Methodenartikel

Het meten van progressieve neurologische Disability in een muismodel van Multiple Sclerose

DOI:

10.3791/54616

⸱

14 november 2016

 ,  , 
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine at Dartmouth

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel wordt een geoptimaliseerd testprotocol gepresenteerd voor de Rotarod-prestatietest, die wordt gebruikt voor het meten van progressieve neurologische handicaps bij met TMEV geïnfecteerde muizen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nadat besmetting intracerebraal is gebeurd met het Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), ontwikkelen vatbare SJL-muizen een chronisch-progressieve demyeliniserende ziekte, met klinische kenmerken die vergelijkbaar zijn met de progressieve vormen van multiple sclerose (MS). De muizen vertonen een progressieve handicap met verlies van motorische en sensorische functies, wat kan worden beoordeeld met meerdere apparaten en protocollen. Onder deze, is de Rotarod-prestatietest een veelgebruikte gedragstest, met als voordeel dat deze objectieve metingen levert, maar het wordt vaak gebruikt in de veronderstelling dat het eenvoudig en direct is. In tegenstelling tot visuele scoresystemen die in sommige modellen van MS worden gebruikt, die zeer subjectief zijn, genereert de Rotarod-test een objectieve, meetbare, continue variabele (d.w.z. tijdsduur), waardoor bijna perfecte inter-rater-overeenkomsten mogelijk zijn. De betrouwbaarheid tussen laboratoria wordt echter alleen bereikt als de verschillende testparameters worden gerepliceerd. In dit manuscript worden aanbevelingen voor specifieke testparameters, zoals grootte, snelheid en versnelling van de staaf; hoeveelheid training die aan de dieren wordt gegeven; en dataverwerking, gepresenteerd voor de Rotarod-test.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Theiler's Murine Encefalomyelitis Virus (TMEV) een neurotrope enkelstrengs RNA virus dat voortdurend infecteert het muizen centrale zenuwstelsel (CNS). Bij gevoelige muizen, infectie met TMEV veroorzaakt een immuungemedieerde, chronische progressieve demyeliniserende ziekte, die bekend staat als TMEV-geïnduceerde diermodellen (TMEV-IDD). Experimentele infectie van muizen draait beloop lijkt op die waargenomen bij progressieve vorm van multiple sclerose (MS). TMEV-IDD wordt gekenmerkt door twee afzonderlijke fasen: de acute en de chronische fase. De acute fase een mild, gewoonlijk subklinische encefalitis 1,2. De tweede, de chronische fase begint ongeveer een maand na infectie bestaat uit een langzaam voortschrijdende beperking gekenmerkt door demyelinisatie, ontsteking en axonale beschadiging 1,2. De zwakte waargenomen bij muizen wordt geassocieerd met spasticiteit en soms ernstige tonic spasmen.

Omdat er momenteel geen medications de progressieve handicap te verbeteren bij patiënten, onderzoekers in het bijzonder aangetrokken door TMEV-IDD, waardoor een optimale diermodel voor de bewaking van de impact van disease-modifying drugs op progressie van de ziekte vertegenwoordigt. In muizen en bij MS-patiënten, de controle van invaliditeitsprogressie vereist een continue klinische observatie gedurende langere tijdsperioden. Bij muizen, kan op lange termijn monitoring voor arbeidsongeschiktheid progressie worden bereikt met de Rotarod verrichtingsonderzoek.

De Rotarod performance test is een standaard gedrags-test die door een motor betrokken functies, zoals coördinatie, balans, en vermoeidheid bij knaagdieren evalueert. De muizen moeten hun evenwicht op draaistang die draait onder continue versnelling te houden; de tijd latency te vallen van deze hengel wordt vastgelegd. Dieren met neurologische stoornissen zijn niet in staat om te verblijven op de roterende staaf zolang controles, en ze normaal afzetten wanneer de rotatiesnelheid hoger is dan hunmotorvermogen. Hoe meer neurologische stoornis de dieren, hoe eerder ze vallen uit de stang, en hoe korter de tijd latentie.

