Methodenartikel

In vivo studie van humane endotheliale-pericyte Interaction Met behulp van de Matrix Gel Plug Assay in Mouse

9.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54617

⸱

19 december 2016

 ,  ,  , 
1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, School of Medicine, Stanford University, 2Stanford Cardiovascular Institute, School of Medicine, Stanford University, 3VA Palo Alto Health Care System, Department of Cardiothoracic Surgery, School of Medicine, Stanford University

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een protocol voor humane endotheliale pericyte-interacties in muizen te bestuderen onder toepassing van een variatie van de matrix gel plug angiogenese assay.

Samenvatting

Angiogenesis is het proces waarbij nieuwe bloedvaten worden gevormd uit bestaande vaten. Nieuwe vaatgroei vereist gecoördineerde proliferatie, migratie en uitlijning van endotheelcellen om buisvormige structuren te vormen, gevolgd door de rekrutering van pericyten om wandondersteuning te bieden en de vatmaturatie te vergemakkelijken. Huidige in vitro celkweekbenaderingen kunnen het complexe biologische milieu waarin endotheelcellen en pericyten interageren om functionele vaten te produceren niet volledig reproduceren. We presenteren een nieuwe toepassing van de in vivo matrix gel plug test om endotheel-periccyte interacties en de vorming van functionele bloedvaten te bestuderen met behulp van muizen met een ernstige gecombineerde immuundeficiëntiemutatie (SCID). In het kort, matrixgel wordt gemengd met een oplossing die endotheelcellen bevat met of zonder pericyten, gevolgd door injectie in de rug van geanesthetiseerde SCID-muizen. Na 14 dagen worden de matrix gel plugs verwijderd, gefixeerd en gesneden voor histologische analyse. De lengte, het aantal, de grootte en de mate van periccytenbedeking van volwassen vaten (gedefinieerd door de aanwezigheid van rode bloedcellen in het lumen) kunnen worden gekwantificeerd en vergeleken tussen experimentele groepen met behulp van commerciële statistische platforms. Naast het gebruik als een angiogenesis test, kan deze matrix gel plug test worden gebruikt om genetische studies uit te voeren en als platform voor medicijnontdekking. Kortom, dit protocol zal onderzoekers in staat stellen om beschikbare in vitro tests aan te vullen voor de studie van endotheel-periccyte interacties en hun relevantie voor systemische of pulmonaire angiogenesis.

Inleiding

Angiogenese is het proces waardoor nieuwe bloedvaten worden gevormd uit een reeds bestaande vasculaire netwerk 1 en is het onderwerp van onderzoek in vele gebieden, variërend van normale ontwikkeling ziekten. Dit dynamische proces omvat de proliferatie en migratie van endotheelcellen (EC) en de aanwerving van pericytes een vasculaire buis die is gericht op de site die zuurstof en voedingsstoffen levering 2 moet construeren. Studeren vereist deze werkwijze een even dynamische test, vooral degene die de driedimensionale aard van vaatvorming kan herhalen. In vitro 3D matrix assays ontwikkeld om deze behoefte en goed gefunctioneerd om onderzoekers de discrete stappen in ruimte en tijd waarin angiogenese plaatsvindt 3, 4, 5, 6 definiëren. Echter, deze in vitro 3D matrixmodellen beperkt tot het bestuderen van niet-geperfuseerde vaten ind daarom geen kritische componenten die relevant zijn voor het proces van angiogenese (bijv circulerende groei en remmende factoren, onnatuurlijke spanningen / krachten over het vasculaire bed) en niet aan de complexe omgeving aanwezig in levend weefsel te simuleren. Om deze beperking te pakken zijn verscheidene in vivo angiogenese assays ontwikkeld 7, waaronder de matrixgel plug assay die de focus van ons rapport 8, 9 zijn.

