenstaande microfugebuis voeg 15 pl 0,04% fenolrood, en 100 pl substraatoplossing.
  11. Maak een foto op specifieke tijdstippen om kleurverandering te nemen.
    OPMERKING: De verandering van de pH kan ook worden geanalyseerd met een pH-meter met een micro-elektrode. Het uitgangsmateriaal moet ongeveer pH 5,2-5,5 is (de oplossing is geel). Indien niet, kan de oplossing worden ingesteld door toevoeging van 1 mM acetaat buffer pH 5,0).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het principe van de bacteriële lakmoesproef wordt toegelicht in figuur 1 de test gebruikt drie belangrijke materialen. Een RNA-splitsende DNAzym dat wordt geactiveerd door een specifieke bacterie, urease en magnetische korrels. De DNAzym wordt gebruikt als element moleculaire herkenning voor de specifieke detectie van een bacterie van belang te bereiken. Urease en magnetische korrels worden gebruikt om signaaltransductie van de RNA-splitsingsactiviteit van het DNAzym ber...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De vertaling van de werking van de RNA-splitsingsactiviteit van een bacterie-reagerend DNAzym een lakmoesproef wordt mogelijk gemaakt door het gebruik van urease en magnetische scheiding, zoals blijkt uit figuur 1. Hoewel de demonstratie van de gemodificeerde lakmoesproef voor bacteriële detectie uitgevoerd met E. coli afhankelijke RNA-klieven DNAzym, 5,19,20 het ontwerp kan worden over het algemeen uitgeschoven-RNA klieven DNAzym. Gezien de grote beschikbaarheid van RNA splitsende D...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De financiering voor dit onderzoeksproject werd verstrekt door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) via een Discovery Grant aan YL.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)VWR AMRESCO0105
Sodium Hydroxide (NaOH) pelletsBIO BASIC CANADA INC.SB6789
Tris-baseVWR AMRESCO0497
Boric acidAMRESCO0588
UreaVWR AMRESCOM123
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solutionBIO BASIC CANADA INC.A0007
SucroseBioshop Canada inc.SUC507
Bromophenol blueBioshop Canada inc.BRO777
Xylenecyanol FFSIGMA-ALDRICHX-4126
10% sodium dodecyl sulfateBioshop Canada inc.SDS001
Hydrochloric Acid (HCl)CALEDON LABORATORIES LTD6026
Sodium Chloride (NaCl)Bioshop Canada inc.SOD001
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Bioshop Canada inc.HEP001
Magnesium Chloride (II) hexahydrateVWR AMRESCO0288
Tween 20Bioshop Canada inc.TW508
Adenosine Triphospahte (ATP)AMRESCO0220
Sodium Acetate trihydrate (NaOAc)SIGMA-ALDRICHS8625
EthanolCommercial AlcoholsP016EAAN
Tetramethyleneethylenediamine (TEMED)AMRESCO0761
10% Ammonium persulfate (APS)BIO BASIC CANADA INC.AB0072
Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC)ThermoFisher SCIENTIFIC22360
Dimethyl sulfoxide (DMSO)CALEDON LABORATORIES803540
UreaseSIGMA-ALDRICHU0251
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)ThermoFisher SCIENTIFIC70011-069
0.04% Phenol redSIGMA-ALDRICHP3532
10x T4 polynucleotide kinase reaction bufferLucigen30061-1
10x T4 DNA ligase reaction bufferBio Basics CanadaB1122-B
T4 DNA ligase (5 U/μl)Thermo Fischer ScientificB1122
Luria Bertani (LB) BrothAMRESCOJ106
AgarAMRESCOJ637
T4 polynucleotide kinase (10 U/μl)Lucigen30061-1
E. coli K12 (MG1655)ATCCATCC700926
CentrifugeBeckman Coulter, Inc.392187
Glass platesCBS scientificngp-250nr
0.75 mm thick spacersCBS scientificVGS-0725r
12-well combCBS scientificVGC-7512
UV LampUVP95-0017-09
Spectrophotometer (NanoVue)GE HealthcareN/A
Metal plateCBS scientificCPA165-250
VortexVWR International58816-123
Gel electrophoresis apparatusCBS scientificASG-250
Petri dishesVWR International25384-342
100 kDa MWCO centrifugal filtersEMD MilliporeUFC510024
Magnetic Bead (BioMag)Bangs Laboratories IncBM568
Magnetic Seperation RackNew England BioLabsS1506S
Microfuge tubesSarstedt72.69
Syringe filter (0.22 μm)VWR International28145-501
14 ml culture tubeVWR International60818-725
Cell culture incubatorEppendorf ScientificM13520000
Branson Ultrasonic cleanerBransonN/A
Camera (Canon Powershot G11)CanonN/A
50 ml conical tubeVWR International89004-364

Referenties

  1. Daar, A. S., et al. Top ten biotechnologies for improving health in developing countries. Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).
  2. Newman, J. D., Turner, A. P. Home blood glucose biosensors: a commercial perspective. Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (2005).
  3. Turner, A. P. Biosensors: sense and sensibility. Chem. Soc. Rev. 42, 3184-3196 (2013).
  4. Tram, K., Kanda, P., Salena, B. J., Huan, S. Y., Li, Y. F. Translating Bacterial Detection by DNAzymes into a Litmus Test. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 12799-12802 (2014).
  5. Ali, M. M., Aguirre, S. D., Lazim, H., Li, Y. Fluorogenic DNAzyme probes as bacterial indicators. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).
  6. Schlosser, K., Li, Y. Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA. Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).
  7. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligand by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
  8. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  9. Breaker, R. R. Making catalytic DNAs. Science. 290, 2095-2096 (2000).
  10. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).
  11. Navani, N. K., Li, Y. Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).
  12. Li, J., Lu, Y. A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor for lead ions. J. Am. Chem. Soc. 122, 10466-10467 (2000).
  13. Liu, J., Lu, Y. A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 125, 6642-6643 (2003).
  14. Liu, Z., Mei, S. H. J., Brennan, J. D., Li, Y. Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal specificity and pH dependence. J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).
  15. Liu, J., et al. A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).
  16. Huang, P. J., Vazin, M., Liu, J. In vitro selection of a new lanthanide-dependent DNAzyme for ratiometric sensing lanthanides. Anal. Chem. 86, 9993-9999 (2014).
  17. Chiuman, W., Li, Y. Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA 'MgZ' based on a non-classic allosteric design. PLoS One. 2, e1224(2007).
  18. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).
  19. Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection. Biomolecules. 3, 563-577 (2013).
  20. Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961(2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angew. Chem. Int. Ed. 54, (2015).
  22. He, S., et al. Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe. Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).
  23. Sumner, J. B., Hand, D. B. Isoelectric point of crystalline urease. J. Am. Chem. Soc. 51, 1255-1260 (1929).
  24. Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. 70 Years of crystalline urease: What have we learned. Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).
  25. Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk. Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).
  26. Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef. J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).
  27. Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).
  28. Strachan, N. J., Ogden, I. D. A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom. FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).
  29. de Boer, E., Beumer, R. R. Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms. Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).
  30. Gracias, K. S., McKillip, J. L. A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food. Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Colorimetrische bacteriedetectieRNA splitsend DNAzymurease activiteitmagnetische kraaltjesE coli detectiepH indicatorureahydrolysepathogeendetectietesten van oppervlaktewater

Gerelateerde artikelen