Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Met behulp van capillaire elektroforese te kwantificeren organische zuren uit Plant Tissue: A Case Test Onderzoeken

9.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54611

⸱

12 november 2016

 ,  , 
1Center for Applied Plant Sciences, The Ohio State University, OARDC, 2Department of Plant Pathology, The Ohio State University, OARDC, 3Department of Horticulture and Crop Science, The Ohio State University, OARDC, 4OARDC Metabolite Analysis Cluster, The Ohio State University, OARDC

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel presenteert een methode voor de detectie en kwantificering van organische zuren uit plantaardig materiaal met behulp van gratis zonale capillaire elektroforese. Een voorbeeld van de mogelijke toepassing van deze methode bepalen van de effecten van een tweede gisting op organische zuurgraad in koffiezaden is voorzien.

Samenvatting

Carbonzuren zijn organische zuren die één of meer eindstandige carboxyl (COOH) functionele groepen. Kortketenige carbonzuren (SCCAs; carbonzuren met 3-6 koolstofatomen), zoals citraat malaat en zijn essentieel voor de goede werking van vele biologische systemen, waarbij ze functioneren cellulaire ademhaling en kunnen als indicatoren van celgezondheid dienen. In voedingsmiddelen, kan het gehalte aan organische zuren significante invloed op de smaak, met een verhoogde SCCA niveaus resulteert in een zure of "zure" smaak. Hierdoor werkwijzen voor de snelle analyse van organische zuurgraad van bijzonder belang voor de voedings- en drankenindustrie. Helaas zijn de meeste methoden voor SCCA kwantificering afhankelijk zijn tijdrovend protocollen die de derivatisering van monsters met gevaarlijke reagentia, gevolgd door kostbare chromatografische en / of massaspectrometrische analyses. Deze methode Gegevens van een alternatieve methode voor de detectie en kwantificering van organic zuren uit plantmateriaal levensmiddelenmonsters behulp vrije zonale capillaire elektroforese (CZE), soms eenvoudig aangeduid als capillaire elektroforese (CE). CZE levert een rendabele werkwijze voor het meten SCCAs met een lage detectielimiet (0,005 mg / ml). Dit artikel beschrijft de extractie en kwantificering van SCCAs uit plantaardige monsters. Terwijl de methode gericht op metingen van SCCAs van koffiebonen, kan de methode worden toegepast om meerdere plantaardige voedselmaterialen.

Inleiding

Carbonzuurverbindingen zijn organische stoffen die een of meer terminale carboxylfunctionele groepen bevatten, elk verbonden aan een R-groep die een of meer koolstofatomen bevat (R-C[O]OH). Korte ketting, lage molecuulgewicht koolzuurverbindingen (korte ketting koolzuurverbindingen, SCCAs) die tussen één en zes koolstofatomen bevatten, zijn essentiële componenten van cellulaire ademhaling en functioneren in verschillende biochemische routes die noodzakelijk zijn voor celgroei en ontwikkeling. SCCAs spelen een cruciale rol in cellulair metabolisme1, celsignalering2 en organismenreacties op de omgeving (zoals antibiose3). Hierdoor kunnen SCCAs dienen als nuttige indicatoren van verstoringen in het cellulaire metabolisme, plantenstressreacties4,5 en fruitkwaliteit6,7. Tot nu toe zijn SCCAs voornamelijk gekwantificeerd door chromatografische technieken zoals hogeprestatievloeistofchromatografie (HPLC) of gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS). Hoewel deze methoden in staat zijn om zeer lage detectielimieten te bereiken, kunnen ze duur zijn, vereisen ze de derivatisering van doel-SCCA's met behulp van kaustische en/of giftige reagentia, en omvatten ze lange scheidingsruns op de GC of HPLC. Hierdoor is de belangstelling voor het gebruik van vrije zonale capillaire elektroforese (CZE), die geen monsterderivatisering vereist, om organische zuren te kwantificeren, gestaag toegenomen8.

