Methodenartikel

Een

10.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54592

⸱

8 december 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University Hospital Münster, 2Institute of Biochemistry, University of Münster

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een in vitro muismodel van de bloed-hersenbarrière dat gebruik maakt van impedantiecelspectroscopie, met een focus op de gevolgen voor de integriteit en permeabiliteit van endotheelcellen na interactie met geactiveerde T-cellen.

Samenvatting

De afbraak van de bloed-hersenbarrière (BBB) is een cruciale stap in de ontwikkeling van auto-immuunziekten zoals multiple sclerose (MS) en het diermodel experimentele auto-immuunencefalomyelitis (EAE). Dit proces wordt gekenmerkt door de transmigratie van geactiveerde T-cellen over hersendeelcelcellen (ECs), de belangrijkste bestanddelen van de BBB. De gevolgen voor de hersendeelcelfunctie na interactie met dergelijke T-cellen zijn echter grotendeels onbekend. Hier beschrijven we een test die de evaluatie mogelijk maakt van de functie van primaire muis hersendeelcelcellen uit microvaten (MBMEC) en de integriteit van de barrière tijdens de interactie met T-cellen in de loop van de tijd. De test maakt gebruik van impedantiecelspectroscopie, een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de integriteit en permeabiliteit van EC-monolagen, door het meten van veranderingen in transendotheel elektrische weerstand (TEER) en cel laagcapaciteit (Ccl). In direct contact met EC's zijn gestimuleerde maar niet naïeve T-cellen in staat om EC-monolaagdisfunctie te induceren, zoals gevisualiseerd door een afname in TEER en een toename in Ccl. De test registreert veranderingen in de integriteit van de EC-monolaag op een continue en geautomatiseerde manier. Het is gevoelig genoeg om onderscheid te maken tussen verschillende sterktes van stimuli en niveaus van T-celactivatie en het maakt de onderzoeking mogelijk van de gevolgen van een gerichte modulatie van T-cel-EC-interactie met behulp van een breed scala aan stoffen zoals antilichamen, farmacologische reagentia en cytokinen. De techniek kan ook worden gebruikt als kwaliteitscontrole voor EC-integriteit in in vitro T-cel transmigratie tests. Deze toepassingen maken het een veelzijdig hulpmiddel voor het bestuderen van BBB-eigenschappen onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden.

Inleiding

De bloed-hersenbarrière scheidt de systemische circulatie van het centrale zenuwstelsel (CNS) 1-3. Het voorziet in een fysieke barrière die het vrije verkeer van cellen en de verspreiding van in water oplosbare moleculen remt en beschermt de hersenen tegen pathogenen en potentieel schadelijke stoffen. Naast de barrièrefunctie de BBB maakt de overdracht van zuurstof en voedingsstoffen naar de hersenen parenchym waardoor de correcte werking van het neuronaal weefsel waarborgt. Functionele eigenschappen van de BBB wordt sterk gereguleerd door zijn cellulaire en acellulaire componenten, met zeer gespecialiseerde EC dat is haar belangrijkste structurele element. EC van de BBB wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van tight junction (TJ) complexen, het gebrek aan fenestrations, pinocytose extreem lage activiteit en permanent actieve transportmechanismen. Andere componenten van de BBB de EC basaal membraan, pericytes het inbedden van het endotheel, astrocytaire end voeten en = bijbehorende parenchymal basaalmembraan ook bijdragen aan de ontwikkeling, instandhouding en functie van de BBB 2,4 - 6 en samen met neuronen en microglia, vormen de neurovasculaire eenheid (NVU) waardoor de correcte werking van het CZS 7 maakt - 9.

