Efficiënte Sporulatie van Saccharomyces cerevisiae In een 96 Multiwell Format

Samenvatting

Hier wordt sporulatie van Saccharomyces cerevisiae uitgevoerd in een 96 multiwell formaat.

Samenvatting

Tijdens periodes van nutritionele stress ondergaat Saccharomyces cerevisiae gametogenese, bekend als sporulatie. Diploïde gistcellen die worden uitgehongerd voor stikstof en koolstof, zullen het sporulatieproces initiëren. Het proces van sporulatie omvat meiose gevolgd door sporevorming, waarbij de haploïde kernen worden verpakt in omgevingsbestendige sporen. We hebben methoden ontwikkeld voor de efficiënte sporulatie van knopsporen in 96 multiwell platen, om de doorvoer van het screenen van gistcellen voor sporulatiefenotypen te verhogen. Deze methoden zijn compatibel met het screenen van gist met plasmiden die nutritionele selectie vereisen, wanneer geschikte minimale media worden gebruikt, of met het screenen van gist met genomische aanpassingen, wanneer een rijk presporulatieregime wordt gebruikt. We vinden dat voor deze methode beluchting tijdens sporulatie cruciaal is voor sporevorming, en we hebben technieken ontwikkeld om voldoende beluchting te garanderen die compatibel zijn met het 96 multiwell platenformaat. Hoewel deze methoden niet het typische ~80% niveau van sporulatie bereiken dat kan worden bereikt in grootschalige flesgebaseerde experimenten, zullen deze methoden betrouwbaar ongeveer 50-60% sporulatieniveau bereiken in kleine volume multiwell platen.

Inleiding

Sporulatie in de gist is bestudeerd om inzicht in vele aspecten van de biologie, met inbegrip van de controle van chromosoomsegregatie bieden tijdens meiose ^1, mechanismen voor genetische recombinatie ^2, de controle van de ontwikkeling van cell signaling ^3, nutritionele regeling van ontwikkeling ^4, de transcriptionele regulering van de ontwikkeling ^5, en het onderzoek van de spore vorming ^6. Spoorvorming omvat een nieuwe celdeling gebeurtenis waarbij de vorming van nieuwe membraancompartimenten binnen de moedercel gevolgd door het afzetten van een beschermende spore wand ^6. Deze studies die sporenvormende cellen onderzocht vaak gebruik maken van het snel sporulerende giststam SK1, die het proces van sporulatie in ongeveer 24 uur op een relatief efficiënte wijze ^7,8 kan ondergaan. Hoewel optimalisering van sporulatie voorwaarden voor gist zijn beschreven ^9-13, die experiments onderzocht sporulatie op vaste media of in grotere schaal vloeibare culturen waar sporulatie met behulp van cultuur buisjes of flesjes wordt uitgevoerd.

Hier beschrijven we een werkwijze voor sporenvormende gist in een 96 multi-putjesplaat formaat. We zien dat deze werkwijze beluchting is kritisch voor synchrone en efficiënt sporulatie en hebben technieken ontwikkeld om voldoende sporulatie garanderen een klein volume multiwell format. Sporenvormende in een 96 multi-putjesplaat formaat maakt cellen worden gescreend met behulp van high-throughput technieken en reagentia geoptimaliseerd voor een multiwell plaat formaat, zoals screening voor hoog kopie onderdrukkers met een betegelde library ^14-16.

Protocol

1. Voorbereidingen voor Sporulatie

Let op:. De in dit protocol beschreven media worden gemaakt met behulp van standaard recepten en methodes ^13,17 Tabel 1 geeft de formulering voor 1 liter van de verschillende media gebruikt in dit protocol.

	Bacto Peptone	Gist extract	Bacto Agar	dextrose	kaliumacetaat	Glycerol	DDH 2 O
YPG platen	20 g	10 g	20 g	-	-	30 ml	970 ml
YPD platen	20 g	10 g	20 g	20 g	-	-	1000 ml
YPD vloeibaar	20 g	10 g	-	20 g	-	-	1000 ml
YPA vloeistof	20 g	10 g	-	-	20 g	-	1000 ml
sporulatie media	-	-	-	-	10 g	-	1000 ml

Tabel 1:. Media formuleringen Bedragen worden gegeven voor 1 L van media. Bijzonderheden over mediaingrediënten zijn te vinden in de Materials tabel.

