Toepassing van Waterdicht Barrières In combinatie met de kandidaat-Factor Soaked Beads om Inductive Signalen studie in de Chick

Samenvatting

Protocollen die ondoordringbare barrières gebruiken om inductie-evenementen te blokkeren tussen weefsels van de hoofdlichaamsas en de flank in het kippenembryo, die nodig zijn voor ledeformatie, worden beschreven. Kralen gedrenkt in kandidaat-inductieve signalen worden gebruikt om het effect van barrièreplaatsing te overwinnen en analyse van genexpressie bevestigt dit.

Samenvatting

De kippenembryo biedt een prachtig gewervelde model dat gebruikt kan worden om de ontwikkeling vragen op een directe manier te ontleden. De toegankelijkheid en de robuustheid na chirurgische ingreep zijn de belangrijkste experimentele sterke punten. Mica platen waren de eerste barrières gebruikt om chick ledematen knopaanleg ¹ te voorkomen. Protocollen die aluminiumfolie gebruiken als een ondoordringbare barrière voor vleugel bud of been knop inductie en of inleiding beschreven. Wij combineren deze techniek met kraal plaatsing lateraal van de barrière om het aanbod kandidaat endogene factoren die zijn geblokkeerd door de barrière exogeen. De resultaten worden geanalyseerd door in situ hybridisatie van latere genexpressie. Onze belangrijkste focus ligt op de rol van retinoïnezuur signalering in de inductie en latere opening van het kippenembryo voor- en achterbeen. Wij gebruiken BMS 493 (een inverse agonist van retinezuur receptoren (RAR)) geweekte korrels geïmplanteerd in de laterale plaat mesoderm (LPM) om het effect van een bar nabootsenrier geplaatst tussen de somieten (een bron van retinoïnezuur (RA)) en de LPM waaruit ledemaatknopen groeien. Gemodificeerde versies van deze protocollen kunnen ook worden gebruikt om andere vragen over de oorsprong en de timing van inductieve signalen pakken. Mits het gebied van het kippenembryo is toegankelijk op het betrokken ontwikkelingsstadium kan een barrière worden geplaatst tussen de twee weefsels en veranderingen in de ontwikkeling bestudeerd. Voorbeelden zijn te vinden in de zich ontwikkelende hersenen, as uitbreiding en orgaanontwikkeling, zoals lever of de nieren inductie.

Inleiding

Classical embryologen oudsher gebruikt fysieke technieken om de mechanismen die de embryonale ontwikkeling te ondervragen. In de jaren 1960 en 1970 ontwikkeld onderzoekers technieken ondoordringbare barrières ingevoegd tussen weefsels van het ontwikkelende embryo om het belang van inductieve signalen tonen tijdens embryogenese gebruikt. Onze interesse is in gewervelde ledematen ontwikkeling en in het bijzonder welke gebeurtenissen voorafgaan ledematen bud uitgroei. Zo kan aanbrengen van een barrière voorkomen ledemaatknop uitgroei optreedt aan één zijde van het kippenembryo terwijl deze normaal gaan van de contralaterale, niet geopereerde zijde. Materialen die worden gebruikt om deze barrières gevarieerd te maken; bijvoorbeeld, mica platen ¹ en tantaal folie ^2. Deze belemmeringen effectief scheiden de laterale plaat mesoderm (LPM), waaruit de ledemaatknop vormen van de somieten gevormd uit de paraxiale mesoderm. Chirurgische enten technieken aan te tonen dat nauwe samenwerking with de somieten is essentieel onderdeel knopaanleg moet plaatsvinden in de LPM ^{3 4.} In de jaren '80 en '90 ontdekten ontwikkelingsstoornissen biologen diffundeerbare signaalmoleculen die essentieel zijn bij de bestrijding van ontwikkelingsprocessen zijn. Kralen gedrenkt met deze signaalmoleculen kunnen worden geïmplanteerd in specifieke gebieden van het embryo en veranderingen produceren embryonale ontwikkeling. Zo wordt retinoïnezuur (RA) door ionenuitwisseling parels die afgegeven gedurende een periode van 24 uur na implantatie in een kippenembryo en kunnen spiegelbeeld duplicatie van de cijfers ⁵ produceren. Heparine acrylkralen met FGF-eiwit kan ledematen bud uitgroei te leiden uit de tussen ledematen LPM ^6.