De matrix gel plug test is een gevestigde in vivo angiogenese assay dat een beroep op de onderzoekers omdat het een robuust platform om de rol van de verschillende cellen en stoffen bij angiogenese te testen. Matrixgel is een commercieel verkrijgbare basaalmembraan oplossing die wordt afgescheiden door de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muizen sarcoma cellijn die stolt tot een gel-achtig materiaal bij 37 ° C. De gel matrix kan worden gemengd met cellen en / of stoffen, zoals groeifactoren en injesubcutaan cted in de muis. De gastheer EC zal de plug binnenvallen meer dan 14 dagen, vormen een vasculair netwerk, en raken perfusie met bloed van de gastheer. Tot op heden zijn matrixgel plug assays uitsluitend gericht op de studie van endotheelcellen gedrag tijdens angiogenese echter om ons beste weten geen inspanningen nog uitgevoerd om te bepalen of deze assay kan worden gebruikt voor co-kweek endotheelcellen en pericyten te bestuderen hoe deze twee celtypen interactie tijdens angiogenese. Specifiek, inzicht in de relatie tussen EC en pericyten is waardevol voor het bestuderen van ziekten waarbij bloedvat verlies pathologisch, waaronder microvasculaire ischemie en perifere vaatziekte 10, 11, 12.

We beschrijven een protocol dat humaan afgeleide pericytes introduceert de matrixgel mengsel samen met humane EC en fibroblast groeifactor (bFGF). Dit mengsel kan vervolgens subcutaan in het dorsale gedeelte van SCID muizen om de vorming van volledig functioneel, pericyte gecoat, hybride schepen toe te staan. Ons protocol beschrijft hoe matrix gel pluggen die humane EC met of zonder menselijke pericytes, plaatsing in SCID muizen en hoe de histologische secties voor kritische angiogenese eindpunten te analyseren voor te bereiden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Ethiek Verklaring: Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Stanford University School of Medicine.

LET OP: De dieren zijn onder verdoving met 3% verdamper isofluraan en 3% levering van O 2 gas. Het gebruik van vet zalf op de ogen kan helpen tot droog te voorkomen dat tijdens het onder narcose.

1. Celbereiding

  1. Groeien humane endotheliale en pericyte celkweken in 100 mm platen met 10 ml van de geschikte media. Vervang 10 ml vers medium om de 2-3 dagen tot cellen te bereiken 80% samenvloeiing.
    1. Kweek endotheelcellen (EC) in alle endotheliale celmedium (ECM) aangevuld met bedrijf leverde 5% foetaal runderserum (FBS), 10% penicilline / streptomycine en 10% endotheelcel supplement.
    2. Cultuur pericyten in volledige pericyte media (PM), aangevuld met bedrijf leverde 2% FBS, 10% penicilline / streptomycine en 10% pericyte groei supplement.
  2. Bereid cel mengsels
    1. Bereken het vereiste aantal cellen voor de experimentele en controlegroepen.
      OPMERKING: Elke plug in de experimentele groep bevat één miljoen (1 x 10 6) humane EC en tweehonderdduizend (2 x 10 5) pericytes. Voor de controlegroep, elke plug bevat slechts 1,2 miljoen menselijk EC. De negatieve controle groep heeft slechts matrix gel. Elke groep ten minste vier stekkers, die twee muizen vereisen pluggen kan worden geïnjecteerd in elke zijde van een muis onderrug. Drie connectors zouden dienen als triplo voor het experiment en de vierde kan worden gebruikt wanneer één uitvalt. Bereid 25% extra cellen om de extra volume van de gel aan te passen.
    2. Verzamelen en cellen tellen vanaf kweekplaten.
      1. Om cellen los, verwijder media en eenmaal wassen met kamertemperatuur 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijderen PBS, voeg 1 ml 0,25% trypsine / 2,21 mM EDTA, en incubeer gedurende 1 min. Was de cellen van de plaat door toevoeging van 2ml medium en het verzamelen in een 15 ml buis.
      2. Celtelling met een hemocytometer volgens de instructies van de fabrikant.
      3. Centrifugeer de geschikte aantal cellen in een korrel bij 400 xg gedurende 5 minuten. Voor de experimentele groep, centrifuge zowel EC en pericytes beneden samen in een pellet.

