Methodenartikel

Adenofection: Een methode voor het bestuderen van de rol van de Molecular Begeleiders in Cellular Morfodynamica door uitputting-Rescue Experimenten

DOI:

10.3791/54557

⸱

16 september 2016

 ,  ,  ,  , 
1Département de biologie moléculaire, biochimie médicale et pathologie, Faculté de médecine, Centre de recherche sur le cancer de l'Université Laval, 2Oncology, Centre de recherche du CHU de Québec, Université Laval, 3Laboratoire d'études moléculaires des valvulopathies (LEMV), Groupe de recherche en valvulopathies (GRV), Quebec Heart and Lung Institute/Research Center, 4Department of Surgery, Université Laval

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een methode voor depletie-reddingsexperimenten die de cellulaire integriteit en eiwithomeostase behoudt. Adenofectie maakt functionele analyses van eiwitten mogelijk binnen biologische processen die afhankelijk zijn van fijn afgesteld actine-gebaseerde dynamica, zoals mitotische celdeling en myogenese, op het niveau van een enkele cel.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellulaire processen zoals celdeling en celdifferentiatie worden beheerst door veranderingen in cel vorm die grotendeels afhankelijk zijn van een goede herinrichting van de cel cytoskelet structuren. Het betreft de montage-demontage van hogere orde macromoleculaire structuren op een gegeven tijdstip en locatie, een proces dat bijzonder gevoelig is voor storingen veroorzaakt door overexpressie van eiwitten. Methoden die eiwit homeostase te behouden en te handhaven die vlak bij normale celmorfologie zeer gewenst om de functionele bijdrage van een eiwit van belang in een breed scala van cellulaire processen bepalen. Voorbijgaande depletie-rescue experimenten gebaseerd op RNA interferentie zijn krachtige benaderingen van eiwit functies en structurele vereisten te analyseren. Echter, herinvoering van het doelwit eiwit met minimale afwijking van zijn fysiologische niveau is een echte uitdaging. Hier beschrijven we een werkwijze genoemd adenofection die werd ontwikkeld om de rol van moleculaire chaperonnes een studied partners bij het normale gebruik van delende cellen en de relatie met actine remodeling. HeLa cellen werden ontdaan van bag3 met siRNA duplexen gericht op de regio 3'UTR. GFP-gelabeld eiwitten bag3 gelijktijdig opnieuw in> 75% van de cellen onder toepassing van recombinante adenovirussen gekoppeld transfectie reagentia. Adenofection nodig om bag3-GFP eiwitten op nabij fysiologische niveaus in HeLa-cellen ontdaan van bag3 drukken, in afwezigheid van een stressrespons. Er werd geen effect waargenomen op de niveaus van endogene heat shock eiwitten chaperones, de belangrijkste stress induceerbare regulatoren van eiwit homeostase. Verder kan door toevoeging baculovirussen de expressie van fluorescente merkers bij de cel transductie transfectie konden ontleden mitotische celdynamiek door time-lapse microscopische analyses met minimale verstoring van de normale progressie van de mitose. Adenofection ook voor moeilijk te infecteren muizencellen, en geschikt voor functionele analyse van myoblasten diffdifferentiatie in myotubes. Aldus adenofection een veelzijdige werkwijze te voeren structuur-functie analyse van eiwitten betrokken bij gevoelige biologische processen die berusten op hogere orde cytoskelet dynamiek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Functionele inactivatie van genexpressie in zoogdiercellen is de gouden standaard eiwitfuncties ontleden. Nieuw ontwikkelde technologieën genoom bewerking gebaseerd op het gebruik van plaats-specifieke nucleasen zoals zinkvinger nucleasen en geclusterde regelmatig interspaced korte palindroom repeats (CRISPR) / CAS9 nu toe het maken van cellijnen met gerichte gen-deletie en mutatie 1,2. Deze nieuwe aanpak moet een revolutie op de manier waarop we het bestuderen van de functies van eiwitten en ons begrip van de genetica van ziekten bij de mens. In sommige gevallen echter, langdurige of volledige gen knockout is niet wenselijk en kan secundaire cel compensatiemechanismen veroorzaken. Het genereren van genetisch gemodificeerde cellijnen kunnen ook beperkt bij de behandeling van primaire celculturen met beperkte vermeerderingsvermogen of wanneer screening van een groot aantal mutaties in verschillende celtypen wordt gevraagd. Dit is vaak nodig voor het bepalen van de afhankelijkheid van een cel biological proces op structurele vereisten van een eiwit. Daartoe reversibele knockdown door RNA interferentie die voorbijgaande depletie-rescue experimenten in verschillende cellulaire achtergronden maakt nog steeds een eenvoudige en krachtige aanpak uitvoeren structuur-functie analyse van een eiwit van belang 3. Echter, een belangrijk nadeel van deze aanpak is de moeilijkheid om efficiënt silencing bereiken en het eiwit van belang of varianten op bijna fysiologische niveaus opnieuw in een meerderheid van de celpopulatie. Dit is belangrijk om uitgebreide studies die proberen om functionele effecten waargenomen op het niveau van enkelvoudige cellen (hypomorfe fenotype) met die bij cel-populatie gebaseerde testen, bijvoorbeeld op eiwit-eiwitinteracties correleren schakelen.

