Bepaling van de Zeta Potentiële via nanodeeltjes Translocation Snelheden door een Tunable Nanopore: Met behulp van DNA-gemodificeerde deeltjes als een voorbeeld

Samenvatting

Hier gebruiken we een polyurethaan afstembare nanopore geïntegreerd in een weerstandsbelasting puls detectie techniek nanodeeltjes oppervlaktechemie gekenmerkt via de meting van het translocatie snelheden, die kunnen worden gebruikt om het zeta potentieel van individuele nanodeeltjes bepalen.

Samenvatting

Nanopore technologieën, gezamenlijk bekend als resistieve pulssensoren (RPS), worden gebruikt voor het detecteren, kwantificeren en karakteriseren van eiwitten, moleculen en nanodeeltjes. Afstembare resistieve pulse sensing (TRPS) is een relatief recente aanpassing RPT dat een afstembare porie die kunnen worden gewijzigd in real time opgenomen. We gebruiken hier TRPS de translocatie tijden van DNA-gemodificeerde nanodeeltjes bewaken zijn bij het doorkruisen de afstembare porie membraan als functie van de DNA-concentratie en de structuur (dat wil zeggen enkelstrengs aan dubbelstrengs DNA).

TRPS is gebaseerd op twee Ag / AgCl-elektroden gescheiden door een elastomeer membraan porie dat een stabiele ionenstroom op een aangelegd elektrisch veld bepaalt. In tegenstelling tot diverse optische gebaseerde deeltjes karakterisering technologieën, kunnen TRPS individuele deeltjes te karakteriseren onder een steekproef bevolking, waardoor voor multimodaal monsters worden geanalyseerd met gemak. Hier tonen we zetapotentiaal metingendeeltje via translocatie snelheden van bekende standaarden en toepassen op analyt translocatie maal monster, hetgeen resulteert in de meting van de zeta-potentiaal van deze analyten.

Te verschaffen, om gemiddelde zeta potentiaal waarden worden de monsters allemaal gemeten onder toepassing van een deeltje per deeltje perspectief vertoont meer informatie over een bepaald monster door monster populatieverdelingen bijvoorbeeld. Van een dergelijke, deze methode toont potentieel binnen sensing toepassingen zowel medische en milieugebied voor.

Inleiding

Gefunctionaliseerde nanodeeltjes worden steeds populairder als biosensoren zowel medische en milieu velden. Het vermogen om een nanodeeltje de oppervlaktechemie te veranderen, met DNA, bijvoorbeeld, is nuttig voor gerichte geneesmiddelafgiftesystemen ¹ en controle DNA-eiwit interacties ^2-4 blijkt. Een steeds vaker voorkomende nanodeeltjes pand wordt gebruikt in bioassays en in de levering van geneesmiddelen is superparamagnetisme ^5. Superparamagnetische deeltjes (POD) zijn zeer bruikbaar bij het identificeren en verwijderen van specifieke analyten uit complexe mengsels en kan dit met de eenvoudige bediening van een enkele magneet. De verwijderde de analyt gebonden deeltjes kunnen worden gekarakteriseerd en geanalyseerd geschikt voor het doel.

Vorige methoden voor de detectie en karakterisering van nanodeeltjes omvatten optische technieken zoals dynamische lichtverstrooiing (DLS), alias fotoncorrelatiespectroscopie. Hoewel een high throughput techniek DLS beperkt tot zijnde een gemiddelde gebaseerde techniek en bij de analyse van multimodale monsters zonder toevoeging van gespecialiseerde software, zal de grotere deeltjes een meer dominante signaal te produceren, waardoor sommige van de kleinere deeltjes volledig onopgemerkt ^6,7. Particle-by-deeltjes karakterisering technieken zijn daarom veel gunstiger voor nanodeeltjes en gefunctionaliseerde nanodeeltjes te analyseren.