2. Matrix gelbereiding

  1. Ontdooien matrix gel volledig bij 4 ° C gedurende 4 uur of een nacht om een ​​homogene oplossing te verkrijgen. Mengen niet vereist.
  2. Aliquot matrix gel in 1,5 ml buisjes en bewaar bij 4 ° C.
  3. Pre-chill steriele 1,5 ml buizen en 28 G 1 cc insuline spuiten bij 4 ° C. Let op: Houd matrix gel op ijs te allen tijde.
  4. Meng koude matrixgel met bFGF in een volumeverhouding van 1: 100 (eindconcentratie van bFGF = 0,5 ug / ml; bFGF voorraadoplossing = 50 ug / ml) Na menging matrixgel oplossing en neer te pipetteren meerdere malen, incubeer op ijs gedurende 30 - 60 min before mengen met de cellen in stap 3,1.
    LET OP: Ontdooi de voorraad bFGF voor het mengen. Bereken het aantal pluggen nodig voor injectie. Bijvoorbeeld, elke plug vereist 200 pl matrix gel. Daarom bereiden 25% extra gel.

3. Meng Matrix Gel met cellen

  1. Voor elke groep, resuspendeer de celpellet (die geschikte aantal cellen) met de berekende hoeveelheid matrix gel met bFGF. Meng voorzichtig om schuimvorming te voorkomen en laat in de 15 ml buis op ijs tot muizen worden voorbereid voor injectie.

4. Mouse Voorbereiding

  1. Verdoven 1 SCID muizen gedurende 5 minuten in 3% Isofluraan plus 3% O 2 in een inductie kamer. Focus op een experimentele groep of 2 muizen per keer.
  2. Verwijder de muis uit de inductie kamer, plaats op een verwarmingselement ventrale zijde naar beneden en snel bevestig een snuit pijpje in het gezicht van de muis via een niet-rebreathing systeem om de anesthesie te leveren gedurende de Injectie procedure. Zet de gasstroom uit de inductie kamer naar de open systeem en laat de gasdruk tot 1,5% isofluraan en 1,5% O2.
  3. Verwijder haar van beide laterale achterste regio's (ongeveer 1 cm diameter) met een scheerapparaat of ontharingscrème.
  4. Veeg de huid met een 70% alcohol pad.
  5. Zet de muis om de inductie kamer en herhaal de stappen 4,2-4,4 met de tweede muis.

5. Matrix Gel Injection

  1. Bereid een muis voor injectie door het aanbrengen van de niet-rebreathing systeem en het op de verwarming pad ventrale zijde naar beneden.
  2. Laad de matrix gel in een voorgekoeld 28 G 1 cc insulinespuit één muis tegelijk.
    1. Laad de volledige 500 pl volume matrixgel twee pluggen (200 gl per plug plus 25% extra) in de spuit.
    2. Zorg ervoor dat de matrix gel in de muizen te injecteren binnen 3 minuten van het laden van de cellen in de spuit om de ce voorkomenlls van de afwikkeling naar de kant van de spuit en te voorkomen matrixgel stollen binnenzijde van de spuit.
  3. Til de achterkant huid om subcutane ruimte te vinden, dan injecteer 200 ul van de matrix gel langzaam en gelijkmatig in de subcutane ruimte van de achterkant posterior van de ribbenkast.
  4. Verwijder de injectienaald langzaam en voorzichtig om te voorkomen dat matrix gel lekt uit de injectieplaats. Een bult zal vormen op de injectieplaats. Veeg de injectieplaats met een doekje met alcohol.
  5. Tweede injectie stappen 5,2-5,5 aan de andere kant van de rug muis, laat de muis op de rug voor 1 min tot gelering van de gel matrix op het vuur pad mogelijk.
  6. Schetsen beide bulten met behulp van een permanent marker om de bult te identificeren na 14 dagen. Na wat haar terug groeit, zal het makkelijker zijn om de bult te vinden.