Transfectie met behulp van klassieke methoden, kan men nauwelijks bereiken homogeen en lage expressie van exogene eiwitten in een grote populatie van cellen. Transductie van cellen met recombinante virussenzoals adenovirussen maakt vaak meer genormaliseerde expressie van exogene eiwitten. Toch is adenovirus opname beperkt door de CAR receptor, dat afwezig is in niet-humane cellen of slechts zwak tot expressie gebracht in bepaalde humane cellen. Bovendien is de cellulaire binnenkomst van adenovirussen activeert signaalroutes dat regelen cel vorm en adhesie 4-6. Dit is uiteraard niet wenselijk bij het bestuderen van regulerende mechanismen van de cel morfodynamiek. We werden geconfronteerd met dit problematisch wanneer we functionele analyses van een chaperonne complex, bag3-HSPB8 ondernam, in celdeling en actine dynamiek. Pionierswerk had een rol voor deze chaperone complex in proteïne kwaliteitscontrole en autofagie beschreven tijdens stress 7,8. De meeste van deze studies echter gebruikt eiwitoverexpressie, aannemende dat de chaperones normaal opgereguleerd tijdens stress. Dit liet de vraag of bag3 hierbij in complex met HSPB8, kan bijdragen tot de normale werking van delende cellen tot expressie these chaperones zoals vele typen kankercellen 9. In het bijzonder de vraag of de chaperonne complex draagt ​​bij aan de herinrichting van actine gebaseerde structuren die mitotische progressie was van groot belang te controleren, gezien de opkomende verbindingen tussen hspB chaperones en cytoskelet dynamiek 10. Om dit probleem aan te pakken, waren we op zoek naar een efficiënte methode voor het depletie-rescue experimenten die niet zou verstoren mitotische progressie of cellulaire morfologie, en welk eiwit homeostase zou behouden secundaire verstoring van de dynamiek van macromoleculaire complexen te voorkomen dat het reguleren van de cel-vormveranderingen ontwikkelen . Dus idealiter depletie-add-back van het betreffende gen gelijktijdig worden uitgevoerd.

Het gebruik van complexen van adenovirus met een kationisch polymeer of lipiden is beschreven genoverdracht in vitro en in vivo 11,12 bevorderen. Bijvoorbeeld, calciumfosfaat (CAPI) blijkt een precipitaat vormen metadenovirus dat virus binden-entry via een CAR-onafhankelijke route 13 te verbeteren. Inderdaad, vonden we dat het combineren van adenovirus-gebaseerde cel transductie en transfectie met kationische verbindingen van de efficiëntie van de uitputting-rescue experimenten zou kunnen vergroten. Dit liet ons toe om de hoeveelheid virus te verlagen 3- tot 20-voudige, afhankelijk van de cellijn en het gen van belang, en van de toevoeging venster om de expressie van exogene eiwitten verstellen nabij endogene niveaus in de meerderheid van een cel bevolking van belang met een minimale impact op cellulaire morfologie. Onder dergelijke omstandigheden, kunnen we ook bereiken een hoog rendement knockdown van endogene eiwit expressie (> 75%). We beschrijven hierbij de werkwijze stapsgewijs en bewijzen dat eiwit homeostase niet significant verstoord gemeten met de onveranderde niveaus van stress geïnduceerde chaperones van de hitteshockproteïne familie, waardoor de werkwijze geschikt voor functionele analyse van de fysiologische role van moleculaire chaperones door time-lapse video microscopie. Het protocol vatbaar is voor cel synchronisatieprocedures en het gebruik van commercieel verkrijgbare baculovirus voor co-expressie van lage niveaus van fluorescente markers, met minimale invloed op de normale actine gebaseerde en spindel dynamiek tijdens mitotische progressie. We de veelzijdigheid van de werkwijze die toepasbaar is muis C2C12 cellen, "moeilijk te transduceren" zonder significante invloed op myoblast differentiatie tot myotubes in vitro tonen verder.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van de Medium en Solutions (alle steriel gefilterd)