RPS gebaseerde technologieën zijn gebaseerd op het aanleggen van een elektrisch veld aan een monster en controle op de transportmechanisme van de deeltjes door een synthetisch of biologisch nanopore. Een relatief recente nanodeeltjes detectie en typering techniek op basis van RPS is instelbaar resistieve pulse sensing (TRPS) ^8-16. TRPS Twee-elektrodensysteem gescheiden door een elastomeer, afstembare membraan poriën. Afstembaar porie werkwijze maakt analyten verschillende vorm ¹⁷ en afmetingen te meten via de transpoort mechanismen door de porie. Afstembare poriën zijn eerder gebruikt voor de detectie van kleine deeltjes (70-95 nm diameter) produceren vergelijkbare resultaten met andere technieken zoals transmissie elektronen spectroscopie (TEM) ^10. Wanneer een elektrisch veld wordt toegepast, wordt een ionenstroom waargenomen en als deeltjes / moleculen door de poriën passeren, zij tijdelijk de poriën blokkeren, waardoor een verlaging van de stroom die kan worden gedefinieerd als een "blokkade event. Elke blokkade gebeurtenis representeert een enkel deeltje zodat elk deeltje in een monster afzonderlijk kenmerk kan worden gebaseerd op de blokkade magnitude, Δ En volle breedte half maximum, FWHM, evenals andere eigenschappen blokkade. Het analyseren van individuele deeltjes als ze door een nanogaatje passeren is voordelig voor multimodaal monsters als TRPS succesvol en effectief een bereik kan onderscheiden van deeltjesgrootte AmonGST een enkel monster. Tunable resistieve pulse sensing voltooit maat ^10, zetapotentiaal ^12,18 en concentratie ¹⁵ metingen tegelijk in een enkele run en kan dus nog differentiëren monsters van soortgelijke, zo niet dezelfde grootte van hun oppervlakte lading ^19; een voordeel ten opzichte van alternatieve dimensionering technieken.

Zeta potentieel wordt gedefinieerd als de elektrostatische potentiaal op het vlak van afschuiving ^20, en wordt berekend uit deeltjessnelheden mocht steken een porie ^19. Zeta potentiaal metingen van afzonderlijke geeft dus inzicht in de mechanismen translocatie en het gedrag van nanodeeltjes systemen in oplossing waardevolle informatie voor de toekomst van nanodeeltjes test ontwerpen voor verschillende toepassingen. Deeltje per deeltje analyse van dergelijke aard maakt ook de verspreiding en verspreiding van zeta potentiaal waarden bij een steekproef worden onderzocht, waardoor meer informatie on reactiekinetiek (enkelstrengs aan dubbelstrengs DNA, bijvoorbeeld) en deeltjes stabiliteiten in oplossing te bereiken.

We beschrijven een techniek die detecteert en kenmerkend zowel ongemodificeerde en gemodificeerde DNA-SPP oppervlakken. De hierin beschreven protocol is toepasbaar op een reeks van anorganische en biologische nanodeeltjes, maar we tonen de procedure via DNA-gemodificeerde oppervlakken vanwege hun breed toepassingsgebied. De techniek kan de gebruiker onderscheid tussen enkelstrengs en dubbelstrengs DNA doelen op een nanodeeltje oppervlak, gebaseerd op deeltjes translocatie snelheden door een poriënsysteem en zo hun zeta potentieel.

Protocol

1. Het maken van de fosfaat gebufferde zoutoplossing met Tween-20 (PBST) Buffer

1. Ontbinden één tablet PBS (0,01 M fosfaatbuffer, 0,0027 M kaliumchloride, 0,137 M natriumchloride, pH 7,4) in 200 ml gedeïoniseerd water (18,2 MQ cm).
2. Voeg 100 ul (0,05 (v / v)%) Tween-20 aan de 200 ml bufferoplossing als surfactant.

2. De voorbereiding van de Carboxyl polystyreen Particle Standards

1. Vortex de kalibratie deeltjes gedurende 30 seconden voordat sonicatie gedurende 2 minuten bij 80 watt monodispersiteit van de deeltjes te creëren.
2. Verdun de kalibratie deeltjes 1 in 100 tot een concentratie van 1x10 ¹⁰ deeltjes / ml in PBST buffer en vortex gedurende 30 seconden.

3. Voorbereiden van Streptavidine gecoate deeltjes

1. Vortex de deeltjes gedurende 30 seconden voordat sonicatie gedurende 2 minuten bij 80 Watt monodispersiteit waarborgen.
2. Verdun de streptavidine beklede deeltjes 1 in 100 in PBST buffer achieve een resulterende concentratie van 1x10 ⁹ deeltjes / ml en vortex gedurende 30 seconden.
   Opmerking: Een typische monstervolume is 200 pi. Wanneer bijvoorbeeld vijf onderzoeken DNA concentraties te bereiden 1 ml verdunde streptavidine beklede deeltjes.