In verschillende neurologische ziekten zoals neurodegeneratieve, ontstekings- of infectieziekten, is de functie van de BBB gecompromitteerde 2,5,10. Ontregeling van TJ complexen en moleculaire transportmechanismen leidt tot BBB permeabiliteit extravasatie van leukocyten, ontsteking en neuronale schade toe. Om BBB eigenschappen studeren onder dergelijke pathofysiologische omstandigheden, hebben verschillende in vitro BBB modellen vastgesteld 9,11,12. Samen hebben ze waardevolle inzichten in de veranderingen van de barrière integriteit, doorlaatbaarheid evenals transport mechanismen. Deze modellen maken gebruik endotheliale cellen van mens, muis, rat, varken of bschapen afkomst 13-18; primaire endotheliale cellen of cellijnen worden gekweekt hetzij als monocultuur of samen met pericyten en / of astrocyten om nauwer bootsen de BBB in vivo 19-25. De laatste jaren is het meten van transendotheliale elektrische weerstand (TEER) wordt een algemeen aanvaarde instrument om endotheliale barrière-eigenschappen 26,27 beoordelen.

TEER weerspiegelt de impedantie op de ionenflux over de cel monolaag en de afname verschaft een gevoelige maatstaf van gecompromitteerde endotheliale barrière integriteit en derhalve verhoogde permeabiliteit. Diverse TEER meetsystemen zijn ontwikkeld, waaronder epitheliale Voltohmmeter (EVOM), elektrische cel-substraat Impedantie Sensing (ECIS), en real-time cell analyse 15,28 - 30. TEER weerspiegelt de weerstand tegen ion flux tussen aangrenzende EC (paracellulaire route) en is recht evenredig met debarrière integriteit. In impedantie spectroscopie 27,31, is complex totale impedantie (Z) gemeten, die meer informatie over de barrière integriteit door het meten van Ccl biedt. Ccl betreft de capacitieve stroom door het celmembraan (transcellulaire route): de cellaag fungeert als een condensator in het equivalente elektrische circuit, het scheiden van de lasten aan beide zijden van het membraan en is omgekeerd evenredig met de barrière integriteit. Wanneer geteeld op doorlatende inserts, EC hechten, vermenigvuldigen en verspreid over het microporeuze membraan. Dit weerstaat de achtergrond capacitieve stroom van het inzetstuk (die zelf werkt als een condensator) en leidt tot een afname van de capaciteit tot aan de minimale niveau bereikt. Dit wordt gevolgd door de instelling van TJ complexen die afdichting van de ruimte tussen aangrenzende EC. Dit beperkt de ion flux door de paracellulaire route en TEER verhoogt tot het zijn plateau bereikt. Onder ontstekingstoestanden, maar de endothelial barrière in het gedrang komt: TEER afneemt als TJ complexen krijgen verstoord en Ccl toeneemt naarmate de capacitieve component van het inzetstuk weer stijgt.

Onze TEER meting maakt gebruik van de geautomatiseerde celbewaking 32 systeem: het volgt het principe van impedantie spectroscopie en breidt haar eerdere aanvragen. Hier beschrijven we een in vitro model BBB dat de studie van de barrière-eigenschappen, zoals de interactie van hersenen endotheel met immuuncellen mogelijk maakt; met name geactiveerde T-cellen. Zulke pathofysiologische aandoeningen zijn waargenomen bij auto-immuunziekten van het CZS, zoals multiple sclerose en diermodel experimentele autoimmune encefalomyelitis 33-37. Hier, een cruciale stap is de transmigratie van encefalitogene, myeline-specifieke T-cellen over de BBB. Dit wordt gevolgd door reactivering in de perivasculaire ruimte en het in het hersenparenchym, waar ze rekruteren andere immuuncellen en melijke ontsteking en daaropvolgende demyelinatie 1,35,38. Echter, de moleculaire mechanismen van de interactie tussen deze T-cellen en endotheelcellen, de hoofdbestanddelen van de BBB, zijn niet goed begrepen. Ons protocol is bedoeld om deze leemte op te vullen en geeft nieuwe inzichten in de gevolgen op endotheelcellen (dat wil zeggen, barrière integriteit en permeabiliteit) op hun directe contact en de complexe interactie met geactiveerde T-cellen.