Meer recent muis en vis genetica hebben de studie van gewervelde ledematen inwijding genomen in een nieuw tijdperk (beoordeeld in ^7). Er zijn duidelijke aanwijzingen dat de RA in de somieten voorafgaand aan ledematen bud initiatie is het van essentieel belang diffundeerbare signaal vereist door de LPM om ledematen Budding initiëren. We wilden de toegankelijkheid en experimentele robuustheid van het kippenembryo benutten om het effect barrière implantatie op genexpressie ontleden in de LPM rond de tijd van ledemaatknop initiatie. Een nieuwe aanpassing van onze methode is om een ​​barrière te combineren dat blokkeert signalen van axiale weefsels kraal plaatsing lateraal van de belemmering van exogeen supply kandidaat endogene factoren die zijn geblokkeerd door de barrière. De volgende protocollen die zijn ontwikkeld om plagen uit de mechanismen van de ledematen bud inductie en initiatie.

Studeren ledematen bud initiatie betekent het gebruik van een vroeg stadium embryo's. Veel onderzoekers window kippeneieren door eerst een deel van de albumine door de lucht zak met een injectienaald. Het embryo, dat ligt bovenop de dooier, lager liggen dan in het ei. Dit is een voordeel voor een aantal technieken, zoals elektroporatie, maar kan een nadeel zijn als operatieve manipulatie van het embryo gewenst.We vinden dat het embryo zo dicht mogelijk bij de opening in het ei mogelijk is een voordeel.

Vragen blijven over de signalen die gewervelde ledematen knop inductie en initiatie te controleren en de volgende protocollen geschikt zijn om ze aan te pakken. Wij zijn de eerste om een protocol voor het inbrengen van de belemmeringen voor kuiken ledematen bud uitgroei in een stadium eerder dan fase 12 ⁸ voorkomen ontwikkelen. Gemodificeerde versies van deze protocollen kunnen ook worden gebruikt om andere vragen over de oorsprong en de timing van inductieve signalen te bieden waarin een toegankelijke inducerende weefsel ligt naast het primordium geïnduceerd. Mits het gebied van het embryo te bereiken op de desbetreffende ontwikkelingsfase dan een barrière kunnen worden geplaatst tussen de twee weefsels en veranderingen in de ontwikkeling bestudeerd. Voorbeelden kan men in hersenontwikkeling, as uitbreiding en eventueel orgaanontwikkeling zoals lever of de nieren inductie.

Protocol

Het volgende protocol gebruikt kippenembryo's minder dan tien dagen incubatie. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de King's College in Londen, het Verenigd Koninkrijk en het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken richtlijnen voor de verzorging van dieren.