4. Bereiding van Oligonucleotiden

1. Reconstitueren oligonucleotiden met gedeïoniseerd water tot een resulterende concentratie van 100 uM.

5. Toevoeging van vangprobe (CP) DNA aan de streptavidine beklede deeltjes

1. Voorafgaand aan DNA binden, vortex streptavidine gecoate deeltjes (200 pi monstervolume) gedurende 30 seconden gevolgd door een 2 minuten sonicatie bij 80 watt.
2. Gebaseerd op de bindingscapaciteit van de leverancier (4352 pmol / mg), voeg de juiste concentratie van DNA aan de deeltjes voor resulterende concentraties van 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 en 210 nM DNA.
3. Vortex de monsters gedurende 10 seconden en leg ze op een roterend wiel bij kamertemperatuurgedurende 30 minuten om het DNA via een streptavidine-biotine interactie binden aan het deeltjesoppervlak.
4. Zodra de capture DNA werd toegevoegd en geïncubeerd met streptavidine beklede deeltjes, het overtollige DNA in oplossing via magnetische scheiding door het plaatsen van de monsters op een magnetische rek voor 30 min.
5. Verwijder het supernatant, verzorgen de nieuw gevormde cluster deeltjes dichtste bij de magneet niet te verstoren, en vervangen door hetzelfde volume van nieuwe PBST buffer.

6. Hybridiserende Complementair DNA aan de CP-deeltjes

1. Voeg de vereiste hoeveelheid doel-DNA (meer dan 500 nM) bij het optimaliseren doelwitbindingsgebied bereikt waarborgen.
2. Vortex de monsters gedurende 10 sec en plaats op een roterend wiel bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
3. Zodra de hybridisatie voltooid is, het overtollige target DNA via magnetische scheiding door het plaatsen van de monsters op een magnetische rek voor 30 min.
4. Verwijder het supernatant, Zorg ervoor dat u de nieuw gevormde cluster van deeltjes die het dichtst bij de magneet te verstoren, en te vervangen door hetzelfde volume van de nieuwe PBST buffer.
5. Herhaal stap 6,1-6,4 voor duplo monsters en plaats deze monsters op een roterend wiel bij kamertemperatuur gedurende 16 uur aan DNA hybridisatie keer te onderzoeken.

7. TRPS Setup

1. Steek de stekker in het instrument in een computer-systeem met software op zijn plaats.
2. IJk de eerste stuk met behulp van een schuifmaat.
   1. Meet de afstand tussen de buitenzijde van twee parallelle bekken.
   2. Input in de software door het intikken van de rek in het veld 'stretch' in het tabblad 'Instrument Settings' en te klikken op 'kalibreren stretch' onder het tabblad.
3. Zijdelings past een polyurethaan nanogaatje membraan van de juiste maatvoering voor analyse op de kaken van de nanogaatje ID-nummer naar boven. Vervolgens strekken de kaken de rek die nodig is voor analyse met behulp vanstretch aanpassingshandvat aan de zijkant van het apparaat. Strek de kaken tussen de 43 en 48 mm.
   Opmerking: De exacte waarde van de rek bepaald langs aangelegde spanning zodat kalibratie deeltjes blokkades tenminste 0,3 nA groot. Het traject is al ingevoerd in de software in stap 7.2 en zal automatisch aan te passen als de kaken worden uitgerekt.
4. Plaats 80 ul van PBST buffer in de onderste vloeistof cel, onder de nanogaatje, zodat er geen luchtbellen aanwezig zijn die de meting kunnen beïnvloeden. Als er luchtbellen te zien, verwijderen en vervangen van de buffer.
5. Klik op de bovenste vloeistof cel op zijn plaats en plaats 40 pi buffer erin, weer zodat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Indien luchtbellen aanwezig in de bovenste vloeistof cel zijn, verwijder ze door het vervangen van de vloeistof.
6. Wanneer een reproduceerbare stroom basislijn is bereikt door het vervangen van de bovenste fluïdumcel met buffer, voeg 40 ul van het monster op de bovenste fluïdumcel en meet de pagina 'stkunst 'in het tabblad' Data Acquisition 'van de software het scherm.
   Opmerking: De data acquisitie is afgerond met een frequentie van 50 kHz met een blokkade magnitude ondergrens van 0,05 nA, hoewel dit kan worden veranderd met behulp van de software via het tabblad Analyse Data '(onder' Analyse Settings 'en' resistief Blokkades) .
7. Plaats een kooi van Faraday over de bovenkant van het fluïdum celsysteem elektrische ruis op de metingen te reduceren.
8. Gebruik een variabele drukmodule (VPM) een druk of vacuüm toegepast op de monsters.
   1. Voor het aanvragen van een externe druk sluit het pijpje in de bovenste vloeistof cel en draai de druk arm en vastklikken (afhankelijk van de vraag of een positieve druk (PRE) of een vacuüm (VAC) zal worden toegepast).
   2. Toepassen druk in een "cm" of "mm" schaalconstructie volgens de druktrap knop gelegen bovenop de VPM. Druk op de knop omlaag om druk uit te oefenen op de 'cm' schaal en trek hem omhoog to toe te passen druk op de 'mm' schaal.