1. Als alle sporenvormende cellen hetzelfde genotype zullen zijn, volgt u deze procedure:
   1. Thaw giststam om gebruikt te worden op een YPG (YPGlycerol) plaat. Gist groeien gedurende 12-16 uur bij 30 ° C. Belangrijk is, zijn SK1 cellen ook klaar om sporuleren, dus SK1 stammen moet niet te lang op YPG platen worden gelaten, of ze kunnen sporuleren op het bord.
      Opmerking: Een vers ontdooide stam gekweekt op YPG voorkeur, als het gebruik van glycerol als een koolstofbron vereist oxidatieve fosforylering en derhalve selecteert op cellen die functionele mitochondriale DNA hebben. SK1 cellen hebben de neiging om functionele mitochondriaal DNA verliezen en petites. Functionele mitochondriaal DNA nodig voor sporulatie.
   2. Streak gist uit de YPG plaat op een YPD (YPDextrose) plaat voor enkele kolonies. Grow gist op YPD plaat 24-28 uur bij 30 ° C.
   3. Na ongeveer 36-48 uur groeien op YPD vaste media, start een 25 ml YPD kweek met een enkele kolonievan de YPD plaat. Groei deze cultuur tot cellen zijn over OD ₆₀₀ = 4,0-7,0. Voer deze stap bij 30 ° C gedurende de nacht in een schuddend incubator, schudden bij 220 rpm.
   4. Van de YPD cultuur, gebruik van een geschikt aantal cellen voor 1000 ml YPA (YPAcetate) cultuur start die OD ₆₀₀ = 0,1 per 96 putjesplaat behoefte in hoofdstuk 2. Kweek gist in een 30 ° C incubator schudden (schudden bij 220 rpm) totdat de kweek OD ₆₀₀ tussen 1,3 tot 1,5.
      Noot: Inoculeer 100 ml YPA kweek per 96 multi-putjesplaat te screenen in hoofdstuk 2. Als bijvoorbeeld screening vier 96 putjes en wordt 400 ml YPA kweek nodig. Te beginnen met 10% extra volume in het YPA cultuur is noodzakelijk om te beschermen tegen door verdamping volume verlies. Doorgaans duurt het tussen de 12-16 uur voor de cellen naar de juiste OD ₆₀₀ te bereiken; de hoeveelheid kan variëren afhankelijk van het genotype van de giststam. YPA is de presporulation media. Pregrowthacetaat helpt induceren expressie van genen (zoals IME1) nodig voor een efficiënte en synchrone sporulatie ^6.
   5. Spin op 1.800 xg in een tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten aan cellen gekweekt in YPA pellet. Was de cellen 1x met 0,5 volume van steriel geautoclaveerd gedemineraliseerd water. Spin weer, en gooi te wassen. Resuspendeer cellen in 1x volume sporulatie media. Ga verder naar deel 2.
2. Bij gebruik van cellen voor sporulatie die verschillende genotypen, (dwz, getransformeerd met verschillende plasmiden of met verschillende mutaties, typisch verkregen en opgeslagen als bevroren voorraden), array cellen van de verschillende genotypen in een 96 multiwell format. Daarna volgt te werk:
   1. Gebruik een steriele 96 tand Frogger om cellen te brengen van ontdooide bevroren voorraden in 96 multi-putjesplaat (s) op YPG vaste media. Grow gist 's nachts bij 30 ° C.
   2. Met behulp van een steriele 96 riek Frogger, transfer cellen uit YPG vaste media op YPD vaste media of selectievevaste media (bijv synthetisch minimaal medium zonder aminozuren, als de cellen bevatten plasmiden die selectie vereist). Gist groeien bij 30 ° C totdat kolonies worden gevormd voor elke stam, gewoonlijk 1 dag YPD en 2 dagen als selectief medium nodig is.
   3. Aliquot 1,2 ml YPD vloeibare media of selectieve vloeibare media in elk putje van een 96 diepe 2 ml multiwell plaat. Transfer cellen uit vaste media in vloeibare media met een frogger, bedekken met een plastic deksel op zijn plaats gehouden door tape en gedurende de nacht groeien in 30 ° C schudder, schudden bij 220 rpm.
      Opmerking: Om besmetting te minimaliseren, afdekplaten met behulp van de plastic deksels uit een rechthoekige petri plaat. Houd deksels op zijn plaats met behulp van een stukje tape, zodat de luchtcirculatie minimaal wordt beperkt.
   4. Centrifugeer platen bij 1800 g gedurende 5 minuten, met een swinging bucket centrifuge een adapter 96 putjesplaten tegemoet. Giet media uit cellen; voeg 500 ul YPA aan elk putje en resuspendeer celpellets in YPA. dekselmet kunststof deksel op zijn plaats gehouden door tape.
   5. Kweek cellen gedurende 15 uur bij 30 ° C in een schudincubator, schudden bij 220 rpm. Ga verder naar deel 2.