Vrije zonale capillaire elektroforese (CZE) is een chromatografische scheidingsmethode die, vanwege het hoge aantal theoretische platen, snelheid en relatieve gebruiksgemak, GC-MS en hogedrukvloeistofchromatografie als analytische methode voor de kwantificering (met name voor kwaliteitscontroledoeleinden) van anionen, kationen, aminozuren, koolhydraten en kortkettige koolzuurverbindingen (SCCAs)8,9,10 steeds meer vervangt. CZE-gebaseerde scheiding van kleine moleculen, inclusief SCCAs, is gebaseerd op twee primaire principes: de elektrofortische beweging van geladen ionen in een elektrisch veld dat over de buffer is ingesteld die de capillair vult; en de elektro-osmotische beweging van het hele buffersysteem van het ene uiteinde van de capillair naar het andere, over het algemeen richting de negatieve elektrode. In dit systeem bewegen kleine moleculen zich naar de negatieve elektrode met verschillende snelheden, waarbij de snelheid van elk molecuul wordt bepaald door de verhouding van de netto lading van het molecuul tot de moleculaire massa. Aangezien de beweging van elk individueel molecuul in dit systeem afhankelijk is van de ladingstoestand van het molecuul en de algehele snelheid van elektro-osmotisch vloeibare stroom (die op zijn beurt is gebaseerd op het ionengehalte van de buffer die wordt gebruikt om de capillair te vullen), hebben de buffer pH en ionische samenstelling een grote invloed op de mate waarin moleculen efficiënt kunnen worden gescheiden met behulp van CZE. Hierdoor zijn SCCAs, met hun relatief hoge lading-massa-verhoudingen, ideale doelen voor CZE-gebaseerde scheiding. Metabolieten die met CZE worden gescheiden, kunnen worden gedetecteerd met behulp van verschillende methoden, waaronder UV-absorptie, spectraal absorptie (die over het algemeen wordt uitgevoerd met behulp van een fotodiodenarray [PDA]) en/of massaspectrometrie (CE-MS of CE-MS/MS)8. De diversiteit aan scheidings- en detectiemethoden die door CZE wordt geboden, maakt het een uiterst flexibele en aanpasbare techniek. Hierdoor wordt CZE steeds vaker toegepast als standaardanalysemethode op het gebied van voedselveiligheid en -kwaliteit11,12, farmaceutisch onderzoek13 en milieubewaking13,14.

Capillaire elektroforese wordt al bijna twee decennia gebruikt om kortkettige koolzuurverbindingen te detecteren en kwantificeren13. Het scheidend vermogen (met name voor kleine, geladen moleculen), de korte looptijd en de lage per-steekproefkosten van CZE-analyses maken CZE tot een ideale techniek voor de scheiding en kwantificering van SCCAs13. Deze methode presenteert een protocol om CZE te gebruiken voor het meten van de concentratie van organische zuren uit plantweefsels. Voorbeeldgegevens werden gegenereerd door de succesvolle implementatie van dit protocol om de verandering in organische zuurniveaus in koffiebonen na een secundaire fermentatiebehandeling te meten. Het protocol beschrijft de kritieke stappen en veelvoorkomende fouten van CZE-gebaseerde scheiding van SCCAs en bespreekt de manieren waarop dit protocol met succes kan worden toegepast om SCCAs in aanvullende plantweefsels te kwantificeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Monstervoorbereiding

  1. Assembleren monsters voor korte keten carbonzuur (SCCA) extractie. Bereid 1,0 g koffie zaad per keer dat voldoende monster na verwerking blijven garanderen.
    1. Als monsters werden bevroren voorafgaand aan het maalproces, houden het weefsel bevroren hele verwerking vries / dooi schade en sample oxidatie te voorkomen. Verwijder het monster uit de vriezer of sub-zero opslag alleen nodig voor het slijpen.
    2. Flash bevriezen verse monsters in vloeibare stikstof onmiddellijk voorafgaand aan proeven slijpen. Handling monster flash freeze monsters minimaliseren door ze in een mortier voorgevuld met vloeibare stikstof.
    3. Analyseer vloeibare monsters onmiddellijk na generatie, of flash-vries in vloeibare stikstof en bewaar bij -20 ° C of -80 ° C tot analyse. Voorafgaand aan de analyse, verwijderen ingevroren monsters uit de opslag en laat ontdooien. Voor vloeibare monsters ga dan naar stap (3.5) voor de verwerking.
  2. slijtage voorkomendsende persoonlijke beschermingsmiddelen (inclusief veiligheidsbril, handschoenen en laboratoriumjas) voordat u gaat werken met vloeibare stikstof.
  3. Triple-grind weefselmonsters aan een gelijkmatig fijn poeder (dat wil zeggen, van een uniforme deeltjesgrootte) in vloeibare stikstof met behulp van een keramische mortier en een stamper.
    Opmerking: Het bereiken van een uniforme deeltjesgrootte essentieel is voor het maximaliseren SCCA afzuigniveau.
    1. Pre-koel de mortier en stamper met vloeibare stikstof voorafgaande aan de toevoeging van het monster. Houd de mortel gevuld met een kleine hoeveelheid vloeibare stikstof als het monster wordt toegevoegd.
    2. Met behulp van een pollepel, voeg genoeg vloeibare stikstof om de mortel aan het monster volledig onder te dompelen.
    3. Voeg gemakkelijk gemalen monsters, zoals bladeren of gebrande koffie, de vloeibare stikstof en plet met een draaiende beweging slijpen. Begin monsters vermalen wanneer de vloeibare stikstof niveau is afgenomen tot het punt waar het nauwelijks bedekt de monsters.
    4. Voeg moeilijk monsters dergelijke malens ruwe koffie zaden, vloeibare stikstof en hen in staat stellen te bevriezen gedurende 10-30 sec (of tot de vloeibare stikstof stopt krachtig kokend) vóór het wordt vermalen. Breek het weefsel in kleinere fragmenten met behulp van een verticale beweging verpletteren, en vervolgens compleet weefsel slijpen met behulp van een cirkelvormige beweging slijpen.
    5. Herhaal stappen 1.3.2-1.3.4 tweemaal, zodat de monsters in totaal driemaal gemalen. Kenmerkend zullen drie opeenvolgende ronden van vermalen monsters te beperken tot een poeder met een bloem-achtige consistentie.
    6. Indien een bloem consistentie niet wordt bereikt, herhaal stappen 1.3.2-1.3.4 tot monsters worden tot een poeder uniform kleine deeltjesgrootte (extractie efficiëntie is omgekeerd evenredig met de deeltjesgrootte).
  4. Transfer poeder aan glazen flesjes of 1,5 ml microcentrifugebuizen. Initiëren downstream processing onmiddellijk na het slijpen (aanbevolen), of monsters op te slaan bij -80 ºC tot monsters zijn klaar voor extractie.
    1. Als monsters moeten worden bewaard alvorensanalyse gesplitst monster in porties 500 mg (of 500 ul aliquots voor vloeibare monsters) en verdeeld over meerdere buizen voor opslag. Vermijd het onderwerpen van monsters aan herhaalde vries / dooi cycli, omdat deze sample samenstelling kan veranderen en een negatieve invloed op de toekomstige sample metingen.