  1. C2C12 muizen spiercellen (differentiatie studies)
    1. Bereid 500 ml groeimedium voor C2C12 celkweek onderhoud: DMEM met hoge glucose aangevuld met 10% FBS en 2 mM L-glutamine.
    2. Bereid 100 ml differentiatiemedium (DM) voor C2C12 differentiatie DMEM met hoge glucose aangevuld met 2% paardenserum.
  2. HeLa-cellen (studies in mitotische cellen)
    1. Bereid 500 ml aMEM voor HeLa RFP-H2B celkweek onderhoud en experimenten: aMEM gesupplementeerd met 10% FBS en 2 mM L-glutamine (aMEM 10%).
    2. Bereid 500 ml aMEM-minus (zonder deoxyribonucleosides / ribonucleosides) voor HeLa RFP-H2B cel synchronisatie: aMEM-minus gesupplementeerd met 10% FBS en 2 mM L-Glutamine (aMEM-minus 10%).
    3. Bereid 20 ml aMEM zonder fenol rood voor HeLa-RFP-H2B live cel verwerving: aMEM zonder fenolrood, aangevuld met 10% FBS en 2 mM L-glutamine.
    4. Bereid 100 mM thymidine: los 24,2 mg in 1 ml H2O bij 37 ° C door vortexen. Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C.
  3. gemeenschappelijke oplossingen
    1. Bereid 0,05% trypsine / EDTA: 0,05% trypsine, 0,625 mM EDTA in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Filter steriliseren en opslag porties bij -20 ° C. Ontdooide houden monster bij 4 ° C.
    2. Bereid HBS2x: 280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na 2 HPO 4. Stel de pH precies tussen 7,01-7,05 met 10 N NaOH. Filter steriel en bewaar bij 4 ° C.

2. Coating van Cultuur van de Cel Platen met fibronectine en Plating van HeLa-RFP-H2B Cells

NB: Voorafgaand aan het experiment, elke manipulator moet het opzetten van de optimale cel plating voorwaarden voor een goede dichtheid van de cellen te bereiken, aangezien variaties kunnen occur tussen de manipulator en elke andere cellijn.

  1. De dag voor het experiment, uit te breiden HeLa-RFP-H2B cellen om ervoor te zorgen dat ze binnen de exponentiële fase van de groei op de dag van plating. Maak 2 opeenvolgende 1/3 verdunningen in 10 cm platen uitgaande van een 80% confluent 1x10 cm plaat.
    OPMERKING: Plan het aantal platen voor het experiment. Bereken elke voorwaarde duplo, één voor kort levende cellen imaging en voor eiwitextracten om de effectiviteit van knockdown en exogene eiwit expressie door Western blot-analyse bepaald. Plan een extra plaat het aantal cellen vóór virus transductie te bepalen.
  2. Vóór cel plating, laag glazen bodem schalen met 10 ug / ml fibronectine. Voeg 1 ml van een 1: 100 verdunning van 1 mg / ml fibronectine (verdund in steriele 1x PBS) per 35 mm schotel naar zowel het gehele oppervlak en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
  3. Tijdens de incubatie voorverwarmen aMEM gesupplementeerd wiste 10% FBS (aMEM 10%) en 0,05% trypsine / EDTA bij 37 ° C.
  4. Na 45 min incubatie, start de voorbereiding celoplossing. In de steriele kap, zuig het medium van een 10 cm plaat, tweemaal spoelen voorzichtig met 1,5 ml 0,05% trypsine / EDTA, en laat 0,5 ml trypsine / EDTA bij de laatste aspiratie.
  5. Incubeer de cellen gedurende 2-3 minuten bij 37 ° C, 5% CO2. Door zachtjes de plaat en observatie onder de microscoop te tikken, controleren of alle cellen zijn losgemaakt. Voeg 10 ml aMEM 10% en pipet voorzichtig verscheidene malen om de cellen te scheiden. Behoren een 10 ui monster van de celsuspensie met een hemocytometer.
  6. Aspireren fibronectine oplossing uit de glazen bodem gerechten. Sta niet toe dat fibronectine uit te drogen voordat cel plating.
  7. Plaat 1.5x10 5 cellen per 35 mm schaal in 2 ml aMEM 10% en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2. Controleer na 30-45 min onder de microscoop dat de cellen zijn goed SEPAgewaardeerd, aangezien zij de neiging tot accumulatie in het midden van de plaat.
  8. Eventueel schud de platen voorzichtig kruislings om de cellen opnieuw te verdelen. Een plaat 35 mm plaat bovenop het aantal condities om het aantal cellen vóór virus transductie tellen.
  9. Cellen groeien tot de volgende dag tot een celdichtheid van boven de 50%. Een celdichtheid van minder dan 50% resulteert in een significante afname van virus transductie efficiëntie, toegenomen variaties van eiwitexpressie per cel en verhoogde celtoxiciteit.
    LET OP: Coating van glas gerechten met fibronectine verbetert celgroei en morfologie en bevordert een goede progressie van cellen door mitose. Algemeen kan worden vervangen door commercieel beschikbare gelatine dat goedkoper.