1. Voorbereiding vereist voor Embryo Operation Chick

1. Verzamel de volgende chirurgische instrumenten die nodig zijn voor de operaties, voor het oogsten en voor de vaststelling van de kippenembryo's: Twee paren No. 5 horlogemakers pincet, een paar sterke tang, bijvoorbeeld, type AA, gebogen scharen met bladen 2,5 cm lang, stomp gebogen pincet met eindigt circa 0,5 cm lang, en ook twee paren van No. 4 horlogemakers een tang om te gebruiken tijdens het maken van folie barrières (1.6.3).
2. Maak een micro mes uit een stalen pin (0,3 mm in diameter) aangescherpt met behulp van olie op een slijpsteen. Met behulp van een binoculair microscoop, verscherpen de punt van de pen op een platte. Plaats de pin in een naaldhouder en zijn scherpe uiteinde te beschermen tegen geklopt en dented.
   LET OP: omhullingen het mes met een 1000 ui pipet tip is een eenvoudige optie voor deze.
3. Bereid 70% ethanol in een plastic spuitfles. Gebruik een spuit dit op een papieren tissue op de chirurgische instrumenten en de micro mes afvegen voor en na gebruik te steriliseren en reinigen.
4. Koop 5 cm breed duidelijke plakband en een geschikte dispenser. Vind of vervaardiging van een rust geschikt is om een ​​kippenei stevig op zijn kant te houden.
5. Maken en op te slaan oplossingen voor het weken kralen.
   1. Bereid een 0,35 mg / ml oplossing van Fibroblastengroeifactor 4 (FGF4) proteïne uit 1 mg / ml bevroren voorraad door verdunnen met water en bewaar bij -20 ° C in 30 pi aliquots.
   2. Bereid oplossingen (ofwel 0,05 of 0,1 mg / ml) van all-trans-retinoïnezuur (RA) verdund met dimethylsulfoxide (DMSO) in donkere microcentrifugebuizen van een 5 mg / ml voorraad. Bewaar de bouillon en 100 ul fracties bij -20 ° C.
   3. Bereid oplossingen (hetzij 2,5 of 5 mg / ml) van BMS 493 (een inverse agonist van RAR) verdund met DMSO in donkere microcentrifugebuizen van een 10 mg / ml voorraad. Bewaar de bouillon en 100 ul fracties bij -20 ° C.
6. Maak barrières van aluminiumfolie.
   LET OP: De folie wordt gebruikt om de barrières te maken is standaard catering folie (gemeten door micrometer als 0,013 mm dik). Elke binnenlandse aluminiumfolie zou waarschijnlijk geschikt.
   1. Snij een 1 cm vierkant stuk aluminiumfolie en steriliseren schoon met 70% ethanol op een tissue. Plaats het op een 6 cm steriele plastic petrischaal. Gooi het deksel en maak een deksel voor het gerecht uit folie.
      LET OP: Dit voorkomt dat de cut barrières van later vasthouden aan de plastic deksel van de schaal als gevolg van statische.
   2. Plaats de petrischaal op een trap graticule (1 cm lang verdeeld in 100 delen) onder een binoculaire microscoop met vergroting op 1,6X. Met behulp van een No.15 mes kleine scalpel, snijd stroken van de folie om een exacte breedte, bijvoorbeeld, 0,7 mm of 1,3 mm.
   3. Scheid de foliestrips met behulp van twee paren van No. 4 horlogemakers pincet. vervolgens een haakse bocht in het midden van de folie afsluiting zodanig dat het lijkt op een scharnier van de bepaalde breedte.
      LET OP: Deze vorm van de barrière wordt genomen uit ^{9, 10.} Een scharnierende barrière op zijn plaats blijft beter dan een rechte, vlakke barrière. No. 4 forceps relatief stompe en worden gebruikt omdat ze minder waarschijnlijk deuken of groeven te maken in de folie barrières.
   4. Line-up van de barrières in het midden van de petrischaal met de ene kant plat tegen het gerecht en de andere wijzen omhoog uit de schotel, het verplaatsen van de overgebleven uncut folie aan de ene kant. Bereid 20 of meer barrières voor de operatie dag. Plaats de folie deksel op de schaal en bewaar de barrières op een plaats waar ze niet zullen worden verstoord.
      OPMERKING: Zelfs een lichte klop kan de barrières kantelen of zeggen dat ze vasthouden aan statische aan de zijkanten van het gerecht.
7. Incubeer bevruchte kippeneieren op hun kant op karton eidienbladen bij 38 °C voor de juiste lengte van tijd voordat de werking de dag, zodanig dat de embryo's zal worden op het gewenste ⁸ podium.