2. Biologische Acid Standard Voorbereiding

  1. Monteer authentieke normen voor het SCCAs van belang. Deze zullen worden gebruikt om externe en interne standaardoplossingen maken die bepalen SCCA concentraties. Voor koffiestaaltjes omvatten citroenzuur, appelzuur, azijnzuur en melkzuur zuren plaats en adipinezuur als interne standaard.
    1. Ervoor zorgen dat de interne standaard geselecteerde niet van nature in het monster wordt gevonden, en dat de norm niet co-elueren met andere pieken van het monster profiel.
    2. Run standaard curves voor elk SCCA van belang, en het bepalen van de lineaire respons bereik voor iedere SCCA (zie hoofdstuk 4 voor het uitvoeren instructions). Zorg ervoor dat de standaard curves lopen voor iedere SCCA te meten in het monster.
      OPMERKING: Standaard krommen kunnen worden gebruikt in ofwel buffer of de achtergrond van het te bepalen monster. In het tweede geval ( "standaard") kan zijn, worden waarden van het piekoppervlak van elke standaardcurve punt worden bepaald door afstand aftrekken van de achtergrond van het monster.
    3. Pre-label alle buizen en glaswerk nodig de SCCA zuur naam, concentratie en de datum van de test.
  2. Bereid voorraadoplossingen per standaard met een bekende concentratie (10 mg / ml) met een maatkolf nauwkeurigheid tijdens standaardpreparaat waarborgen.
    1. Lossen vaste SCCA normen (citroenzuur en appelzuur) in ultrazuiver water (18,2 MQ) om het gewenst voor de voorraadoplossing concentratie bereiken.
      1. Een 10 mg / ml voorraadoplossing door het toevoegen van 100 mg van een standaard 10 ml maatkolf. Vul de maatkolf aan de 10 ml lijn met ultrapuur water om dissolve het zuur.
      2. Een lagere zuurconcentratie standaard of verwarm de kolven te rijden moeilijk te lossen SCCA standaarden, zoals adipinezuur, in oplossing.
    2. Verdunde vloeibare fase zuur normen (azijnzuur en melkzuur) in ultrazuiver water tot de gewenste concentratie te bereiken.
      1. Pre-fill een maatkolf met 5 ml ultrapuur water. Voeg voldoende zuur om een ​​10 mg / ml oplossing (berekend met de zuurdichtheid door de verkoper) aan de kolf bereiden en voeg voldoende water om het eindvolume van de oplossing 10 ml wordt.
  3. Transfer elke voorraadoplossing om een ​​schone 15 ml glazen buis met een polytetrafluorethyleen (PTFE) gevoerd deksel en afdichting met plastic folie paraffine. Voorraadoplossingen kunnen worden opgeslagen in afgesloten buizen bij 4 ° C gedurende 1 week.
    1. Zorg ervoor dat de SCCA normen niet zijn neergeslagen uit de oplossing vóór gebruik als stockoplossingen zijn gekoeld na preparatie. Drive neerslaat terug in oplossing door voorzichtig verwarmen.
  4. Bereid de SCCA extractie-oplossing. Onder de interne standaard in een concentratie voldoende voor detectie in de monsters (0,05 mg / ml). Bereid genoeg oplossing voor alle monsters te halen.
    1. Bereid 50 ml SCCA extractievloeistof door verdunning van de interne standaard stockoplossing aan 0,05 mg / ml in ultrazuiver water. Voeg 250 ul van de interne standaard voorraadoplossing (10 mg / ml) aan 49,75 ml water.
    2. Als het extract moet worden verdund, pas de interne standaard concentratie in de extractievloeistof zodat de uiteindelijke concentratie in de bepalingsgrens zal vallen (die een detecteerbaar, maar niet oververzadigd, piek, 5.2.2 hieronder) van de CE systeem na verdunning (0,05 mg / ml).
    3. Bereid verse extractie oplossing voor elke serie extracties (dat wil zeggen, voor elke experimentele serie).
  5. Bereid standaard curve samples(Een reeks van geschikte verdunningen) voor SCCAs plaats, met een minimum van ten minste 5 punten. De standaardkromme concentraties moeten in het lineaire meetgebied van een bepaalde SCCA en overspannen de SCCA concentraties verwacht in de monsters.
    1. Onder de geselecteerde interne standaard in de standaardcurve oplossingen voor kwantificering van de interne standaard in monsters mogelijk. De interne standaard zal worden gebruikt om te helpen bij de piek identificatie en het berekenen van extractie-efficiëntie (hoofdstuk 6).
    2. Vul telkens SCCA de hiervoor bepaalde concentraties (0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08 mg / ml, zie hierboven 2.4.2) in nieuwe microcentrifugebuizen (één voor elke concentratie / standaardcurve onder) met behulp ultrazuiver water. Bereid 1 ml oplossing voor elke standaard concentratie curve punt. Zorg ervoor dat elke concentratiepunt bevat alle vier zuur normen en de interne standaard op de juiste concentratie.
    3. Bereid nieuwe standaard curve punten voor elke setmonsters dat moet worden uitgevoerd op het capillaire elektroforesesysteem. Houd de standaard curve SCCA monsters bij 4 ºC tot analyse, die zal optreden na de winning van SCCAs van doelweefsels (deel 3).