3. Adenovirus Transductie en endogene proteïne knockdown door siRNA Transfectie in HeLa-RFP-H2B cellen met behulp van capi Precipitaten

Let op! Working met virussen vereist speciale voorzorgsmaatregelen en het weggooien van het materiaal dat in contact met het virus is geweest.

Let op! In onze handen, capi neerslaat hebben vaak meer ongewenste effecten, bijvoorbeeld op biologische processen waarbij blaasje mensenhandel (bv, autofagie). Dienovereenkomstig is het raadzaam om een ​​kationisch lipide transfectiereagens (zie hieronder) en ten minste 48 uur wachten voordat de analyses.

Opmerking: Een controle adenovirus uitvoering een niet-verbonden gen (bijv LacZ) of geen gen wordt gebruikt om een minimale traagheidsmoment in alle Adenofections (10-20 pfu / cel) met de laagste hoeveelheid van recombinant adenovirus die het gen van interesse te bereiken.

Opmerking: Deze procedure is aangetoond dat het normaliseren expressie per cel te helpen bij een grote celpopulatie.

  1. Eén dag na cel plating, telt het aantal cellen van de aanvullende schaal uitgeplaat. Zuig het medium enSpoel eenmaal met 1 ml 0,05% trypsine / EDTA. Voeg nogmaals 1 ml 0,05% trypsine / EDTA en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 totdat alle cellen losgemaakt. Scheiden de cellen goed om met een 1 ml pipet en tel het aantal cellen per ml met behulp van een hemocytometer.
  2. Bepaal de hoeveelheid virus die nodig is om cellen te transduceren met een multipliciteit van infectie (MOI) van 2 plaquevormende eenheden (PFU) van het eiwit van interesse (POI) per cel en 18 PFU per cel met een lege vector (bijvoorbeeld LacZ) een totaal van 20 pfu per cel. Tegelijkertijd transduceren 4 PFU per baculovirus (actine en αTubulin, GFP en RFP hebben respectievelijk). Transduceren de cellen met het volgende adenofection protocol. Virussen werden gebruikt zoals beschreven in Fuchs et al. 14
  3. Bereid in een steriele kap een 1,5 ml plastic buis voor elke voorwaarde en voeg 400 pl warm aMEM-minus 10%.
  4. Dooi een hoeveelheid van het virus langzaam op ijs en, indien nodig, verdund tHij virusstock om een ​​volume pipet groter dan 1 pi tot pipetteringsfouten minimaliseren.
  5. Voeg de berekende hoeveelheid virus per voorwaarde voor elke 1,5 ml plastic buisje met 400 ul aMEM-minus 10% toe en meng voorzichtig door pipetteren. Plaats de virusvoorraad direct weer bij -80 ° C om de activiteit ervan behouden.
  6. Zuig het medium van de cellen en voorzichtig pipet het virus mengsel druppelsgewijs. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO 2 en beweeg de platen voorzichtig onder steriele kap elke 15 min gedurende 1 uur goed bedekken de cellen met het virus. Met een kleine hoeveelheid medium vergemakkelijkt het contact van het virus met de cellen.
  7. Na incubatie voorzichtig pipet 1,6 ml aMEM-minus 10% aan elke plaat tot een totaal volume van 2 ml te verkrijgen, begin cel synchronisatie door toevoeging van 2 mM thymidine en incubeer de cellen gedurende nog eens 2 uur bij 37 ° C, 5% CO 2 .
  8. Ondertussen bereiden de siRNA transfectie mix following de capi transfectie methode (zie figuur 1). Als er geen siRNA nodig is, vervang de hoeveelheid siRNA door steriel water om een lege transfectie uit te voeren.
  9. Bereken 200 pi mix voor elke voorwaarde, wat resulteert in 400 gl per tweevoud. Het volgende voorbeeld dient een uiteindelijke siRNA concentratie van 50 nM en moet worden aangepast voor elk eiwit van interesse. In een 1,5 ml plastic buis pipet 50 gl 1 M CaCl2 en 11 pl 20 pM siRNA in 139 ui steriel H2O en door vortexen gemengd. Na een snelle draai, voeg zorgvuldig druppelsgewijs 200 ui HBS2x (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na 2 HPO 4, pH 7,01-7,05).
    OPMERKING: Hoe kleiner de druppels hoe kleiner de precipitaten waardoor een betere transfectie-efficiëntie. Meng drie keer door de lucht injectie met behulp van een 200 ul-pipet.
  10. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg langzaam druppelsgewijze 200 ul transfectie mix aan elke plaat enageren cross-wise. Breng de platen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 16 uur.
  11. De volgende dag, spoel cellen tweemaal met 2 ml warm HEPES (6,7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,3) en voeg 2 ml aMEM-minus 10%. Niet verder meer dan vier celplaten tegelijk aangezien temperatuur- invloed op de lengte van de celcyclus.
  12. Visualiseren de infectie-efficiëntie onder een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop bij een vergroting van 20-40x (lucht) en het verwerven van drie representatieve beelden per aandoening fluorescentie- en transmissiekanalen voor documentatie. Zeven uur later, voeg 2 mM thymidine en incubeer nogmaals 16 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
  13. De volgende dag, 48 uur na siRNA transfectie en virusinfectie Spoel de cellen tweemaal met 2 ml warm fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) en laat gedurende 7 uur in 2 ml aMEM 10% w / o Phenol Red live cell imaging of Phenol rood voor eiwitextractie.
  14. Oogst cellen voor elke conditie 48 uur na transfectie voor de bereiding van eiwitextracten en Western blot analyse om de efficiëntie van het uitschakelen en de expressie van het endogene eiwit 15 bepalen.
    OPMERKING: Gebruik antilichamen tegen het eiwit van belang, alsmede de geschikte antilichamen dienen als het laden van controles. De efficiëntie van het uitschakelen worden bepaald door het laden afnemende hoeveelheden van cellysaten control (control getransfecteerd met siRNA), een titratie curve verschaffen (dwz 1, ½, ¼, ⅛).