Het voordeel van de Rotarod proef via traditionele visuele scoring systemen moet ernaar gestreefd genereert meten variabele-tijd-vertraging die uiteindelijk kan worden gebruikt voor statistische analyses om de effecten van therapieën en experimentele procedures 3 kwantificeren.

In het Laboratorium voor Neuro-immunologie (LONI) in Dartmouth, zijn muizen blootgesteld aan een aanpassing protocol, waar ze worden getest voorafgaand aan TMEV infectie om hen vertrouwd te maken met de machine en hun normale "basislijn" balance coördinatie en motorische controle 4 te beoordelen, 5. Zodra de basislijn wordt vastgesteld en de muizen geïnfecteerd met TMEV, worden ze twee keer per week getest over een periode van enkele maanden. De werkelijke testprotocol duurt gemiddeld 150 dagen, waardoor een evaluatie vande daling van de balans, coördinatie en motorische controle over het gehele verloop van de demyeliniserende ziekte.

Enkele honderden TMEV-IDD en sham-behandelde muizen werden tot nu toe getest op neurologische dysfunctie bij Dartmouth. Deze muizen hadden verschillende immunomodulerende behandelingen ontvingen, maar geen farmacologisch middel effectief is gebleken bij het verlichten invaliditeitsprogressie 6,7 te zijn. In dit artikel en de daarmee verband houdende protocol beschreven hoe u de progressieve neurologische stoornis die wordt weergegeven door TMEV-IDD muizen te karakteriseren. Vooral het protocol biedt aanbevelingen specifieke testparameters verondersteld algemeen geschikt voor het bestuderen van neurologische invaliditeit bij TMEV IDD-muizen met de Rotarod test. Deze procedure zorgt voor een basislijn waartegen om te beoordelen (1) de relevantie van deze muis model om progressieve MS en (2) het nut ervan voor het testen van therapieën die gericht zijn op de behandeling van progressieve neurologische aandoeningen zoals MS. Is duidelijk dat deRotarod prestatietest en actuele geoptimaliseerde testparameters en protocol zijn niet alleen nuttig bij het detecteren progressieve neurologische handicap in de TMEV-IDD muismodel, maar zijn ook bruikbaar bij het ontdekken stoornissen in andere virus-geïnduceerde en / of genetische muismodellen van neurodegeneratieve ziekten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierlijke werk maakt gebruik van protocollen beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) bij Geisel School of Medicine in Dartmouth.

1. De muismodel

  1. Inductie van TMEV-geïnduceerde demyelinisatie
    1. Verplaats de kooien met 4- tot 6-weken oude vrouwelijke SJL / Jhan muizen uit het rek naar een comfortabele werkruimte. Markeer de muizen (bijvoorbeeld met een oormerk of oor punch) mogelijk te maken voor individuele beoordeling van de klinische en histologische ziekte.
    2. Trekken 30 gl TMEV infecteren voorraad (2 x 10 6 plaquevormende eenheden; PFU) in PBS in een 29-gauge insuline spuit en naald.
    3. Bereid de anesthesie gas machine: het systeem te controleren op de aanwezigheid van voldoende hoeveelheden zuurstof en isofluraan voor de duur van de behandeling te verzekeren.
    4. Schakel de flowmeter 1 l / min. Plaats het dier in de inductie kamer en sluit de top. Zet de vaporizer tot 3,5% en het toezicht op het dier tot ligfiets.
    5. Verwijder het dier uit de kamer en test de muis door het afklemmen van de voetzool om adequate anesthesie te garanderen. Ontbreken van invloed van een sterk knijpen geeft geschikte anesthesie.
    6. Reinig de injectieplaats met 70% isopropylalcohol.
    7. Injecteer 30 pi TMEV infecteren bouillon in de rechter hersenhelft door Vrije injectie (figuur 1). De plaats van injectie is ongeveer halverwege tussen het oog en oor lijn en net voorbij de middellijn.
    8. Zet de muis om haar belang kooi eenmaal volledig alert en mobiele (meestal 3-5 min).
    9. Euthanaseren muizen door verbloeding of cardiale perfusie 3-6 maanden na infectie TMEV, afhankelijk van de snelheid van ontwikkeling van de ziekte.