3. Biologische Acid Extraction

  1. Pre-label monsterbuizen, bereiden ten minste één buis voor elk monster te extraheren.
  2. Verwijder monsters te extraheren uit de opslag en leg ze op het ijs, terwijl een gewicht uit materiaal voor de extractie.
  3. Weeg 100 mg van het monster voor SCCA extractie.
    1. Na het wegen elk monster, weefsel overbrengen naar een schone 1,5 ml microcentrifugebuis. Meet een hoeveelheid monster zo dicht mogelijk bij de doelgroep massa mogelijk om de variabiliteit te verminderen.
    2. Blijf op de hoogte van de massa van elk monster gemeten, als de bedragen van SCCAs gedetecteerd zal worden genormaliseerd met behulp van de steekproef massa (zie 6.5.2 hieronder).
  4. Na afweging van alle monsters, voeg 1 ml van de extractie-oplossing (de water + interne standaard mengsel uit stap 2,4) aan elk van de monsterbuizen. Houd de verhouding extractievloeistof aan weefselmassa dezelfde voor alle extracties (hier 1 ml van 100 ± 5 mg weefsel). Meng goed door vortex gedurende 10 sec.
  5. Sta monsters op kamertemperatuur gedurende 1 uur. Tijdens dit uur mengen elke buis elke 15 min zoals in stap 3,4.
  6. Na 1 uur van de winning, meng de monsters een laatste keer en transfer monsterbuizen naar een microcentrifuge. Centrifugeer de monsters bij 4 ° C, 10.000 xg gedurende 10 min vol materiaal (celwanden, deeltjes, enz.) Te precipiteren.
    1. Bij het verwerken van vloeibare monsters, voeg de juiste concentratie van de interne standaard, meng kort en centrifuge. Na centrifugeren behandelen vloeistofmonsters identiek aan het extract van vaste monsters.
    2. Controleer de pH van de monsters om te bevestigen dat zij met de pH van de loopbuffer in de detectie kit (stap 4,6) of buffer systeem dat employed. Als de omvang van de steekproef zijn meestal vrij klein is, kan de pH worden gecontroleerd met behulp van pH-papier.
  7. Bereid je voor om monsters te filteren met behulp van de spuit gemonteerd disc filters (3.8).
    OPMERKING: Voorkom sample verlies door ervoor te zorgen dat elk filter juist vóór de overbrenging van bovenstaande vloeistof wordt bevestigd aan een spuit. Bereid een injectiespuit voorzien van een schijf filter voor elk monster te analyseren (waaronder standaard curve monsters).
  8. Na centrifugeren van de monsters en voorbereiding van de spuit filters, breng de supernatant van elk monster naar een 3 ml injectiespuit met een 0,2 urn spuitfilter. Gebruik een nieuwe filter en spuit voor elk monster. Filter de monsters, waaronder standaard curve monsters en buffercontroles, voordat die op het CE-systeem.
  9. Filter het monster direct in een schone microcentrifugebuis. Na filtering, sluit de buis met filtraat en gooi de spuit / filter apparaten.
  10. Onmiddellijk plaats gefilterde samplesin het CE-systeem voor SCCA detectie; of bewaar monsters bij 4 ° C overnacht. Als monsters moeten 's nachts worden opgeslagen, sluit de buizen met plastic paraffine film gasuitwisseling en sample verdamping te voorkomen.
    1. Indien monsters langer moeten worden bewaard dan een dag na verfijning, flash freeze-extracten in vloeibare stikstof of bevriezen bij -20 ºC. Na het ontdooien, maar ervoor te zorgen dat elk monster wordt onderzocht op neerslag vorming en het filter indien nodig (zoals in stap 3.6).