4. Adenovirus Transductie en endogene proteïne knockdown door siRNA Transfectie in HeLa-cellen met behulp van een kationogeen lipide transfectiereagens

OPMERKING: Hier presenteren we een protocol dat is aangepast voor experimenten die geen cel synchronisatie omvatten en / of wanneer siRNA transfectie niet kan worden uitgevoerd door de werkwijze CAPI bijvoorbeeld ongewenste toxische effecten in sommige mobiele lin voorkomenes. Dit protocol een cel replating stap na adenofection om te werken bij een geschikte celdichtheid. We hebben alleen getest het kationische lipide transfectiereagens.

Let op! Het werken met virussen vereist speciale voorzorgsmaatregelen en het weggooien van het materiaal dat in contact met het virus is geweest.

  1. Plaat 1,75 x 10 5 cellen per 35 mm schaal in 2,5 ml aMEM 10% en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2. Een plaat 35 mm plaat bovenop het aantal condities om het aantal cellen vóór virus transductie tellen.
  2. Cellen groeien tot de volgende dag tot een celdichtheid van boven de 50%. Een celdichtheid van minder dan 50% resulteert in een significante afname van virus transductie efficiëntie, toegenomen variaties van eiwitexpressie per cel en verhoogde celtoxiciteit.
  3. Eén dag na cel plating, telt het aantal cellen van de aanvullende schaal uitgeplaat. aspirerenhet medium en spoel eenmaal met 1 ml 0,05% trypsine / EDTA. Voeg nogmaals 1 ml 0,05% trypsine / EDTA en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 totdat alle cellen losgemaakt. Afzonderlijke cellen goed om met een 1 ml pipet en tel het aantal cellen per ml.
  4. Bepaal de hoeveelheid virus die nodig is om een multipliciteit van infectie (MOI) van 20-40 plaquevormende eenheden (PFU) van het eiwit van interesse (POI) per cel en 0-20 PFU per cel van een lege vector transduceren (bv LacZ) tot een totaal van 40 pfu per cel.
  5. Bereid in een steriele kap een 1,5 ml plastic buis voor elke conditie en voeg 400 ul van warme aMEM 10%.
  6. Dooi een hoeveelheid van het virus langzaam op ijs en, indien nodig verdunnen virusvoorraad om een ​​volume pipet groter dan 1 pi tot pipetteringsfouten minimaliseren.
  7. Voeg de berekende hoeveelheid virus per voorwaarde voor elke 1,5 ml plastic buisje met 400 ul aMEM 10% toe en meng voorzichtig door pipetteren. plaats the virusvoorraad direct weer bij -80 ° C om de activiteit ervan behouden.
  8. Zuig het medium van de cellen en voorzichtig pipet het virus mengsel druppelsgewijs. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO 2 en beweeg de platen voorzichtig onder steriele kap elke 15 min gedurende 1 uur goed bedekken de cellen met het virus verdunning. Met een kleine hoeveelheid medium vergemakkelijkt het contact van het virus met de cellen.
  9. Ondertussen bereiden de siRNA transfectie mix na de transfectie methode. Indien geen siRNA nodig is, vervangt de hoeveelheid siRNA door medium zonder serum een lege transfectie voeren.
    1. Het volgende voorbeeld dient een uiteindelijke siRNA concentratie van 50 nM en moet worden aangepast voor elk eiwit van interesse. Voor elke adenofection, bereiden een 1,5 ml plastic buisje met 416 nM siRNA in 150 ul medium zonder serum (bijv, 6,25 ul 20 uM siRNA + 144 ul medium zonder serum) en een 1,5 ml plastic buis containi6,25 ng pl kationisch lipide transfectiereagens + 144 gl medium zonder serum.
    2. Meng de inhoud van elke kunststofbuis door en neer te pipetteren meerdere malen met een 200 ul pipet. Combineer de inhoud van beide buizen en meng door en neer te pipetteren meerdere malen met een 200 ul pipet. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  10. Na incubatie met het virus, voorzichtig pipet 1,8 ml aMEM 10% aan elke plaat tot een totaal volume van 2,2 ml direct verkrijgen en voeg langzaam druppelsgewijze de siRNA transfectie mix aan elke plaat en beweeg kruiselings. Breng de platen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur.
  11. De volgende dag opnieuw plaat de cellen van elke 35 mm plaat in vier nieuwe 35 mm platen in 2,5 ml aMEM 10% elk en incubeer gedurende nog 24 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
  12. De volgende dag, 48 uur na transfectie siRNA en virusinfectie, oogst cellen van één plaat per voorwaarde voor de bereiding vaneiwitextracten en Western blot analyse om de efficiëntie van het uitschakelen en de expressie van het endogene eiwit 15 bepalen.
    OPMERKING: Bij de overige platen, verder met cel fixatie met het protocol keuze en onderwerpen van de monsters naar immunofluorescentie analyse met antilichamen van belang 14.