6. Matrix Gel Plug Isolatie: 14 dagen na de injectie

  1. Euthanaseren de muizen op humane wijze door het blootstellen van het diers tot> 5 min van inhalatie van kooldioxide, gevolgd door cervicale dislocatie gedood verzekeren.
  2. Verwijder de matrix gel stekker uit de rug van de muis.
    1. Verwijder voorzichtig regrown haar rond de plaats van injectie, waar de stekker zich bevindt, herhaalt u stap 4.3. De markering lijn geeft het formaat van het origineel bult onder de huid.
    2. Uitsnijden de plug samen met de omringende huid en spierlagen bevestigd aan de boven- en onderkant van de plug respectievelijk.
      1. Met behulp van fijne chirurgische schaar, een insnijding op de gemarkeerde rand van de plug die loodrecht op de huid en doorsnijden de spieren onder de plug. Vervolgens knip voorzichtig rond de omtrek van de plug op de gemarkeerde rand.
      2. Trek de stekker, het houden van het ingeklemd tussen de huid en spieren lagen. Onmiddellijk spoelen in een kleine beker met 1x PBS weg te wassen overtollige bloed. De plug kan nu worden vastgesteld (volgende stap 6,3).
  3. Bevestig de plug in 4% paraformaldehyde.
    1. Plaats het gehele plug met schil en spierlagen, in een 50 ml buis met 25 ml 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur bij kamertemperatuur zonder schokken. De volgende dag, de overdracht van de stekker in 25 ml 70% ethanol nog 24 uur voor inbedden in paraffine.
      OPMERKING: ga paraformaldehyde met de nodige voorzichtigheid. Draag handschoenen.

7. Paraffine Verwerk de Matrix Gel Plug

  1. Maak de stekker voor paraffine inbedding.
    1. Richt de stekker zoals weergegeven in figuur 1a; de stekker in een weefselcassette dat de zijde van de stekker naar boven en zowel de huid als spierlagen zichtbaar over het oppervlak van het weefsel blok dat eerst wordt gesneden tijdens het snijden.
  2. Paraffine insluiten de stekker volgens standaard paraffine inbedding protocollen 13.
  3. Snijd 8-10 urn dik secties af van het weefsel blok en monteren op microscoopglaasjes AccorDing standaard paraffine snijden protocollen 13.
  4. Bewaar de dia's in een koele en droge plaats bij kamertemperatuur totdat klaar voor kleuring.

8. Stain secties met hematoxyline en eosine Stain (H & E) 13

  1. De-paraffinize de weefselcoupes door het passeren van de dia's door 100% xyleen tweemaal, 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol en tenslotte 1x PBS, elk gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Laat objectglaasjes in 1x PBS tot de volgende stap.
  2. Pipet 100 pi H & E oplossing op de sectie en incubeer gedurende 1-5 min, of totdat er een duidelijke contrast tussen blauw kernen en roze cytoplasma in een cel als bekeken onder een rechtopstaande lichtmicroscoop bij 10x vergroting. Wees voorzichtig niet te laten H & E oplossing te raken de doelstelling.
  3. Wash H & E oplossing off van de dia door dunking de dia in een grote beker van leidingwater, plaats dan de dia in een rek in de beker en spoelen met stromend water gedurende 2 minuten.
  4. Move stap 9.8 op de objectglaasjes monteren.