4. Instellen van de SCCA Detection Run

  1. Raadpleeg de CE gebruikershandleiding voor programmeer- en besturingssoftware-specifieke details.
  2. Bereid capillaire elektroforese (CE) monster flesjes voor SCCA detectie. Zorg ervoor flesjes naar behoren worden geëtiketteerd, schoon en vrij van gebreken.
  3. Was en de doppen van de CE-flacons drogen voor gebruik.
    1. Was caps door ze onder te dompelen in ultrapuur water en waardoor ze 's nachts genieten. Na het weken de doppen, gooi het genietening oplossing en spoel de doppen twee keer meer met ultrapuur water.
    2. Transfer gespoeld caps op een schoon droog oppervlak bekleed met niet-pluizende tissue en laat ze aan de lucht drogen. Zorg ervoor dat caps zijn volledig droog zijn voor gebruik om de druk storingen te voorkomen.
  4. Transfer 1 ml van het monster aan elk CE flesje, en voorzichtig om te voorkomen dat per ongeluk spatten van het monster in de hals van het flesje. Na overdracht, plaats een CE-dop op elk flesje.
    1. Als een verdunning nodig is, verdunnen de koffie zaadmonsters 1:10 of 1: 100 direct in het CE flacon met behulp van ultrapuur water. Verdunningen groter dan 1: 100, maak een extractieoplossing te pipetteren fouten te voorkomen.
  5. Bereid een flesje per standaardcurve punt voor overdracht standaardcurve oplossingen (1,0 ml) van stap 2,5 CE flesjes. Cap elke buis na de overdracht.
  6. Bereid een 0,1 M oplossing van natriumhydroxide (NaOH) door toevoeging van 0,04 g NaOH in een bekerglas met 90 ml ultrazuiver water en waardoor de pellets to ontbinden. Breng de 0,1 M NaOH-oplossing teneinde een 100 ml maatkolf en breng het totale volume 100 ml.
  7. Voeg 1 ml 0,1 M NaOH-oplossing teneinde een schone CE flacon en dop.
  8. Bereid CE buffer flesjes voor elke partij van de monsters worden uitgevoerd op de CE-systeem. Scheiding kits beschikbaar zijn of aangepaste buffers kunnen worden gebruikt 13.
    1. Bereid 1 flacon met 1 ml startbuffer oplossing en cap.
    2. Bereid drie flesjes met elk van loopbuffer oplossing en cap 1 ml. Vervang de lopende buffer voor elke partij van de monsters en de standaard curve punten, of na 35 monsters, hetgeen het eerste plaatsvindt.
    3. Vul drie extra flesjes met 1 ml ultrapuur water en dop iedere flacon.
    4. Bereid 1 leeg "afval" flesje met dop.
  9. Na bereiding van de in stap 4.8 beschreven flesjes, laadt de flacon met buffers en water, en het afval flesjes (van stap 4.8.2-5) in de bufferbak van de capillaire elektroforese sysTEM instructies van de fabrikant 15. Let goed op de positie van elk flesje voor de auto-sampler programmering.
  10. Laad de flesjes die de standaardcurve punten en de flesjes die de monsters te analyseren in de inlaat monsterblad, volgens de instructies van de fabrikant. Let op de positie van elk flesje voor de auto-sampler programmering (zie stap 4.11.1 hieronder).
  11. Bereid conditionering en monster scheidingsmethoden (programma's voor deze zijn in de tabellen 1 en 2, respectievelijk), en schrijft een reeks monsters bestand per instrument gebruiksaanwijzing. Gebruik de scheidingswerkwijze in tabel 2: spoel de kolom met initiator (20 psi) gedurende 0,2 min; spoelen met versneller (20 psi) gedurende 0,5 min, injecteren monsters (0,5 psi) op ​​de kolom 0,09 min, afzonderlijke monsters bij 20 kV gedurende 12 min, spoelen met NaOH (20 psi) gedurende 0,5 min, en tenslotte spoelen met water ( 20 psi) gedurende 0,5 min.
    1. Using van de CE-control software, schrijf het monster loopt sequentie (dat wil zeggen, de werklijst, een lijst met bestanden waarin de volgorde waarin de monsters worden geanalyseerd, en de methode die moet worden gebruikt om elk monster te scheiden) met behulp van de "sequentie" spreadsheet interface. Elke rij op het werkblad komt overeen met een monster run en een enkel bestand te produceren.
      1. Zorg ervoor dat bij het schrijven van de reeks bestand, monsters worden geïdentificeerd met behulp van de juiste positie in de steekproef lade. Zorg ervoor dat elk bestand heeft een unieke naam om de software te voorkomen dat het overschrijven van eerdere bestanden. Programma CE capillaire conditioning loopt als een aparte reeks voorafgaand aan de sequentie run met het monster scheidingsmethode.
    2. Begin met het monster volgorde uitgevoerd met de standaard curve oplossingen, gevolgd door SCCA monsters, en eindigen met een tweede run van de standaard curve oplossingen. Dit is een berekening van de mate van elke signaalverlies optreedt tijdens monsteranalyses mogelijk.