De hier beschreven protocol maakt gebruik van primaire muizenhersenen microvasculaire endotheliale cellen, gekweekt als een monolaag op permeabele inserts met microporeuze membranen. Endotheelcellen samen gekweekt met CD4 + T-cellen, die vooraf worden geactiveerd hetzij polyklonaal of een antigeen-specifieke wijze. Co-cultuur van MBMECs met pre-geactiveerde, maar niet naïeve T-cellen induceert een daling van TEER en een toename van Ccl die een kwantitatieve meting van de MBMEC dysfunctie en barrièrebeschadiging verschaft. de techniekis non-invasief: het gebruikt ingebouwde plaats van eetstokje elektroden, die belangrijke verstoring van de EC monolaag te voorkomen; het kan worden gebruikt om de barrièrefunctie te controleren zonder het gebruik van celmarkers. Het maakt continue metingen op een geautomatiseerde manier en maakt een onafhankelijke beoordeling van de twee barrière parameters (TEER en Ccl) tegelijkertijd in de tijd. De werkwijze is gevoelig genoeg om onderscheid te maken tussen verschillende T cel activering en werking van dergelijke T-cellen op EC.

Het kan worden gebruikt in een breed scala aan functionele testen: verschillende cytokinen en / of chemokinen betrokken bij ontstekingsprocessen kunnen de co-cultuur van MBMECs en T-cellen worden toegevoegd; blokkerende antilichamen tegen celadhesie moleculen aan beide EG of T-cel zijde kan worden gebruikt; en inhibitoren van T-cel activatie merkers of hun cytolytische eigenschappen kunnen tijdens de T-cel priming of de co-kweek met EC's worden toegevoegd. De test is ook bruikbaar voor T-cel transmigratieassays, omdat het als een kwaliteitscontrole van de integriteit MBMEC monolaag voorafgaande aan de toevoeging van T-cellen kunnen dienen. Dit alles maakt deze methode een veelzijdig en betrouwbaar instrument om de BBB in vitro onderzoek, met een focus op het effect van geactiveerde T-cellen op monolaag integriteit EC. Dit is van bijzonder belang voor het begrijpen van de mechanismen van de BBB verstoring in de pathogenese van auto-immuunziekten, zoals MS en EAE diermodel, waarbij autoreactieve, encefalitogene T-cellen steek de BBB en ontsteking en neuronale schade.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Voor alle experimenten werden muizen gefokt en onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden bij de centrale dierenverblijf van de Universiteit van Munster gehandhaafd volgens de Duitse richtlijnen voor dierverzorging. Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het dier experimentele ethische commissie en door de plaatselijke autoriteiten van Noord-Rijnland-Westfalen, Duitsland (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217) goedgekeurd.

1. MBMEC Isolatie en Cultuur

LET OP: Isoleer MBMECs zoals eerder in detail 14 beschreven met de volgende wijzigingen:

  1. Sacrifice 20 volwassen C57BL / 6 muizen (6-8 weken oud) door CO 2 inademing en bevestigen hun dood door het vaststellen van hart- en ademstilstand.
  2. Spoel de muis met 70% ethanol en onthoofden met behulp van een schaar; Verwijder de hoofdhuid met behulp van pincet en een schaar. Maak insnijdingen aan de linker- en rechterzijde van de schedel, vanaf het foramen magnum. Til de schedel van zijn staart kant en take van de hersenen met een tang.
  3. Onder een laminaire stroming kap Gebruik steriele tang om de hersenen te plaatsen in een petrischaal en verwijder de hersenstam, het cerebellum en thalamus, die slechts de cortex.
    Opmerking: Het gebruik van een microscoop is niet nodig voor een van deze stappen.
  4. Plaats de cortex op een stuk van steriele Western blotting papier en rol het voorzichtig met een pincet totdat hersenvliezen zijn niet meer zichtbaar.
  5. Na mechanische en enzymatische digestie (volgens het protocol 14), verzamelen endotheelcellen van de dichtheidsgradiënt met een lange, steriele naald en een 5 ml plunjer. Endotheelcellen verschijnen als een duistere laag boven de rode ring met erytrocyten. Overdracht 20-25 ml van deze laag in een nieuwe 50 ml centrifugebuis; bijvullen van de buis met DMEM.
  6. Na twee wassen 14, resuspendeer de cellen in 6 ml MBMEC medium dat Puromycine (4 ug / ml) en zaden ze op zes beklede putjes van een 24-puts plaat; laat ze in een tissueincubator bij 37 ° C en 5% CO 2 (hierna broedplaats vanaf hier) gedurende drie dagen.
    LET OP: Voor meer informatie over MBMEC coating oplossing, zie materialen tabel.
  7. Verander het medium door toevoeging van 1 ml aan elk putje van vers medium zonder MBMEC Puromycine; zet de plaat weer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende twee dagen.