2. sporenvormende cellen in een 96 Multiwell Format

1. Voeg één 3 mm steriele vaste glasparels of een steriele 5 mm x 2 mm magnetische roerstaaf in elk putje van een plaat met 96 putjes met 1,3 ml. (Zie Representatieve resultaten hieronder voor een discussie over de vraag of een kraal of een roerstaafje gebruiken.)
2. Als alle cellen worden gescreend zijn van hetzelfde genotype, naar 2.2.1. Als cellen te screenen van verschillende genotypen, naar 2.2.2.
   1. Neem cellen uit stap 1.1.5 en hoeveelheid 500 pl cellen plus medium in elk putje van de multi-putjesplaat 96. Dek af met plastic deksel op zijn plaats gehouden door tape. Ga verder met 2.3.
   2. Spin cellen die in YPA van 1.2.4 bij 1800 g gedurende 5 minuten, met een swinging bucket centrifuge een adapter 96 putjesplaten tegemoet. giet vanf media uit cellen. Voeg 500 ul van sporulatie medium aan elk putje en resuspendeer celpellets in de sporulatie media. Dek af met plastic deksel op zijn plaats gehouden door tape. Ga verder met 2.3.
3. Bij gebruik van een glasparel, plaats monsters in een schudincubator bij 30 ° C en schudden bij 220 rpm gedurende sporulatie. Bij gebruik van een magnetische roerstaaf, plaats monsters op een roer plaat binnenkant van een 30 ° C incubator voor sporulatie.
   Opmerking: De exacte roersnelheid voor magnetische roerstaven is niet belangrijk, zolang alle bars energetisch bewegen en de kweek belucht.
4. Om progressie te monitoren door middel van sporulatie, monsters van de sporulerende cultuur te trekken voor visualisatie, Voeg 6 ul van cellen uit de sporulerende culturen tot 24 ul van sporulatie media in een 96 well dekglaasje plaat (1: 5 verdunning). Laat cellen om zich te vestigen gedurende 5 minuten voordat de behandeling van cellen met behulp van een omgekeerde microscoop.
   Opmerking: In wild-type SK1 cellen, zal compact rijpe sporen te vormen door 36 uur na overdracht naar sporulatie media. Doorlopen van sporulatie kan worden gevolgd door microscopie met fluorescerende merkers, zoals een nucleaire marker (bijv HTB2-mCherry ¹⁸⁾ aan de meiotische deling of prospore membraan merker te onderzoeken (dat wil zeggen, G20 ¹⁹⁾ om sporen morfogenese bestuderen. Als alternatief kan de vorming van refractiele sporen zichtbaar via DIC Nomarski microscopie vanaf ongeveer 12 uur na overdracht naar sporulatie medium.

Resultaten

Dit protocol te evalueren werden sporulatie rendementen verkregen van sporenvormende cellen in platen met meerdere putjes (zoals hierboven beschreven) vergeleken met cellen gesporuleerde gebruik van grotere volumes in flessen (tabel 2). Het gebruik van multi-putjesplaten heeft de hoge efficiëntie gezien wanneer sporulerend in flessen, waarbij ~ 80% rendement routinematig blijkt niet bereiken. Sporenvormende in multiwell platen met goede beluchting (door glasparels ...

Discussie

Hier presenteren we een protocol voor sporulerend SK1 gist in een 96 multiwell format. Beluchting is belangrijk voor een efficiënte sporulatie, waarbij het gebruik van hetzij een roerstaaf of een glasparel in elk putje vereist. Wanneer cellen worden gesporuleerde in een 96 multiwell plaat in een incubator schudden zonder begeleiding van een kraal of een roerstaafje, hoeft cellen niet efficiënt sporuleren. Slechts een kleine toename van sporulatie efficiëntie wordt waargenomen wanneer de cellen gesporuleerde zonder dat e...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Nunc 1.3 ml DeepWell Plates	ThermoScientific	260251	Gebruikt voor sporulatie
Nunc 2.0 ml DeepWell plates	ThermoScientific	278743	Gebruikt voor presporulatie groei, stap 1.2.3
3 mm glazen kraal	Fisher	11-312A	Gebruikt voor sporulatie
5 mm x 2 mm roerbaar, pak van 12	Fisher	14-511-82	Gebruikt voor sporulatie
96 well frogger	V&P Scientific	VP407	nodig voor stap 1.2
bibliotheekkopieerapparaat	V&P Scientific	VP381	nodig voor stap 1.2; te gebruiken met de frogger
rechthoekige Petri-schaal	ThermoScientific	264728	nodig voor stap 1.2
Bacto Pepton	BD	211677	nodig voor media
Gist Extract	BD	212750	nodig voor media
Bacto Agar	BD	212750	nodig voor media
Dextrose	Fisher	D16-3	nodig voor media
Kalium Acetaat	Fisher	P171-500	nodig voor media
Glycerol	Fisher	G33-500	nodig voor media
Zwarte 96 well glazen bodemplaat	MatTek	PBK96G-1.5.5-F	nodig voor stap 2.4