    figure-protocol-1
    Tabel 1: Conditioneringmethode programma gebruikt om de capillaire korte keten carbonzuur scheiding bereiden via een capillaire elektroforese.

    figure-protocol-2
    Tabel 2: Scheidingsmethode programma gebruikt om kortketenige carbonzuren analyses via een capillaire elektroforese.

    5. SCCA Detection Run Execution en gegevensverzameling

    1. Initiëren capillaire conditioning runs. Verwachten dat de capillaire conditioneren twee of drie keer voordat de kolom klaar is voor het monster scheiding. Conditioning kolom worden uitgevoerd zoals beschreven in tabel 1. In het kort spoelen kolom met 0,1 M NaOH (20 psi) gedurende 1 min spoelen met water (20 psi)1 min spoelen met initiator (20 psi) gedurende 0,5 min, gespoeld met gas (20 psi) gedurende 0,5 min, aparte versneller bij 30 kV gedurende 10 minuten, spoel de kolom met 0,1 M NaOH (20 psi) gedurende 0,5 min, en tenslotte spoel de kolom met water (20 psi) gedurende 0,5 min.
      1. Breng de capillaire voorafgaand aan elk monster volgorde run. Bereiken juiste conditionering door het houden van de scheiding spanning is constant gedurende de vlucht en het observeren van een vlakke basislijn op de fotodiode array-trace.
    2. Na het conditioneren, initiëren sample scheiding door het openen van het menu "controle" in de software en het selecteren (dat wil zeggen, op te klikken) "run volgorde." Bewaken van de fotodiode array (PDA) trace om een ​​goede scheiding verzekeren.
      1. Neem de eerste sporen en ervoor te zorgen dat het een vlakke basislijn en netjes opgelost (baseline resolutie), individuele zuur pieken. Overbelast monsters lang piek staarten of tailing piek vertonen en moet worden verdund (figuur 1).

    figure-protocol-3
    Figuur 1:. Een vergelijking van PDA sporen wijzen op een overbelaste monster Omdat analytconcentratie toeneemt, kan de individuele piek geometrie beginnen te asymmetrische geworden. Bij (a) 0,05 mg / ml azijnzuur presenteert een welomschreven, tweezijdig symmetrische piek. Als de concentratie van azijnzuur verhoogd tot (b) 0,07 mg / ml en (c) 0,10 mg / ml, een piek staart vormen (pijlen). Deze piek tailing is een goede indicatie dat de steekproef is overbelast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    1. Aan het einde van de reeks run, opent u de data bestanden één voor één in de CE-analyse software en de pieken te integreren.
      1. Integreer sample pieken.
        1. Open het eerste bestanden stel de automatische integratiestappen de eerste 3 minuten van de run (indien de spanning en dus de richting van kolom stroming wordt omgekeerd zoals beschreven in Tabel 1) sluiten. In hetzelfde menu, ingesteld piek selectiecriteria tot een minimum piek breedte van 50 eenheden en de maximale oppervlakte van 100 eenheden (of de standaardinstellingen van de fabrikant) aan een matig hoge mate van selectiviteit, het scheiden van zure pieken van achtergrondlawaai in het spoor.
      2. Handmatig controleren piek grenzen en basislijnen voor elke PDA spoor om een ​​goede piek integratie te waarborgen. Onjuist geïntegreerde pieken (dwz een enigszins asymmetrische SSCA piek die is opgenomen als twee afzonderlijke pieken door geautomatiseerde software) moeten handmatig reïntegratie.
    2. Na de integratie, bekijk het percentage van het gebied rapport, dan markeren en kopieer het percentage van het gebied rapport en plak het in een aparte spreadsheet. Herhaal dit voor elk monster om de volledige run piek VERSLAG construerent waarbij elke rij vertegenwoordigt een enkele piek (bijv., dient elke piek één verbinding bevatten als de scheiding goed werkt).