2. Rotarod Analyse

  1. De Rotarod Apparatus
    1. Test muizen voorafgaand aan TMEV infectie om hen vertrouwd te maken met demachine en hun normale uitgangswaarde balans coördinatie en motorische controle te evalueren.
    2. Start de aanpassing protocol op -5 dagen na infectie (dpi, dat wil zeggen, 5 dagen voor TMEV infectie).
    3. Laat de muizen te wennen aan de testkamer gedurende tenminste 30 minuten voor Rotarod test, zodat ze wennen aan de omgeving.
    4. Zorg ervoor dat zowel de Rotarod eenheid en de computer zijn aangesloten en met elkaar verbonden (figuur 2).
    5. Vooraf ingestelde de Rotarod de -5 dpi scholingsprotocol parameters, zoals beschreven in Tabel 1.
    6. Sla het werk bestand met de datum en de identificatie-informatie.
    7. Verplaats de kooi met de ploeg te testen uit het rek naar een tafel naast de Rotarod. Muizen worden gewoonlijk getest in ploegen van 4.
    8. Pick-up een muis bij de staart en plaats het op de stang, met uitzicht op weg van de operator. Herhaal dit voor de tweede tot het vierde muis. Als een muis falls of springt, plaatst u deze terug op zijn rijstrook op de Rotarod totdat alle muizen in positie. Negeer eventuele muizen omdraaien naar de operator worden geconfronteerd.
    9. Na het laden van alle muizen, druk op de "Enter" knop om het experiment te starten. Let op de timers automatisch starten en de rotaties per minuut (rpm) op het display voor elke baan.
      1. Omdat elk dier uit de staaf valt, registreren de snelheid van de stang ten tijde van de val en de tijdsduur van het dier bleef op de stang. De stang zal blijven draaien tot het laatste dier is gedaald van de stang.
    10. Nadat alle muizen zijn gevallen, gebruik dan een tissue om eventuele fecale Boli en urine van de staaf te verwijderen. De aanwezigheid van urine en fecaal materiaal kan het vermogen van muizen om de grip stang beïnvloeden.
      1. Na een 3-minuten rust, geven de muizen een tweede en een derde poging. De maximale tijd per enkele proef is 240 sec. Dien in totaal 3 proeven tijdens elke testdag.
    11. Breng de muizen naar hun kooi en terug te keren ze terug naar het rek. Aan het einde van de experimentele sessie Rotarod reinigen met water en zeep en alle fecale materiaal te verwijderen uit de machine.
    12. Veeg de basisplaat met ethanol 70%. Spuit langs de gehele machine met chloordioxide te desinfecteren.
    13. Op dagen - 4 - 3 - 2, en - 1 pi, pre-set van de Rotarod met de juiste training protocol parameters, zoals beschreven in Tabel 1, en herhaal de stappen 2.1.2 tot 2.1.12.
    14. Na het behalen van de basislijn maatregelen, infecteren de muizen met TMEV. Laat een 6-daagse pi herstelperiode.
Protocol Testing Day Frequentie Startsnelheid (rpm) MaxSnelheid (rpm) Versnelling trials ITI
(rpm / sec) (N x sec) (min)
Opleiding - 5 dpi 1 dag 1 12 01/03 3x240 sec 3
- 4 dpi 1 dag 1 13 01/03 3x240 sec 3
- 3 dpi 1 dag 1 14 01/03 3x240 sec 3
- 2; - 1 dpi 1 dag 5 40 01/03 3x240 sec 3
experimenteel Van 7-50 dpi 2 weken 5 40 30/5 3x240 sec 3
Van 51-150 dpi 1 week 5 40 30/5 3x240 sec 3

Tabel 1: Rotarod Parameters in opleiding en experimentele protocollen.