2. Oogsten MBMECs

  1. Op dag vijf na MBMEC isolatie voorbekleding doorlatende inzetstukken met MBMEC bekledingsoplossing: voeg 80 ul oplossing per wisselplaat en laat ze bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 3 uur.
  2. pipet voorzichtig uit de coating-oplossing en laat de inserts lucht drogen gedurende 30 min. Voeg 2 ml van kamertemperatuur (KT) PBS aan elk putje van de plaat met behulp MBMECs aan het medium was; herhaalt u deze stap. Voeg 0,05% trypsine-EDTA (300 gl per putje) en laat de plaat in de incubator gedurende 5-10 minuten.
  3. Voeg 2 ml MBMEC medium aan elk putje stoppentrypsine. Breng de verzamelde cellen naar een 15 ml centrifugebuis en centrifugeer ze bij 700 xg gedurende 8 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml medium zonder MBMEC Puromycine.
  4. Tel de cellen; meng 10 pl celsuspensie met 90 pi 0,04% trypan blauw (10x verdunning van cellen). Pipet 10 ul van deze mix tussen het glazen deksel en de cel telkamer (hemocytometer). Aantal Trypan Blue-vrije cellen in alle vier de kwadranten van de kamer (N) en het gemiddelde aantal getelde cellen (N ') te bepalen als volgt: N = N / 4.
  5. Bereken de celconcentratie (in 10 6 cellen / ml) met de volgende formule: C = N 'x 10 x 10 4, waarbij 4 10 wordt gegeven door de afmetingen van de hemocytometer en 10 is de verdunningsfactor stap 2,4.
  6. Zaad 2 x 10 4 cellen in een volume van 260 gl per insert. Voeg 810 ul van MBMEC medium naar het onderste compartiment van elk putje. Plaats de plaat met inzetstukken in de couveuse tot klaar om verder te gaan met deel 4.
    OPMERKING: De volumes van de bovenste en onderste compartiment insert-specifieke en werken niet voor alle 24-well formaat.