9. Stain Andere Slides for Human haarvaten en pericytes

  1. De-paraffinize de weefselcoupes door het passeren van de dia's door 100% xyleen tweemaal, 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol en tenslotte 1x PBS, elk gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Laat objectglaasjes in 1x PBS tot de volgende stap.
  2. Kook de secties in antigen retrieval oplossing.
    1. In een 2 L beker bereiden kokende antigeenterugtrekking oplossing met 1 x citraatbuffer (pH 7,0) bij 95 ° C op een verwarmingsblok.
    2. Eenmaal koken, plaats de dia's in een metalen rek en onder te dompelen in de kokende antigen retrieval oplossing gedurende 20 min.
    3. Haal het bekerglas van de verwarming blok met de glijbanen nog steeds onder water en laat de oplossing langzaam terug naar kamertemperatuur gedurende ongeveer 30 min.
    4. Plaats de dia's in 1x PBS tot de volgende stap.
  3. Blokkeer de secties in het blokkeren van buffer (1x PBS, 5% Goat Serum, 00,3% Triton X-100).
    1. Teken een hydrofobe cirkel rond de randen van elke sectie met een PAP pen.
    2. Plaats de objectglaasjes in een vochtige bak met gedestilleerd water op de bodem van de bak.
    3. Pipetteer 100 ui blokkerende buffer op de secties zorgt ervoor dat alle van het weefsel is bedekt met vloeistof (kan meer dan 100 ul vereist).
    4. Incubeer secties met blokkerende buffer gedurende 1 uur.
  4. Incubeer secties met primair antilichaam.
    1. Bereid een oplossing met twee primaire antilichamen de verschillende onderdelen voor CD31 (EC) en gladde spier actine (pericyten) verdund in verdunningsbuffer (1 x PBS, 1% BSA, 0,3% Triton X-100) probe.
      OPMERKING: Hier, anti-CD31 concentratie 01:50 en anti-gladde spier actine concentratie 1: 300.
    2. Incubeer de secties overnacht bij 4 ° C met 100 gl primaire antilichamen in een vochtige bak met gedestilleerd water.
  5. Was de dia driemaal 1x PBST (1x PBS + 0,1% TweEN20) gedurende 5 minuten elke wasbeurt.
  6. Incubeer secties met secundair antilichaam.
    1. Bereid een oplossing met een fluorofoor geconjugeerd geit anti-konijn secundair antilichaam aan het anti-CD31 antilichaam van konijn verdund in verdunningsbuffer herkennen.
      1. OPMERKING: De gladde spier actine primaire antilichaam is geconjugeerd met een al CY3 fluorofoor, dus geen secundair antilichaam kleuring nodig. Goat-anti konijn secundair concentratie antilichaam 1: 250.
    2. Incubeer de secties gedurende 1 uur met 100 ul secundair antilichaam in de luchtvochtigheid bak met gedestilleerd water.
  7. Was de dia's drie keer in 1x PBST gedurende 5 minuten elke wasbeurt.
  8. Monteer de dia's.
    1. Pipetteer 2-3 druppels (~ 40 - 60 pl) van antifade bevestigingsoplossing met DAPI kleuring van kernen op elke sectie.
    2. Plaats voorzichtig een nee. 1,5 dekglas via secties en montage oplossing, waardoor de vloeistof verspreid over de delen en de randen vanhet deksel slip. Voorzichtig gebruik van een vinger uit te drukken luchtbellen die over de sectie kan worden gevestigd.
    3. Laat de dia's drogen gedurende ten minste 1 uur voordat het.

10. Kwantificeer capillaire dichtheid en structuur 14

  1. Tel het aantal capillairen in H & E gekleurde coupes, uitgedrukt als # / mm 2.
    1. Verwerven foto's van vier verschillende velden op een rechtopstaande lichtmicroscoop onder 40x vergroting.
      OPMERKING: Haarvaten geïdentificeerd als buizen gevuld met rode bloedcellen.
    2. In plaats van handmatig tellen capillairen gebruikt beeldanalyse software (bijv Wimasis Image Analysis) om verschillende parameters zoals angiogenese vaartuignummer, gemiddelde duur vaartuig en diameter, en vertakkingspunten kwantificeren.
  2. Analyseer capillaire structuur in immunofluorescentie-gekleurde coupes.
    1. Verwerven foto's van vier verschillende velden op een omgekeerde fluorescentiemicroscoopmet FITC en TxRed filter kubus.
      1. Gebruik een FITC kubus afbeelding EC door excitatie bij 488 nm golflengte en gebruik een TxRed kubus afbeelding pericyten door excitatie bij 594 nm golflengte.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Vertegenwoordiger H & E en immunofluorescentie kleuring van matrix gel plug secties worden weergegeven in figuur 2. De artikelen van EG uitsluitend stekkers weer enkele schepen die meestal niet worden geperfuseerd met bloed (Figuur 2 linksboven, zwarte pijlen), terwijl pluggen die zowel EC en pericytes tonen verschillende geperfundeerde schepen met grotere diameters en complete pericyte dekking, zoals blijkt uit de positieve SMA kleuring direct grenz...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De matrix gel plug bepaling blijkt een gemakkelijke en krachtige methode om genregulatie in angiogenese, angiogene en anti-angiogene verbindingen in vivo te evalueren en in vitro testen kunnen vullen. Hier beschrijven we in detail een nieuwe matrix gel plug assay van humane angiogenese die de interactie tussen endotheliale cellen en pericyten onderzoekt bij bloedvatvorming.

Er zijn een paar nieuwe en kritische stappen in dit protocol. Cellen in lage passage (passage 1-4) de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen concurrerende financiële belangen inbegrepen.