  1. De Rotarod Experimenteel Protocol
    1. Op 7 dpi, vooringestelde de Rotarod met de juiste experimentele protocol parameters, zoals beschreven in Tabel 1. Herhaal stap 2.1.2 tot 2.1.10.
    2. Aan het einde van de proef # 3, weegt elke muis en maak een notitie van het lichaamsgewicht op de data sheet. Reinigen en ontsmetten van de Rotarod als per stappen 2.1.11 en 2.1.12.
    3. Test de muizen tweemaal per week gedurende de volgende 6 weken, zoals hierboven beschreven. Na 6 weken eenmaal per week (waarin de muizen waarschijnlijk bereikt een plateau fase) 8,9, test de muizen met dezelfde Experimental protocol. De werkelijke testprotocol duurt gemiddeld 150 dagen, afhankelijk van de specifieke cursus ziekte.
  2. Neurologische Functional Index
    1. Exporteer de ruwe data in een spreadsheet-bestand en de resultaten te analyseren.
    2. Express gegevens als looptijd (figuur 3A): dit is de normale looptijd plus de passieve rotatie tijd minus de rotatie vertragingstijd (tabel 2) 10. Bereken de gemiddelde looptijd van de drie proeven per dag.
    3. Express de gegevens als een neurologische functionele index (NFI; Figuur 3B).
      1. Bereken de basislijn prestaties drempel van elke individuele muis. De basislijn prestatiedrempel wordt bepaald als het gemiddelde van de looptijden van dag +15 tot + 45 pi 6,7.
      2. Bereken het NFI als het gemiddelde van de drie meest recente gemiddelde looptijden gedeeld door de basislijn prestaties drempel van die specifieke muis 6,7 </ Sup>.
        LET OP: Als de geteste looptijden voor een muis op dag + 72, + 76 en + 79 pi zijn 55 sec, 45 sec en 50 sec, en de basislijn tijd voor dezelfde muis was 135 sec, het NFI voor die muis op 79 dpi zal [(45 + 50 + 55) / 3] / 135 of 0,37 zijn.
    4. Express de gegevens als een aangepaste NFI (adjNFI Figuur 3C): het NFI gegevens aan te passen door een populatie waarde voor de enkel experiment.
      1. Bereken de adjNFI door het NFI waarde door de gemiddelde NFI verkregen door de sham-behandelde groep op die bepaalde dag te delen.
Termijn Definitie
Normaal looptijd De totale tijd dat de muis besteedt actief draait op de roterende staaf, dwz latentie te vallen.
Passieve rotatietijd De Amount van tijd dat de muis is gebleven op de staaf in de passieve rotatie-modus.
Rotatie vertragingstijd De hoeveelheid tijd de muis blijft de staaf tijdens de passieve rotatie modus
Passieve rotatie-modus Wanneer de muis grijpt de staaf en roteert zonder ambulate.
Totale sessietijd Totale tijd dat de muis blijft op de roterende staaf tijdens de sessie.
Baseline prestaties Pre-schade motor prestaties getoetst aan de minimale prestatie drempel te bepalen.
Neurologische functie index (NFI) Klinische index, die elke muis motor prestaties vergelijkt, dat wil zeggen, looptijd, op elk gewenst moment om zijn topprestaties.
Gecorrigeerd neurologische functie index (adjNFI) Wanneer een normalisatie proces wordt toegepast op NFI gegevens aan te passen door een populatie waarde voorde enkel experiment.
bevolking waarde Gemiddeld NFI waarde verkregen door de sham-behandelde groep op een bepaalde dag.

Tabel 2: Definities van Rotarod Parameters Aangenomen te kwantificeren neurologische stoornissen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit experiment was representatief voor de neurologische invaliditeit veroorzaakt door de Daniels (DA) stam en bonen stam van TMEV vergelijken. Ten behoeve van deze studie werd een groep van 32 vrouwelijke SJL-muizen intracraniaal TMEV geïnfecteerd met ofwel de DA stam (n = 16) of Bean stam (n = 16) en hun klinische symptomen werden gevolgd in de tijd. Een extra groep van 20 muizen werd sham behandeld (dat wil zeggen, zoutoplossing werd intracraniaal geïnjecteerd) en...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ondanks enkele beperkingen, de Rotarod performance test vormt een belangrijk instrument voor het beoordelen van de motorische functie en disfunctie in TMEV-IDD, evenals het effect van de farmacologische interventies op de progressie van invaliditeit bij muizen.