3. CD4 + T Cell Isolatie en stimulatie

  1. CD4 + T Cell Isolation
    1. Offer een volwassen muis (6-8 weken oud) door CO 2 inademing en bevestig de dood door het vaststellen van hart- en ademstilstand.
    2. Plaats de muis op zijn rug op een schone dissectie board en spoel het met 70% ethanol; Gebruik steriele schaar en een tang om het buikvlies te openen en verwijder de milt en lymfeklieren (lies, oksel, arm en baarmoederhalskanker); Breng tenslotte het weefsel in een 15 ml centrifugebuis met 5 ml PBS op ijs.
    3. Onder de laminaire stroming kap, de overdracht van de weefsel door decanteren PBS met het weefsel in een 50 ml centrifugebuis met een 70 micrometer cel zeef op de top; homogeniserenhet weefsel door te drukken met 1 ml plunjer door de zeef.
    4. Voeg 30 ml FACS buffer en centrifugeer in bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml van FACS-buffer. Filtreer de suspensie door een 40 um cel zeef, voeg 20 nog ml FACS-buffer aan de buis.
    5. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 500 ui FACS-buffer.
    6. Voeg 20 ul van muis CD4 magnetische microkralen, meng en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Voeg 25 ml FACS buffer en centrifugeer in bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    7. Ondertussen plaats een LS scheidingskolom in de magneet en spoel met 3 ml van FACS-buffer. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 3 ml FACS-buffer.
    8. cellen toevoegen aan de kolom. Was de kolom met 3 ml FACS buffer driemaal. Verwijder de kolom uit de magneet en plaats het op een nieuwe 15 ml Centrifugation buis. Voeg 5 ml FACS-buffer, spoel de gemerkte cellen met de kolom plunjer en Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 min 4 ° C.
    9. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 3 ml T-celmedium. Tel de cellen zoals is beschreven in 2,4 en zaden 1 x 10 5 cellen in 100 pl medium per well.
  2. CD4 + T cel stimulatie
    1. Polyklonale CD4 + T-cel stimulatie
      1. Voorbekleding een ronde bodem 96-well plaat met gezuiverd anti-muis CD3 antilichaam (kloon 145-2C11) in PBS, op een gewenste eindconcentratie. Bijvoorbeeld, een pre-coat volledige plaat met α-CD3 bij 1 ug / ml meng 10 pl van het antilichaam (stock concentratie = 0,5 mg / ml) met 5 ml PBS, vortex en voeg 50 ul van het mengsel tot elk putje met een multichannel pipet.
      2. Laat de plaat in de incubator gedurende 3 uur. Na isoleren van de T-cellen, was de pre-beklede plaat tweemaal met PBS. Add gezuiverd anti-CD28-antilichaam (kloon37,51) van geïsoleerde T-cellen met een gewenste eindconcentratie (bijvoorbeeld bij 1 ug / ml); goed mengen. Zaad de T-cellen en laat ze in de incubator gedurende 2-3 dagen.
    2. Antigeenspecifieke CD4 + T-cel stimulatie met dendritische cellen (DCs)
      LET OP: Als DCs worden gebruikt als antigeen presenterende cellen (APC's), volg het protocol voor de T-cel isolatie, met deze uitzonderingen:
      1. Voordat het homogeniseren van de milt, injecteren met 1 ml collagenase type IA in PBS bij 0,5 mg / ml en overbrengen naar een 15 ml centrifugebuis.
      2. Incubeer in het waterbad bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Na wassen met PBS, resuspendeer de pellet in FACS buffer en voeg 20 ul van muis CD11c magnetische microkralen plaats van CD4 microkralen.
      3. Gebruik een scheidingskolom MS en de passende hoeveelheden: Spoel de kolom met 1 ml FACS buffer; resuspendeer cellen in 1 ml FACS buffer en spoel de kolom met 1 ml FACS buffer driemaal.
      4. Advertentied antigeen keuze naar DCs (bijvoorbeeld myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) aa 35-55 bij 20 ug / ml), mengen en zaad 5 x 10 4 cellen in 100 gl T celkweekmedium per 96-round-bottom goed.
      5. Voeg 1 x 10 5 T-cellen in 100 gl T celkweekmedium per 96-rondbodem putjes aan het einde, zoals beschreven in het protocol voor T celisolatie.
    3. Antigeenspecifieke CD4 + T-cel stimulatie met B-cellen
      LET OP: Als B-cellen worden gebruikt als APC's, volgt het protocol voor T-cel isolatie, met deze uitzonderingen:
      1. Gebruik milt van transgene muizen waarvan B-cellen zijn antigeenspecifieke (bijv IgH MOG (Th) muizen, waarvan de B-cellen herkennen specifiek MOG 35-55).
      2. Gebruik antigenspecifieke T-cellen (bijvoorbeeld van TCR MOG (2D2) muizen). Voeg 20 ul van muis CD19 magnetische microkralen plaats van CD4 microkralen.
      3. Voeg het antigen van keuze om de B cells (bijvoorbeeld MOG 35-55 bij 20 ug / ml), mengen en zaad 5 x 10 4 cellen in 100 gl kweekmedium B-cel per 96-round-bottom putjes.
      4. Voeg 1 x 10 5 T-cellen in 100 gl T celkweekmedium per 96-rondbodem putjes, zoals beschreven in het protocol voor T celisolatie.