    6. Data Analysis

    1. Gegevensformulieren voor analyse met behulp van spreadsheet geconstrueerd (5,4). Beginnen analyse door het merken van het zuur normen voor elk van de standaardcurve, waaronder de interne standaard.
    2. Bereken een retentie-index voor elke piek door de retentietijd te verdelen voor elke piek in het monster door de retentietijd van de interne standaard in dat monster. Sorteer de door de resulterende retentie index ingesteld op de toppen van de interesse in elk monster te identificeren data.
    3. Na het identificeren van de piek voor elk zuur van belang zijn, te bouwen standaard curves voor elk zuur met behulp van de externe standaard curve punten.
      1. Genereer een standaard (concentratie) curve voor elke SCCA standaard door het bepalen van het piekoppervlak voor elke concentratie van de SCCA normen, en het uitzetten van de concentratie op de xxis vs piekoppervlak op de y-as. Plot van de lineaire regressie voor iedere SCCA standaard curve en definieert de helling vergelijking (y = mx + b).
      2. Het O 2 waarden van de lineaire regressies 0,90 of hoger als de kwantificering nauwkeurigst worden uitgevoerd in het lineaire gebied van de standaardcurve.
    4. Bereken de zuurconcentratie voor een gegeven SCCA in een monster met behulp van het piekoppervlak en de helling vergelijking voor de lineaire regressielijn van de standaardkromme (berekend 6.3.2 hierboven). Kort samengevat, verdelen de waargenomen piekoppervlak voor een bepaald zuur door de helling van de regressielijn voor standaard curve die zuur.
      1. Corrigeer de ruwe concentraties berekend in stap 6.4 voor het monster verlies tijdens het verwerken van het gebruik van de interne standaard (stap 6.5).
    5. Bereken de correctiefactor voor elk monster met behulp van de interne standaard.
      1. Verdeel de feitelijke concentratie van de interne standaard (dat wil zeggen, de known hoeveelheid aan het begin van het experiment) van de waargenomen waarde van de interne standaard in het monster (dat wil zeggen, de helling berekend met de vergelijking van de standaardcurve voor de interne standaard bedrag). Vermenigvuldig het ruwe concentratiewaarden van elk SCCA in het monster deze correctiefactor.
      2. Verdeel de interne standaard SCCA gecorrigeerde concentratie door de massa van de voor extractie te corrigeren voor variatie in monstermassa monster. Deze berekening levert hoeveelheid analyt per massa monster (mg SCCA per mg gemalen koffie in dit voorbeeld), dat vervolgens kan worden omgezet naar de juiste eenheden voor bepaalde studie (mg / mg, mg / g, g / g, etc. ).
    6. Na het berekenen SCCA concentraties (genormaliseerd ofwel de massa [voor vaste of vloeibare monsters] of volume [voor vloeistofmonsters]), gebruiken ze voor statistische analyse volgens de eisen van het experimentele ontwerp en kwesties van belang.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol is met succes gebruikt om de effecten van de behandeling van zaden op de SCCA inhoud van groene koffie zaden te meten. In dit experiment werden de zes behandelingen waren: een verzadigde microbiële suspensie van Leuconostoc pseudomesenteroides stam GCP674 in het groeimedium (1) een waterige suspensie van GCP674 microben in water (2), een waterige oplossing van azijnzuur en melkzuur (0,15 en 0,4 mg / ml) (3), een uitgegeven M1 groeimedium behandeling (4), dH 2

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Zoals bij elke analytische techniek zijn er verschillende kritische factoren die een belangrijke invloed kunnen de kwaliteit en betrouwbaarheid van de gegenereerde data. Ten eerste is het belangrijk om monsters efficiënt te verwerken, met een minimum invries / ontdooi cycli. Herhaald invriezen en ontdooien kan de chemische samenstelling van het monster gevaar voor verwerking of analyse. Ten tweede, is het essentieel om de stappen van het protocol consistent en gelijkmatig voor alle monsters. Technische fouten gevolg van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de financiële ondersteuning van dit project door The J.M. Smucker-bedrijf graag erkennen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ceramic Moarter en StamperCoorstek60310
Beckman Coulter P/ACE MDQ CE systeemBeckman CoulterVerschillende
Glazen monstervialenFisher Inc.033917D
1.5 ml microcentrifugebuisjes Fisher Inc.02-681-5
LC/MS grade waterFisher Inc.W6-1Milli-Q water (18.2 MΩ·cm) is ook acceptabel
15 ml glazen buis/ Teflon voorziene dop Fisher Inc.14-93331A
Parafilm MFisher Inc.13-374-12
CElixirOA detectie Kit pH 5.4 MicroSolv06100-5.4
BD Safety-Lok spuitenFisher Inc.14-829-32
17 mm Target Spuitfilter, PTFEFisher Inc.3377154
32 Karat, V. 8.0 controlesoftwareBeckman Coulter285512
capillary electrophoresis (CE) monstervialen Beckman Coulter144980
doppen voor CE-buisjes Beckman Coulter144648
Vloeibare StikstofN/AN/AVloeibare stikstof is verkrijgbaar bij de meeste faciliteitenservices