2. Voorbereiding van de kippenembryo's en parels op Operation Day

1. 'Window' bebroede kippeneieren.
   LET OP: De volgende methode voor het openen van eieren werd doorgegeven door Dennis Summerbell (niet gepubliceerd).
   1. Met het ei liggend op zijn kant, doorboren het stompe einde (luchtzak einde) van het ei met type AA sterke tang om ervoor te zorgen dat de binnenschil membraan is verbroken. Om dit te begrijpen de tang stevig tegen elkaar te doen en gebruik maken van een gecontroleerde stekende beweging terwijl het ei met de vrije hand.
   2. Neem het ei, nog steeds op zijn kant, in beide handen (één aan weerszijden) om 180 ° langs de horizontale as en plaats het in het ei lade zodat de zijde die bovenste was nu naast de lade.
      Let op: dit lost het embryo uit de schelp membranen en zal betekenen dat het embryo is less waarschijnlijk te snijden wanneer het reservoir boven het embryo wordt verwijderd.
   3. Neem een ​​stukje doorzichtige tape ongeveer 5 cm in het vierkant en plak dit nauwlettend in de bovenste oppervlak van het ei aan de eierschaal stoppen afbrokkelende op het embryo wanneer het ei wordt geopend.
   4. Gebruik de gebogen schaar om voorzichtig breken door de schaal en de membranen in het midden van het bovenste deel van het ei, maak een klein gaatje met een blad van de schaar zodat de lucht het ei via embryo (dat ligt net onder kan komen het bovenste deel van de shell).
      Opmerking: Door gewoon breken de schaal membranen en breken niet een van de membranen die het embryo, lucht die het ei zal het embryo van de mantel van de houder te scheiden en het embryo tot rust komen bovenop de dooier ongeveer 0,5-1 cm .
   5. Gebruik de gebogen schaar om het gat in de schaal uitbreiden met een cirkel met een diameter van ongeveer 1 cm. Verwijder het stukje uitgesneden shell en bedek het gat in het ei met eenstuk doorzichtige tape ongeveer 5 cm in het vierkant. Om deze band gemakkelijk verwijderen, drukt u op de tape om het te plakken alleen aan de rand van het gat, waardoor de resterende bandlengte gratis. De gratis tape kan dan worden aangegrepen om het ei te ontsluiten.
2. Stage embryo
   1. Na incubatie bij 38 ° C (zie stap 1.7) en window (stap 2.1), gebruik maken van een binoculair microscoop om de kippenembryo's te organiseren op basis van ^8. Doe dit net voor de eieren worden afgesloten volgende window. Schrijf het stadium van elk embryo over de eierschaal. Zet de eieren in de incubator.
      LET OP: embryo's in etappes tussen de 8 en 15 zijn geschikt voor barrière en kralen experimenten. De embryo's hebben meer kans om te overleven als ze niet uit de incubator gelaten te lang voorafgaand aan de operatie.
3. Inweken kralen voorafgaand aan de operatie.
   1. FGF4
      1. Neem het aantal affiniteitschromatografie gelparels (150-300 pm) die zich aan het uiteinde van een 1000 pi pipetpunt en wash ze in 1 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een microcentrifugebuis aan het azide ze in. Centrifuge bewaard 5 sec verwijderen, gooi de PBS en tweemaal het proces herhalen.
      2. Laat de gel parels in een 30 ul druppel van 0,35 mg / ml FGF4 eiwit op een steriele petrischaal op ijs gedurende 30 min. Extra kralen ongeveer 150 micrometer in diameter met No. 5 microforceps ingebracht in het embryo.
         OPMERKING: ga ionenuitwisselende harskorrels in de volgende stappen No. 5 microforceps en grip ze zeer voorzichtig omdat de kralen zijn bros en kan breken als te strak geperst. Deze waarschuwing geldt voor 2.3.2-2.3.3 en alle hars kraal operaties.
   2. RA
      1. Ontdooien een hoeveelheid van 0,05 of 0,1 mg / ml all-trans-RA verdund met DMSO en plaats een 100 ul druppel op een steriele petrischaal (9 cm diameter), die vooraf is bedekt met folie en de RA bescherming tegen licht. Neem een ​​10 ul pipet tip en pick-up enkele chloride-vorm ionenwisselingharskorrels op zijn achterkant en genieten die in de RA daling beschermd tegen licht bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
      2. Spoel de kralen in drie opeenvolgende druppels van 100 pl Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) dat in dezelfde petrischaal minimaal 1 cm.
         LET OP: De kralen nemen van de fenol rode kleurstof uit de DMEM. Deze methode is gebaseerd op ^5.
      3. Extra kralen ongeveer 100 micrometer in diameter (bolletjes variëren in grootte 75-180 gm wanneer nat) voor inbrenging in het embryo, microscopisch stadium graticule dia onder het petrischaaltje No.5 microforceps aan de korrels te houden. Bij het ophalen van de kraal van de 100 ul druppel van DMEM, in de eerste plaats de kraal naar beneden op de petrischaal en verwijder alle resterende DMEM van het ofwel door op de hiel uit de drop of door het plaatsen van de gesloten tang naast de kraal (capillaire actie trekt de vloeistof weg van de kraal).
   3. BMS 493
      1. Als voor de RA (2.3.2), geniet ion exchange harskorrels in een 100 ul druppel van 2,5 of 5,0 mg / ml BMS 493 in DMSO bij kamertemperatuur gedurende 20 min spoel in 100 ul DMEM druppels. Extra kralen ongeveer 100 micrometer diameter voor inbrenging in het embryo.
   4. DMSO controle
      1. Wat de RA (2.3.2), geniet ionenuitwisselende harskorrels in een 100 ul druppel DMSO bij kamertemperatuur gedurende 20 min spoel in 100 ul DMEM druppels. Extra kralen ongeveer 100 micrometer diameter voor inbrenging in het embryo.