4. Opstellen en uitvoeren TEER Measurement

  1. Plaats de 24-well module van de TEER instrument onder de laminaire stroming kap. Verwijder de deksels en plaats wisselplaten met MBMECs in het instrument met behulp van een tang.
  2. Pipetteer 810 ul vers medium aan het onderste compartiment van de module putten voorzichtig toevoegen tussen het inzetstuk en de wand van de module ook.
  3. Sluit de deksels en zet het instrument in de incubator. Sluit het instrument op zijn computer; zet het instrument controller en de software opent.
  4. Selecteer 'nieuwe meting' in het pop-up venster. Check 'Toon TEER' en 'Toon Ccl' vakken; Druk vervolgens op 'start'. Na het voltooien van de eerste meting, selecteer 'check alle putjes' in het tabblad 'resultaten' om alle TEER en Ccl waarden zien.
  5. Sla het bestand op: Bestand> Opslaan als> 'de naam van het bestand'.
    LET OP: Als TEER en Ccl continu worden gemeten op een geautomatiseerde manier, hun waarden te volgen over een periode van drie tot vijf dagen. Waarbij het medium is niet nodig, tenzij cellevensvatbaarheid niet optimaal zijn, zoals gevisualiseerd door een gebrek aan toename TEER.
  6. Kies het tijdstip om samen cultuur MBMECs met T-cellen wanneer Ccl is stabiel en lager dan 1 uF / cm 2 en TEER heeft zijn maximum bereikt.
  7. Inspecteer absolute TEER en Ccl waarden zijn exclusief de putten waarin MBMECs niet genoeg samenvloeiende monolagen hebben ontwikkeld door het vinkje dergelijke putten.
  8. Groep de rest van de putten: klik met de rechtermuisknop op een goed en selecteer 'goed toe te voegen aan de nieuwe gemiddelde goed'. Name in het pop-up venster; Doe hetzelfde voor alle afzonderlijke putjes worden gegroepeerd.
  9. Controleer alle gemiddelde putten om te bevestigen dat ze allemaal dezelfde oorspronkelijke voorwaarden voor de co-cultuur. Als sommige hebben significant verschillende absolute waarden TEER TEER of hellingen, of de standaard fouten zijn te groot, opnieuw de groepering.
    LET OP: De optimale combinatie van waterputten biedt minimale variatie in TEER waarden, zowel binnen als tussen de experimentele groepen.
  10. In het tabblad 'experiment', drukt u op 'pauze', de stekker uit het instrument en neem het uit de incubator. Verwijder de deksels onder de laminaire stroming kap.
  11. Bereid vooraf geactiveerd en / of naïeve T-cellen, met of zonder specifieke cytokinen, antilichamen of andere stoffen, zoals gewenst: Bijvoorbeeld: mix gezuiverd NA / LE rat anti-muis IFN-γ-antilichaam (kloon XGM1.2) met voorbereide T cellen, bij 20 ug / ml per putje van de TEER instrument.
    NB: Als stoffen zoals granzyme B remmer gebruikt worden, zijn ze eenT OEGEVOEGDE naar T celkweek begin van T-cel stimulatie: bijvoorbeeld, Granzyme B Inhibitor II (Calbiochem) wordt gemengd met geïsoleerde T-cellen in een eindconcentratie van 10 uM in DMSO. Zie materialen en apparatuur voor meer details.
  12. Verwijder een deel van het medium van de insert (het bovenste compartiment goed): bv, voorzichtig pipet uit 150 ul (het verwijderen van al het medium dient te worden vermeden omdat dit de MBMEC monolaag kunnen verstoren).
  13. Voeg T-cellen aan MBMECs door voorzichtig pipetteren 150 ul medium dat 2 x 10 5 cellen / insert.
    LET OP: Bij het oogsten van pre-geactiveerde T-cellen, tellen alleen stralen, Trypan Blue-vrije cellen.
  14. Sluit de deksels en zet het instrument terug naar de incubator. Sluit het instrument en druk op 'resume meting'. Na 24 uur, drukt u op 'stop' in het tabblad 'experiment' en sla het bestand op (Bestand> Opslaan).