5. Live-cell imaging van mitotische cellen en Data-analyse

  1. Uitvoeren korte live cell imaging experimenten op mitotische cellen met een omgekeerde microscoop uitgerust met een bevochtigd / 5% CO 2 / thermisch gestuurde kamer.
    Opmerking: In dit onderzoek, een draaiende schijf confocale microscoop (40X, 0,75 NA) gebruikt, uitgerust met een gekoelde EMCCD ladingsgekoppelde camera bij -50 ° C.
  2. Voorafgaand aan de overname, te controleren of de kamer de juiste temperatuur van 37 ° C heeft bereikt.
    LET OP: Dit kan enkele uren duren, afhankelijk van de microscopische systeem.
  3. Plaats de cultuur gerechten in de MICRoscope kamer 1 uur voor overname juiste evenwicht van het medium mogelijk te maken en de focus te vermijden drijven als gevolg van temperatuurveranderingen. Controleer de mitotische toestand van de cellen. Op dit punt moet 10-15% van de cellen in de vroege stadia van mitose (profase-prometaphase).
  4. Tijdens het evenwicht tijd, het opzetten van de acquisitie parameters, zoals bepaald in eerdere experimenten. Kenmerkend een belichtingstijd voor beide kanalen (488 en 594) van 0,2-3 sec met een laser intensiteit van 100% en een gevoeligheid van 121-130 zijn geschikte parameters in onze handen.
    LET OP: De eerste tests moeten worden gedaan om de minimum laser intensiteit en acquisitie tijd / interval die leiden tot een passende oplossing met een minimum aan fotobleken die cel schade veroorzaakt en verstoort mitotische progressie te bepalen.
  5. Kies verschillende velden per toestand een aanzienlijk aantal cellen te analyseren zonder overschrijding van de overname interval. Met behulp van een draaiende schijf confocale systeem, een typische setup zal include vier verschillende condities, 7 velden per bord en 2 kleuren kanalen (488 en 594) met een 1,5-2 min interval over een 75 min-periode.
  6. Kies cellen die zich op mitotische ingang, opnieuw in te stellen de focus zodra alle velden zijn gekozen en start de overname zo snel mogelijk.
  7. Bewaken van de stabiliteit van het systeem ten minste drie tijdstippen en opnieuw de scherpstelling zonodig.
  8. Na de eerste korte live cell imaging van 75 min, kunnen nieuwe gebieden van mitotische cellen worden gekozen om een ​​tweede reeks films verwerven om het aantal cellen te analyseren verhogen.
  9. Bepalen welomschreven analyseren de mitotische fenotypen van cellen, die afhangt van de fluorescente merkers worden gebruikt. Defecten in mitose kunnen zijn: langere tijd doorgebracht in mitose (van nucleaire afbraak tot anafase), chromosoom foutieve uitlijning, spindle schommelen, en cortex blebbing 14.

6. LifeAct-TagGFP2 adenovirus transductie in Differentiating C2C12 Mouse myoblasten

OPMERKING: De adenofection protocol ook voor moeilijk te infecteren muis C2C12-myoblasten ondergaan differentiatie.