Referenties

  1. Araújo, W. L., Nunes-Nesi, A., Nikoloski, Z., Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. Metabolic Control and Regulation of the Tricarboxylic Acid Cycle in Photosynthetic and Heterotrophic Plant Tissues: TCA Control and Regulation in Plant Tissues. Plant Cell Environ. 35 (1), 1-21 (2012).
  2. Finkemeier, I., Konig, A. C., et al. Transcriptomic Analysis of the Role of Carboxylic Acids in Metabolite Signaling in Arabidopsis Leaves. Plant Physiol. 162 (1), 239-253 (2013).
  3. Doyle, M. P., Buchanan, R. Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. , 4th, ASM Press. Washington, DC, USA. (2013).
  4. Tůma, P., Samcová, E., Štulìk, K. Determination of the Spectrum of Low Molecular Mass Organic Acids in Urine by Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity and Ultraviolet Photometric Detection-An Efficient Tool for Monitoring of Inborn Metabolic Disorders. Anal Chim Acta. 685 (1), 84-90 (2011).
  5. López-Bucio, J., Nieto-Jacobo, M. F., Ramı́rez-Rodrı́guez, V., Herrera-Estrella, L. Organic Acid Metabolism in Plants: From Adaptive Physiology to Transgenic Varieties for Cultivation in Extreme Soils. Plant Sci. 160 (1), 1-13 (2000).
  6. Cebolla-Cornejo, J., Valcárcel, M., Herrero-Martìnez, J. M., Rosellò, S., Nuez, F. High Efficiency Joint CZE Determination of Sugars and Acids in Vegetables and Fruits: CE and CEC. Electrophoresis. 33 (15), 2416-2423 (2012).
  7. Rosello, S., Galiana-Balaguer, L., Herrero-Martinez, J. M., Maquieira, A., Nuez, F. Simultaneous Quantification of the Main Organic Acids and Carbohydrates Involved in Tomato Flavour Using Capillary Zone Electrophoresis. J Sci Food Agr. 82 (10), 1101-1106 (2002).
  8. Wasielewska, M., Banel, A., Zygmunt, B. Capillary Electrophoresis in Determination of Low Molecular Mass Organic Acids. Int J Environ Sci Dev. 5 (4), 417-425 (2014).
  9. Galli, V., Garcìa, A., Saavedra, L., Barbas, C. Capillary Electrophoresis for Short-Chain Organic Acids and Inorganic Anions in Different Samples. Electrophoresis. 24 (1213), 1951-1981 (2003).
  10. Klampfl, C. W. Determination of Organic Acids by CE and CEC Methods. Electrophoresis. 28 (19), 3362-3378 (2007).
  11. Kenney, B. F. Determination of Organic Acids in Food Samples by Capillary Electrophoresis. J Chromatogr A. 546, 423-430 (1991).
  12. Galli, V., Barbas, C. Capillary Electrophoresis for the Analysis of Short-Chain Organic Acids in Coffee. J Chromatogr A. 1032 (1-2), 299-304 (2004).
  13. Capillary Electrophoresis: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Schmitt-Kopplin, P. , Humana Press, USA. Totowa, NJ. 384(2008).
  14. Chromatographic analysis of the environment 3rd ed. Nollet, L. , CRC/Taylor & Franciss, Boca. Raton, USA. (2006).
  15. ElixerOA Organic Acids/Anions Operating and Instruction Manual, MicroSolv Technology Corperation. , Eatontown, NJ, USA. (2001).
  16. Dahlen, J., Hagberg, J., Karlsson, S. Analysis of low molecular weight organic acids in water with capillary zone electrophoresis employing indirect photometric detection. Fresenius J. Anal. Chem. 366 (5), 488-493 (2000).
  17. Ibanez, A. B., Bauer, S. Analytical method for the determination of organic acids in dilute acid pretreated biomass hydrolysate by liquid chromatography-time-of-flight mass spectroscopy. Biotech. For Biofuels. 7 (145), (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Kwantificering van organische zurenkortketenige carbonzurenextractie uit planteweefselanalyse van koffiezadenvrije zone capillaire elektroforeseSCCA detectieprotocol voor monstervoorbereidingfotodiodearray detectiebereiding van standaardcurven
Met behulp van capillaire elektroforese te kwantificeren organische zuren uit Plant Tissue: A Case Test Onderzoeken
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.