8. Voorbereiding Monsters voor TRPS Analyse

1. Vortex monsters voor 30 sec en ultrasone trillingen gedurende 2 minuten bij 80 Watt vóór TRPS analyse.

9. Het kalibreren van de Nanopore voor Zeta Analyse

1. Na het plaatsen van 40 ui kalibratie deeltjes (1x10 ¹⁰ deeltjes / ml) in de bovenste vloeistof cel, compleet een TRPS meting (opstelling als in hoofdstuk 7) op 3 aangelegde spanningen. Verander de spanning door te klikken op de '+' en '-' knoppen op het voltage schaal op het tabblad 'Instrument Settings' op de software.
2. Controleer of de 3 spanningen terug achtergrond stromingen van ongeveer 140, 110 en 80 nA. Zorg ervoor dat op het middenspanning de kalibratie deeltjes produceren een gemiddelde blokkade magnitude van ten minste 0,3 nA.
3. Breng een druk zodat de gemiddelde maximale volle breedte de helft (FWHM) duur van de kalibratie deeltjes ten minste0,15 msec. Doe dit handmatig met de drukarm aan de variabele drukmodule. Select druk (PRE) of vacuüm (VAC) door het draaien van de arm tot het vastklikt in de gewenste positie en overeenkomstige toepassing volgende set-up instructies in stap 7.8.2. Zodra deze voorwaarden zijn bereikt, start de run door te klikken op 'start' van de software in het tabblad 'Data Acquisition'.
4. Voltooi de gerund door in het tabblad 'Data Acquisition' op 'stop' als ten minste 500 deeltjes zijn gemeten (zie 'Particle Count' aan de onderkant van de software het scherm tijdens de meting) en de run is 30 sec overschreden (zie ' Run Time 'ook naar de onderkant van het scherm).
5. Kalibreer het systeem door het invullen van een kalibratie run zoals beschreven elke keer een nieuw nanogaatje wordt geïntroduceerd of voor elke nieuwe dag van de analyse door het invullen stap 9,1-9,4.

10. Het runnen van een steekproef

1. Run de monsters bij de hoogste ofna hoogste spanning als de kalibratie monsters die een vergelijkbare (± 10 nA), indien verschillend, basislijn stroom.
   1. Zodra aan de basislijn stroom bereikt, vervangt de elektrolyt in de bovenste fluïdumcel met 40 pl monster. Wanneer een monster wordt ingebracht, wordt blokkades te zien op het signaal traceren. Start het monster gerund door te klikken op 'Start' in het tabblad 'Data Acquisition' en een minimum van 500 deeltjes op te nemen (check 'Particle Count' gelegen onder het signaal sporen) en zorgen voor de looptijd is een minimum van 30 sec (zie 'Run Time 'ook gelegen onder het signaal sporen).
   2. Om de meting te voltooien, klikt u op 'stop' in het 'Data Acquisition tab' en sla het bestand.
2. Om het bestand, het invoeren van de file informatie in de volgende indeling op te slaan; 'Onderzoek' is de map het bestand wordt opgeslagen in, 'Nanopore ID' is het serienummer van de porie wordt gebruikt, 'Part #' iis de aard van de poriën (dat wil zeggen, NP150 / NP200), 'Sample ID' is de naam van het monster, "Calibration of sample gegevens van of het een kalibratie of monster meting, 'verdunning' wordt gebruikt wanneer het monster werd verdund ( type 100 als het monster werd 100-voudig verdund), "Pressure is de uitgeoefende druk op het monster (in cm - zie paragraaf 7.8)," Elektrolyt ID "is de naam van de buffer het monster bereid in, en ' Notes 'zijn geen persoonlijke opmerkingen over het monster of lopen.
3. Tussen elk monster run, was het systeem door het plaatsen van 40 ul van PBST buffer in de bovenste vloeistof cel meerdere malen en het toepassen van verschillende drukken (meestal op -10, -5 cm (vacuüm), en 5 en 10 cm (positieve druk)) tot niet meer blokkade evenementen aanwezig, zodat er geen achtergebleven deeltjes blijven in het systeem waardoor geen kruisbesmetting tussen monsters. Run monsters in drievoud met deze wasstap voltooid tussen elke herhaling monster lopen als well als tussen de verschillende monsters.