  1. Plaat 2 x 10 5 C2C12 cellen in 35 mm kweekschalen in groeimedium op plastic of op een substraat van keuze.
    LET OP: Cel differentiatie wordt verbeterd gelatine- of-Matrigel gecoate gerechten. Plan een extra plaat het aantal cellen vóór virus transductie te bepalen.
  2. De volgende dag worden de cellen 80% van confluentie hebben bereikt. Induceren myoblast differentiatie door het wassen van de cellen tweemaal met warm PBS en het toevoegen van 2 ml van differentiatie medium (DM).
  3. De volgende dag, aangeduid als dag 1 (D1) van differentiatie transduceren myocyten met adenovirus LifeAct-TagGFP2 het actine cytoskelet in levende cellen te visualiseren. Tel het aantal cellen van de extra plaat zoals beschreven onder 3.2. Bereken 5 PFU / cel van LifeAct-TagGFP2 adenovirus en 45 PFU / cel AdLacZ na het examenple beschreven in tabel 1. De totale hoeveelheid virus is 50 PFU / cel. Virussen werden als beschreven 14
  4. Bereid in een steriele kap een 1,5 ml plastic buis voor elke conditie en voeg 400 ul van warm DM.
  5. Dooi een hoeveelheid van het virus langzaam op ijs en, indien nodig verdunnen virusvoorraad om een ​​volume pipet groter dan 1 pi tot pipetteringsfouten minimaliseren.
  6. Voeg de juiste hoeveelheid virusdeeltjes per conditie aan elke 1,5 ml plastic buisje met 400 pi DM en meng voorzichtig door pipetteren. Plaats de virusvoorraad direct weer bij -80 ° C om de activiteit ervan behouden.
  7. Zuig het medium van de gerechten en voorzichtig pipet het virus mix druppelsgewijs. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO 2 en beweeg de platen voorzichtig onder steriele kap elke 15 min gedurende in totaal 1 uur goed bedekken de cellen met het virus.
  8. Na incubatie, voorzichtig pipet 1,6 ml DM op elk bord en ga verder op de incubation gedurende nog 2 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
  9. Ondertussen bereiden een lege transfectie mix na de capi transfectie methode. Bereken 200 pi mix voor elke conditie. Met het volgende voorbeeld voor een totaal volume van 400 pi mix.
    1. In een 1,5 ml plastic buis pipet 50 gl 1 M CaCl2 in 150 ui steriel H2O en door vortexen gemengd. Na een snelle draai, voeg zorgvuldig druppelsgewijs 200 ui HBS2x (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na 2 HPO 4, pH 7,01-7,05). Meng door de lucht injectie drie keer met behulp van een 200 ul pipet.
  10. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg langzaam druppelsgewijze 200 ul van de transfectie mix aan elke plaat en beweeg cross-wise. Breng de platen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 16 uur.
  11. De volgende dag Spoel de cellen tweemaal met 2 ml warm HEPES (6,7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,3) en voeg 2 ml DM. Visualiseer de Infectie-rendement onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop bij een vergroting 20-40X (lucht) en het verwerven van drie representatieve beelden per aandoening fluorescentie- en transmissiekanalen voor documentatie.
  12. Afhankelijk van de gewenste instellingen van het experiment als volgt differentiatie tot myotubes enkele dagen. Cellen worden gefixeerd en vervolgens onderworpen aan immunofluorescentieanalyse of live cell imaging studies kunnen worden uitgevoerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfectie van bag3-GFP plasmide DNA met kationische lipiden geassocieerd met heterogene expressie in HeLa-cellen, sommige cellen geeft nauwelijks detecteerbare niveaus van het eiwit en andere dragende hoge bag3 niveaus (Figuur 2A). In deze cellen, eiwitverlies homeostase werd bewezen door de accumulatie van bag3-GFP in perinucleaire aggregaten (Figuur 2A, pijlen). In tegenstelling cel transductie met adenovirussen met bag3-GFP vertoonden homogener lage...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een werkwijze waarmee depletie-rescue experimenten uit te voeren, die van toepassing zijn functionele analyses van celbiologische processen die bijzonder gevoelig zijn voor overexpressie van eiwitten die de stoichiometrie en dynamiek van eiwitcomplexen en macromoleculaire structuren is. Mitotische celdeling is een extreem voorbeeld van fijn afgestemde cel morfodynamiek de meest dramatische en samenhangende verandering in de totale structuur van een cel omvat. Adenofection gebruikt in combinatie met c...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Canadian Institutes of Health Research (subsidie nr. 7077), en door de Bellini Foundation en Roby Fondazione.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
C2C12 Muis MyoblastenATCCCRL-1772
Adenoviraal aangepast ontwerpWelgenAangepast ontwerp
CalciumchlorideFisher ScientificC79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0Thermo FisherC10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0Thermo FisherC10614
Dulbecco's aangepast Eagle-medium (DMEM), Hoge glucoseThermo Fisher11965-092
EDTASigmaE5134
Foetaal bovien serum (FBS)Thermo Fisher12483-020
FibronectineSigmaF1141
Schaaltjes met glazen bodem, 35 mmMatTek CorperationP35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2BVriendelijk geschonken door Dr. Sabine Elowe, Québec, CanadaKlebig C et al. 2009
HEPESFisher ScientificBP310-1
Paardenserum, Nieuw-ZeelandThermo Fisher16050-122
KClFisher ScientificBP366-500
L-GlutamineThermo Fisher25030081
Lipofectamine® RNAiMAX Transfectie ReagensThermo Fisher13778-150
Minimaal Essentieel Medium (MEM) AlphaWisent310-101-CL
Minimaal Essentieel Medium (MEM) Alpha zonder Desoxyribonucleosiden/RibonucleosidenThermo Fisher12000-022
Minimaal Essentieel Medium (MEM) Alpha zonder Fenol RoodThermo Fisher41061-029
Na2HPO4BiobasicS0404
NaClFisher ScientificBP358-10
OptiMEMThermo Fisher11058-021
rAVCMV-LifeAct-TagGFP2IBIDI60121
siRNA duplexenDharmaconAangepast ontwerp
ThymidineSigmaT9250
Trypsine 2,5%Thermo Fisher15090-046