Dankbetuigingen

Dr. K. Yuan werd ondersteund door een American Heart Association Scientist Development Grant (15SDG25710448) en de Pulmonary Hypertension Association Proof of Concept Award (SPO121940). Dr. V. de Jesus Perez werd ondersteund door een carrièreontwikkelingsaward van de Robert Wood Johnson Foundation, een NIH K08 HL105884-01 award, een Pulmonary Hypertension Association Award, een Biomedical Research Award van de American Lung Association en een Translational Research and Applied Medicine award van Stanford University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PBS (Phosphate buffered saline)Corning21-031-CV
0.25% Trypsin/0.53 mM EDTACorning25-053-CI
Endothelial Cell Media (ECM) kitSciencell1001includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
Pericyte Media (PM) kitSciencell1201includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
primary human pulmonary microvascular endothelial cellsPulmonary Hypertension Breakthrough Initiativethis cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4
primary human pulmonary pericytesPulmonary Hypertension Breakthrough Initiativethis cell type is not available commercially, but brain paricytes are.  Cells used at passage 1-4
bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)Peprotech100-18Bstock solution is 50 µg/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 µl and stored at -20 degrees
Matrigel Basement Membrane MatrixBD356237
28 G 1 cc Insluin SyringeBD329410
SCID (Severe Combined Immune Deficiency) miceThe Jackson Laboratory5557NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age
1.5 ml microcentrifuge tubes, sterileThermo Fisher Scientific05-408-129
15 ml screw top tubes, sterileBD Biosciences352096
PAP penLife Technologies8899
hemocytometerThermoFisher Scientific02-671-6
Nair hair removal creamWalmart
anti-human CD31 primary antibodyLifeSpan BiosciencesLS-B4737working solution is 1:50
anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibodySigmaC6198working solution is 1:300
goat anti-rabbit secondary antibody; 488/greenThermoFisher ScientificA-11008working solution is 1:250
Prolong Gold DAPI solutionCell Signaling8961S
microscope slidesVWR48300-047
no. 1.5 cover slipsThermo Fisher Scientific12-544-D
citrate buffer 10xMillipore21545
extra fine surgical scissorsFine Science Tools14084-08
Formalin (paraformaldehyde)Thermo Fisher Scientific245-685
Tissue cassettesSimportM492-12
goat serumDakoX0907

Referenties

  1. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  2. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The role of pericytes in angiogenesis. Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).
  3. Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 83-101 (2008).
  4. Liu, Y., Senger, D. R. Matrix-specific activation of Src and Rho initiates capillary morphogenesis of endothelial cells. FASEB J. 18 (3), 457-468 (2004).
  5. Grant, D. S., et al. Interaction of endothelial cells with a laminin A chain peptide (SIKVAV) in vitro and induction of angiogenic behavior in vivo. J Cell Physiol. 153 (3), 614-625 (1992).
  6. Madri, J. A., Pratt, B. M., Tucker, A. M. Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-beta depends upon the composition and organization of the extracellular matrix. J Cell Biol. 106 (4), 1375-1384 (1988).
  7. Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Cheresh, D. A. Use of the 10-day-old chick embryo model for studying angiogenesis. Methods Mol Biol. 129, 257-269 (1999).
  8. Yuan, K., et al. Activation of the Wnt/planar cell polarity pathway is required for pericyte recruitment during pulmonary angiogenesis. Am J Pathol. 185 (1), 69-84 (2015).
  9. Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137 (10), 4511-4513 (1996).
  10. Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem Cells. 31 (2), 305-316 (2013).
  11. Richards, O. C., Raines, S. M., Attie, A. D. The role of blood vessels, endothelial cells, and vascular pericytes in insulin secretion and peripheral insulin action. Endocr Rev. 31 (3), 343-363 (2010).
  12. Ricard, N., et al. Increased pericyte coverage mediated by endothelial-derived fibroblast growth factor-2 and interleukin-6 is a source of smooth muscle-like cells in pulmonary hypertension. Circulation. 129 (15), 1586-1597 (2014).
  13. Buchwalow, I. B., Bocker, W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 1-153 (2010).
  14. Tata, D. A., Anderson, B. J. A new method for the investigation of capillary structure. J Neurosci Methods. 113 (2), 199-206 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

In vivo angiogenesemenselijke endotheelcellenparasitaire celkweekSCID muismodelhistologische analysepericytenbedekkingvatrijpingbloedvatvorming

Gerelateerde artikelen