5. De gegevens exporteren en statistische analyse

  1. Exporteer de resultaten door te kiezen voor Bestand> Exporteren.
  2. In het tabblad "instellingen" van het pop-up venster, selecteer ".dot" in de optie "decimaalteken" en "tabulator" in de optie 'veldscheidingsteken ".
  3. In het tabblad "export resultaten", de naam van het bestand, laat U alle putten uit te voeren, en controleer de "TEER" en "Ccl" dozen in de "kiest data" optie.
  4. Druk op 'gegevens exporteren', opent u het geëxporteerde bestand, en de gegevens te kopiëren naar een spreadsheet.
  5. Normaliseren van de geëxporteerde gegevens (naargelang elk repliceren, met TEER en Ccl waarden voor elke run (meting)): Set TEER en Ccl waarden van het laatste tijdstip voor de co-cultuur tot 100% en wijzigt bijgevolg de waarden voor alle andere runs, ten opzichte van de '100%' run.
  6. Kopiëren genormaliseerde gegevens naar een software naar keuze een grafiek te genereren met afzonderlijke putjes en tonen de standaardfout van het gemiddelde voor elke behandelingsgroep.
  7. Perform Two-way ANOVA statistische test met een Bonferroni correctie voor meerdere vergelijkingen, met behulp van de statistische software van uw keuze.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 geeft een algemeen overzicht van de in vitro BBB model gebruikt om de interactie tussen T-cellen en endotheliale cellen te bestuderen. Het experiment bestaat uit drie belangrijke stappen. De eerste stap is de isolatie van primaire MBMECs van hersenen cortex en hun cultuur gedurende vijf dagen. Wanneer ze samenvloeiing bereiken in de celcultuur plaat, worden MBMECs getrypsiniseerd en opnieuw uitgezet op doorlatende inzetstukken, die vervolgens in de TEER...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Verschillende stappen van het beschreven protocol zijn essentieel voor een geslaagd experiment. Tijdens de eerste MBMEC isolatie en kweek, is het cruciaal dat gewerkt wordt onder steriele omstandigheden zo veel mogelijk om de verontreiniging van de celkweek met schimmelsporen en bacteriën te voorkomen. Om een reincultuur van EC te verkrijgen, wordt aanbevolen een medium dat Puromycine voor de eerste drie dagen, die overleving van EC maakt, maar geen andere celtypen (met name pericyten) 41,42 gebruiken. Een an...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl en L. Klotz hebben niets te onthullen. H.-J. Galla is een wetenschappelijk adviseur van nanoAnalytics GmbH, de fabrikant van de geautomatiseerde celmonitor.