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
  2. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  3. Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).
  4. Natarajan, K., Rajala, M. S., Chodosh, J. Corneal IL-8 expression following adenovirus infection is mediated by c-Src activation in human corneal fibroblasts. J Immunol. 170 (12), 6234-6243 (2003).
  5. Yousuf, M. A., et al. Caveolin-1 associated adenovirus entry into human corneal cells. PLoS One. 8 (10), e77462(2013).
  6. Morton, P. E., Hicks, A., Nastos, T., Santis, G., Parsons, M. CAR regulates epithelial cell junction stability through control of E-cadherin trafficking. Sci Rep. 3, 2889(2013).
  7. Carra, S., Seguin, S. J., Lambert, H., Landry, J. HspB8 chaperone activity toward poly(Q)-containing proteins depends on its association with Bag3, a stimulator of macroautophagy. J Biol Chem. 283 (3), 1437-1444 (2008).
  8. Fuchs, M., et al. Identification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction. Biochem J. 425 (1), 245-255 (2010).
  9. Rosati, A., Graziano, V., De Laurenzi, V., Pascale, M., Turco, M. C. BAG3: a multifaceted protein that regulates major cell pathways. Cell Death Dis. 2, e141(2011).
  10. Guilbert, S. M., et al. The Big Book of Small Heat Shock Proteins. Tanguay, R. M., Hightower, L. E. , Springer International Publishing AG. 435-456 (2015).
  11. Fasbender, A., et al. Complexes of adenovirus with polycationic polymers and cationic lipids increase the efficiency of gene transfer in vitro and in vivo. J Biol Chem. 272 (10), 6479-6489 (1997).
  12. Toyoda, K., et al. Cationic polymer and lipids enhance adenovirus-mediated gene transfer to rabbit carotid artery. Stroke. 29 (10), 2181-2188 (1998).
  13. Fasbender, A., et al. Incorporation of adenovirus in calcium phosphate precipitates enhances gene transfer to airway epithelia in vitro and in vivo. J Clin Invest. 102 (1), 184-193 (1998).
  14. Fuchs, M., et al. A Role for the Chaperone Complex BAG3-HSPB8 in Actin Dynamics, Spindle Orientation and Proper Chromosome Segregation during Mitosis. PLoS Genetics. 11 (10), e1005582(2015).
  15. Champagne, C., Landry, M. C., Gingras, M. C., Lavoie, J. N. Activation of adenovirus type 2 early region 4 ORF4 cytoplasmic death function by direct binding to Src kinase domain. J Biol Chem. 279 (24), 25905-25915 (2004).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  17. Takahashi, A., et al. Myogenic Akt signaling regulates blood vessel recruitment during myofiber growth. Mol Cell Biol. 22 (13), 4803-4814 (2002).
  18. Murray, T. V., et al. A non-apoptotic role for caspase-9 in muscle differentiation. J Cell Sci. 121 (Pt 22), 3786-3793 (2008).
  19. Terada, K., Misao, S., Katase, N., Nishimatsu, S., Nohno, T. Interaction of Wnt Signaling with BMP/Smad Signaling during the Transition from Cell Proliferation to Myogenic Differentiation in Mouse Myoblast-Derived Cells). Int J Cell Biol. 2013, 616294(2013).
  20. Hindi, S. M., Tajrishi, M. M., Kumar, A. Signaling mechanisms in mammalian myoblast fusion. Sci Signal. 6 (272), re2(2013).
  21. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

BAG3 ProteinsiRNA TransductionAdenovirus ExpressionGFP TaggingMitotic AnalysisLive Cell Imaging

Gerelateerde artikelen