De Rotarod test werd voor het eerst beschreven in 1957 als een instrument voor het meten van neurologische afwijkingen bij knaagdieren 11. Knaagdieren moeten lopen op een roterende staaf, met toenemende draaisnelheid, en pr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs danken het personeel van het Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) aan Dartmouth voor hun deskundige zorg voor de muizen die voor deze studies zijn gebruikt. De auteurs danken ook Emily Clough voor haar uitstekende administratieve ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Mice SJL/JCrHsd 4 tot 6 weken oudEnvigo#052
TMEV virus stock
Isoflurane vaporizerHarvard Apparatus#340471
Insulin Syringes U- 100 29 g x 0,5 ccBD#328203
Rotamex-5 4 Lane Rota-Rod voor muizen met RS-232 en softwareColumbus Instruments#0890M

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lipton, H. L. Theiler's virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
  2. Pachner, A. R. A Primer of Neuroimmunological Disease. , Springer. New York. (2012).
  3. Rustay, N. R., Wahlsten, D., Crabbe, J. C. Assessment of genetic susceptibility to ethanol intoxication in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2917-2922 (2003).
  4. McGavern, D. B., Zoecklein, L., Drescher, K. M., Rodriguez, M. Quantitative assessment of neurologic deficits in a chronic progressive murine model of CNS demyelination. Exp Neurol. 158, 171-181 (1999).
  5. Zoecklein, L. J., et al. Direct comparison of demyelinating disease induced by the Daniel's strain and BeAn strain of Theiler's murine encephalomyelitis virus. Brain Pathol. 13, 291-308 (2003).
  6. Gilli, F., Li, L., Campbell, S. J., Anthony, D. C., Pachner, A. R. The effect of B-cell depletion in the Theiler's model of multiple sclerosis. J Neurol Sci. 359, 40-47 (2015).
  7. Li, L., et al. The effect of FTY720 in the Theiler's virus model of multiple sclerosis. J Neurol Sci. 308, 41-48 (2011).
  8. Homanics, G. E., Quinlan, J. J., Firestone, L. L. Pharmacologic and behavioral responses of inbred C57BL/6J and strain 129/SvJ mouse lines. Pharmacol Biochem Be. 63, 21-26 (1999).
  9. Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cerebr Blood F Met. 33, 330-338 (2013).
  10. Columbus Instruments Rotamex-5 Manual. , 1-33 (2005).
  11. Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. J Am Pharm Ass. 46, 208-209 (1957).
  12. Ulrich, R., Kalkuhl, A., Deschl, U., Baumgartner, W. Machine learning approach identifies new pathways associated with demyelination in a viral model of multiple sclerosis. J Cell Mol Med. 14, 434-448 (2010).
  13. Lynch, J. L., Gallus, N. J., Ericson, M. E., Beitz, A. J. Analysis of nociception, sex and peripheral nerve innervation in the TMEV animal model of multiple sclerosis. Pain. 136, 293-304 (2008).
  14. Pirko, I., Johnson, A. J., Lohrey, A. K., Chen, Y., Ying, J. Deep gray matter T2 hypointensity correlates with disability in a murine model of MS. J Neurol Sci. 282, 34-38 (2009).
  15. Oleszak, E. L., Chang, J. R., Friedman, H., Katsetos, C. D., Platsoucas, C. D. Theiler's virus infection: a model for multiple sclerosis. Clin Microbiol Rev. 17, 174-207 (2004).
  16. McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler's virus-induced demyelinating disease. Methods Mol Biol. 900, Clifton, N.J. 381-401 (2012).
  17. International Mouse Phenotyping Resource of Standardised Screens. , Available from: Rotarod. https://www.mousephenotype.org/impress/protocol/158/12 (2016).
  18. Bohlen, M., Cameron, A., Metten, P., Crabbe, J. C., Wahlsten, D. Calibration of rotational acceleration for the rotarod test of rodent motor coordination. J Neurosci Methods. 178, 10-14 (2009).
  19. Hopkins, M. E., Bucci, D. J. Interpreting the effects of exercise on fear conditioning: the influence of time of day. Behav Neurosci. 124, 868-872 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Rotarod TestNeurological DisabilityMouse ModelMultiple SclerosisTMEV InfectionBehavioral TestingMotor FunctionData AnalysisPerformance ThresholdNeurological Functional Index

Gerelateerde artikelen