Dankbetuigingen

We zijn dankbaar voor Annika Engbers en Frank Kurth voor hun uitstekende technische ondersteuning en Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) voor nuttige discussies over TEER metingen. Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 project A03 HW en LK, CRC TR128, projecteert A08; Z1 en B01 LK en HW, en het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (Medische Faculteit van Münster) subsidie ​​nummer KL2 / 2015/14 naar LK.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
cellZscopenanoAnalytics GmbHwww.nanoanalytics.cominclusief: 24-well Cell Module, Controller, PC met cellZscope software v2.2.2 
UltracentrifugeThermo Scientificwww.thermoscientific.comSORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; voor MBMEC isolatie
flow cytometerBeckman Coulterwww.beckmancoulter.comvoor analyse van T-cel transmigratie
FlowJo7.6.5 softwareTree Starwww.flowjo.comvoor analyse van T-cel transmigratie
Oak Ridge centrifuge tubes, PCThermo Fisher Scientific3118-005050 ml; voor MBMEC isolatie
Transwell membraan inserts - poriegrootte 0.4 µmCorning3470voor TEER meting als de belangrijkste uitlezing
Transwell membraan inserts - poriegrootte 3 µmCorning3472voor TEER meting als de kwaliteitscontrole vóór T-cel transmigratie assay
24-well celcultuurplaatGreiner650 180platte bodem; voor MBMEC cultuur
96-well celcultuurplaatCostar3526ronde bodem; voor immuuncel cultuur
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-090-976voor T-cel en B-cel isolatie; ondersteunt MACS LS kolommen
OctoMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-109voor dendritische cel isolatie; ondersteunt MACS MS kolommen
Neubauer tellingskamerMarienfeldMF-0640010voor celtelling
Cel zeef, 70 µmCorning352350voor immuuncel isolatie
Cel zeef, 40 µmCorning352340voor immuuncel isolatie
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303voor immuuncel isolatie
MACS LS scheidingskolommenMiltenyi Biotec130-042-401voor T-cel en B-cel isolatie
MACS MS scheidingskolommenMiltenyi Biotec130-042-201voor dendritische cel isolatie
Mouse CD4 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-049-201voor CD4+ T-cel isolatie
Mouse CD19 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-052-201voor B-cel isolatie
Mouse CD11c MicroBeadsMiltenyi Biotec130-052-001voor dendritische cel isolatie
Collageen type IV uit menselijke placentaSigmaC5533voor MBMEC coating oplossing
Fibronectine uit bovijn plasmaSigmaF1141-5MGvoor MBMEC coating oplossing
Collagenase 2 (CSL2)WorthingtonLS004176voor MBMEC isolatie
Collagenase/Dispase (C/D)Roche11097113001voor MBMEC isolatie
DNase ISigmaDN25voor MBMEC isolatie
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF7524voor MBMEC isolatie
Bovine Serum Albumine (BSA)Amresco0332-100Gvoor MBMEC isolatie
PercollSigmaP1644-1Lvoor MBMEC isolatie
DMEM (+ GlutaMAX)Gibco31966-021voor MBMEC isolatie en MBMEC cultuur medium
Penicilline/StreptomycineSigmaP4333voor MBMEC isolatie en MBMEC cultuur medium
Phosphate-Buffered Saline (PBS)SigmaD8537voor MBMEC en immuuncel isolatie
HeparineSigmaH3393voor MBMEC cultuur medium
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)PeproTech100-18Bvoor MBMEC cultuur medium
PuromycinSigmaP8833voor MBMEC cultuur medium; alleen voor de eerste drie dagen
0.05% Trypsin-EDTAGibco25300-054voor het verzamelen van MBMECs
Collagenase Type IASigmaC9891voor dendritische cel isolatie
Trypan Blauw oplossing, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250061voor celtelling
EDTASigmaE5134voor immuuncel isolatie
IMDM + 1% L-GlutaminGibco21980-032voor T-cel cultuur medium
X-VIVO 15LonzaBE04-418Qbescherm tegen licht; voor B-cel cultuur medium
β-mercaptoethanolGibco31350-010voor B-cel cultuur medium
L-Glutamine (100x Glutamax)Gibco35050-061voor B-cel cultuur medium
muis MOG35—55 peptideBiotrendBP0328voor antigeen-specifieke T-cel activering
gezuiverde anti-muis CD3 AbBioLegend100302clone 145-2C11; voor polyklonale T-cel activering
gezuiverde NA/LE anti-muis CD28 AbBD Pharmingen553294clone 37.51; voor polyklonale T-cel activering
Recombinant Murine IFN-γPeproTech315-05voor T-cel transmigratie assays
Recombinant Murine TNF-αPeproTech315-01Avoor T-cel transmigratie assays
NA/LE gezuiverde anti-muis IFN-γ antilichaamBD Biosciences554408clone XMG1.2; aanbevolen eindconcentratie: 20 µg/ml
Granzyme B Inhibitor IICalbiochem368055aanbevolen eindconcentratie: 10 µM
PE anti-muis CD4 antilichaamBiolegend116005clone RM4-4; voor analyse van T-

Referenties

  1. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
  2. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  3. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
  4. Luissint, A. -C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23(2012).
  5. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence? J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
  8. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  9. Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
  10. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  11. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
  12. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  13. Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
  14. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  15. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
  16. Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
  18. Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022(2012).
  19. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  20. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  21. Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
  22. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  23. Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
  24. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  25. Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
  26. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  27. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5(2013).
  28. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
  29. Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766(2014).
  30. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  31. Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , Nova. New York. (2011).
  32. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  33. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  34. Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
  35. Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T Lymphocyte-Endothelial Cell Interactions. Annu Rev Immunol. 22 (1), 683-709 (2004).
  36. Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide - How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
  37. Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
  38. von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
  39. nanoAnalytics GmbH, Münster, Germany. , Available from: http://www.nanoanalytics.com/en (2016).
  40. Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
  41. Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
  42. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
  43. Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
  44. Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889(2015).
  45. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
  46. Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
  47. Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
  48. Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
  49. Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
  50. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784(2012).
  51. Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Transendotheliale Elektrische WeerstandCapaciteit van de CellayerPrimaire Endotheelcellen van de Microvasculatuur in de MuizenhersenenGeactiveerde T cellenCo culture AssayReal time Beoordeling van de Barri refunctieAuto immuunziekten van het Centraal Zenuwstelsel

Gerelateerde artikelen