3. Barrier en Bead Operations

Figuur 1. Schema van kippenembryo's van verschillende stadia zien waar Barrières en of kralen moet worden geplaatst. (A) Stage 13 kippenembryo schematische weergave barrière positie (groene lijn) tussen somieten en LPM aan het presumptieve wing-niveau (somieten 15-20). (B) Hetzelfde schema als in (A) te geven waarbij RA kraal (rode cirkel) voorafgaand aan insertie barrière worden geplaatst. (C) Schematische vertoning barrière positie (groene lijn) op de vermoedelijke been niveau (somieten 26-32) in een fase 15 embryo. (D) hetzelfde schema als in (C), aangegeven waar RA kraal (rode cirkel) worden ingeschreven. (E) Schematische aangegeven waar BMS 493 kralen (paars cirkels) in de LPM moet worden geplaatst van een podium 15 embryo. (F) Schematische weergave van een etappe 9 kippenembryo aangeeft barrière positie (groene lijn) tussen de presomitische mesoderm en LPM op de vermoedelijke vleugel niveau. (G) Schematische weergave van een etappe 9 embryo toont de posities van een barrière (groene lijn) en RA kraal (rode cirkel). (H) Schematische weergave van een etappe 10 kippenembryo tonen barrière positie (groene lijn) op de vermoedelijke been niveau. (I ) Schematische weergave van BMS 493 kraal positie (paarse cirkel) in fase 10 been niveau LPM. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van ^7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Barrier ingevoegd op stadium 13 tot vleugel bud initiatie te voorkomen.
   1. Neem een ​​podium 13 embryo uit de incubator en plaats het ei op een ei rust onder een binoculair microscoop ingesteld op 3,2X vergroting of hoger indien gewenst. Verwijder de bovenste laag doorzichtige tape.
      1. Met een stalen micro mes een insnijding door het vitelline membraan en laterale plaat mesoderm (LPM) nabij somieten 15 tot 20 (Figuur 1A) aan de rechterzijde van het embryo (somieten niet allemaal gevormd in dit stadium). Snijd grenzend aan de laatste vier somieten gevormd en blijven de snede twee somite lengtes caudaal.
      2. Pak de barrière (0,7-1 mm breed) met No. 5 microforceps eind uitsteekt uit het petrischaaltje draai de hand om het vrije einde van de barrière in de incisie te voegen. Het scharnier gevormde barrière vlak op de vitelline membraan boven de LPM met de helft van het naar beneden uitsteken door de incisie distaal van de somieten. Zo spoedig mogelijk verzegelen het ei met doorzichtige tape en terug naar de incubator.
         LET OP: De micro mes en een tang kleverig worden bij contact met de vitelline membraan. Het is belangrijk deze schoon met 70% ethanol te vegen voordat een volgende bewerking. Dit geldt voor alle latere werking beschrijvingen en implantaties kraal.
      3. Als een kraal is in combinatie met een barrière te voegen; Ten eerste neemt de kraal in No. 5 microforceps en plaats deze in het snijvlak van de LPM aan de distale zijde van de incisie en steek de barrière in de incisie proximale aan de korrel (Figuur 1B). Seal het ei en terug te snel naar de incubator.
2. Barrier ingevoegd op stadium 15 tot been bud initiatie te voorkomen.
   Opmerking: Een voorbeeld van het resultaat van deze operatie op Tbox 4 transcriptiefactor (Tbx4) expressie wordt weergegeven in figuur 2D en 2E.
   1. Neem een ​​podium 15 embryo uit de incubator en plaats het ei op een ei rust onder een binoculair microscoop ingesteld op 3,2X vergroting of hoger indien gewenst. Verwijder de bovenste laag doorzichtige tape.
      1. Uit stalen micro mes een insnijding door het vitelline membraan en LPM naast somieten 26-32 (figuur 1C) aan de rechterzijde van het embryo (somieten niet allemaal gevormd in dit stadium). Snijd grenzend aan de laatste twee somieten gevormd en blijven de cut vijf somite lengtes caudaal.
      2. Pak de barrière (1,2-1,3 mm) met No. 5 microforceps aan één einde en draai de belemmering van het vrije uiteinde in de incisie te voegen. Zo spoedig mogelijk verzegelen het ei met doorzichtige tape eennd terug naar de incubator.
         Opmerking: Het scharnier gevormde barrière vlak op de vitelline membraan boven de LPM met de helft van het naar beneden uitsteken door de incisie distaal van de somieten.
      3. Als een kraal is in combinatie met een barrière te voegen, ten eerste neemt de kraal No.5 microforceps en plaats deze in het snijvlak van de LPM aan de distale zijde van de incisie en steek de barrière in de incisie proximaal de kraal (figuur 1D). Seal het ei en terug te snel naar de incubator.