Resultaten

Figuur 1. Schematische weergave van het proces van zuivering en een magnetische TRPS meting. A) Voorbeeld van magnetische zuivering van het monster te beginnen met een monster dat teveel, ongebonden vangprobe DNA. B) TRP meet bijvoorbeeld i) Deeltjes die door de nanogaatje en ii) Blockade event geproduceerd uit deeltjes tijdelijk occlusie ionen in de porie veroorzaak...

Discussie

De berekening van de zeta potentiaal gebruikt kalibratie gebaseerde methode gerelateerd werk door Arjmandi et al. ^21. De duur van de translocatie deeltjes zijn bij het doorkruisen een nanopore wordt gemeten als een functie van aangelegde spanning, met een gemiddelde elektrisch veld en deeltjessnelheden op het geheel van een regelmatige conische porie. De elektroforetische mobiliteit is de afgeleide van 1 / T (waarin T de duur blokkade) ten opzichte van spanning, vermenigvuldigd met het kwadraat...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fosfaat gebufferde Saline (PBS)	Sigma Aldrich, UK	P4417	1 tablet opgelost in 200 ml gedeïoniseerd water om bufferoplossing te maken.
Tween-20	Sigma Aldrich, UK	P1379	0,05% (v/v) in PBS-buffer als oppervlakteactieve stof
Carboxyl polystyreen nanodeeltjes	Bangs Laboratories, VS	CPC200	Nominale diameter van 220 nm, ruwe concentratie van 1 x 1012 deeltjes/ml, specifieke oppervlaktelading van 86 µeq/g (gelijkwaardig aan een oppervlakteladingsdichtheid van 3,2 x 1019 C/nm2.
Streptavidine gecoate nanodeeltjes	Ademtech, Frankrijk	3121	Batch had een bindingscapaciteit van 4.352 pmol/mg (188 nM theoretische DNA-bindingscapaciteit) bij een ruwe concentratie van 1,1 x 1011 deeltjes/ml.
Biotinyleerde oligonucleotiden	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Leverancier specificatie: Reverse Phase 1-zuivering (0,05 schaal); Biotine modificatie aan 3' einde; Gelyofiliseerd poeder gereconstitueerd tot 100 µM met behulp van gedeïoniseerd water, en verdund zoals vereist. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC GCGTGGC[Btn]3'
Standaard olignonucleotiden	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Leverancier specificatie: Reverse Phase 1-zuivering (0,05 schaal); Gelyofiliseerd poeder gereconstitueerd tot 100 µM met behulp van gedeïoniseerd water, en verdund zoals vereist. Sequences van DNA-doelen: Volledig complementair - 5'GCCACGCGTAGTGA GGTTTAACCAT3', Midden binding - 5'GTAGTGAGGT3', Eind binding - 5'GTTTAACCAT3', Gedeeltelijk complementair overhangend - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'.
Izon qNano	Izon Science, NZ		Inherente druk op het systeem van 47 Pa
Izon Variabele Drukmodule (VPM)	Izon Science, NZ		Elke 'cm' druk is gelijk aan ongeveer 100 Pa.
Polyurethaan nanopore membranen	Izon Science, NZ	NP150	Analyt groottebereik 60-480 nm, poriediameter berekend op 799 nm bij een rek van 45 mm.
Magrack 6	GE Healthcare, UK	28-9489-64
Sonische bad	Fisher Scientific, UK	10692353	80 Watt
Vortexer	IKA, Duitsland	0003365000
Roterende wiel	Labnet International, VS	H5500-230 V