      4. Als een kraal of kralen zijn zonder een belemmering te worden ingebracht, bijvoorbeeld BMS 493 kralen om het been regio in de eerste fase 15, niet de lange incisie (3.2.2.1) te maken. Voeg een kleine incisie door de vitelline membraan en in de LPM ter plaatse van de hiel wordt geplaatst. Neem de kraal in No. 5 microforceps en plaats deze in het gat in de LPM. Duw het in een beetje verder met de gesloten uiteinden van de tang (figuur 1E).
3. Barrier ingevoegd op stadium 9 tot vleugel bud inductie en initiatie te voorkomen.
   1. Neem een ​​podium 8 of 9 embryo uit de incubator en plaats het ei op een ei rust onder een binoculair microscoop ingesteld op 3,2X vergroting of hoger indien gewenst.
      1. Uit stalen micro mes een insnijding door het vitelline membraan en LPM laterale en rostraal van de primitieve streep, aan het caudale einde van de embryo overeenkomstig de somieten (Figuur 1F) ongeveer 5 somite lengtes lang.
      2. Pak de barrière (0,7-1 mm breed) met No. 5 microforceps eind uitsteekt uit het petrischaaltje draai de hand om het vrije einde van de barrière in de incisie te voegen. Zo spoedig mogelijk verzegelen het ei met doorzichtige tape en terug naar de incubator.
         LET OP: Het scharnier gevormde barrière ligt plat op de vitelline membraan boven de LPM met de helft van het naar beneden uitsteekt door de incisie.
      3. Als een kraal inserte zijnd in combinatie met een barrière; Ten eerste neemt de kraal in No. 5 microforceps en plaats deze in het snijvlak van de LPM aan de distale zijde van de incisie en steek de barrière in de incisie proximale aan de korrel (figuur 1G). Seal het ei en terug te snel naar de incubator.
4. Barrier ingevoegd op stadium 10 tot been bud inductie en initiatie te voorkomen.
   Opmerking: Een voorbeeld van het resultaat van deze operatie op Tbx4 expressie wordt getoond in figuur 2G.
   1. Neem een ​​podium 10 embryo uit de incubator en plaats het ei op een ei rust onder een binoculair microscoop ingesteld op 3,2X vergroting of hoger indien gewenst.
      1. Uit stalen micro mes een insnijding door het vitelline membraan en LPM lateraal van het primitieve streep, aan het caudale einde van de embryo overeenkomstig de somieten (figuur 1H) ongeveer 6 somiet lengtes lang.
      2. Pak de barrière (1.2mm breed) met No. 5 microforceps eind uitsteekt uit het petrischaaltje draai de hand plaats het vrije einde van de barrière in de incisie. Zo spoedig mogelijk verzegelen het ei met doorzichtige tape en terug naar de incubator.
         LET OP: Het scharnier gevormde barrière ligt plat op de vitelline membraan boven de LPM met de helft van het naar beneden uitsteekt door de incisie.
      3. Als een kraal is zonder belemmering te voegen, bijvoorbeeld BMS 493 kogeltje om de beengebied in stap 10, een kleine incisie door de vitelline membraan en in de LPM ter plaatse van de hiel wordt geplaatst. Neem de kraal in No. 5 microforceps en plaats deze in het gat in de LPM. Duw het in een beetje verder met de gesloten uiteinden van de tang (figuur 1I).
5. 24 uur of langer na bedienen controleer de positie van de barrière ten opzichte van de opkomende contralaterale ledematen bud. Gooi embryo's waarbij de barrière is duidelijk niet opposite de linker ledematen kiem. In dit geval is de barrière ten onrechte is geplaatst.

4. Oogsten Embryo's, Fixatie en voorbereiding voor het Wholemount In Situ Hybridisatie (WISH)

1. Oogsten embryo's na de operatie.
   1. Oogst embryo's in stadium 19-23 zodat ledemaatknop morfologie is duidelijk zichtbaar in zowel de geopereerde en contralaterale controle zijden.
      1. Met behulp van gebogen schaar knippen een groter gat in de eierschaal. Snijd rond het embryo terwijl de grote bloedvaten links van de embryo met microforceps. Gebruik deze greep van het vaartuig naar het embryo te verwijderen en plaats deze in een petrischaal van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,3.
      2. Onder een binoculaire microscoop, ontleden weg extra embryonale schepen en membranen met een combinatie van gebogen schaar en geen. 5 microforceps. Verwijder het hoofd met behulp van een schaar.
2. Fixatie van embryo's te plaatsen oogsten.
   1. Met behulp van gebogen Blunt tang, til de embryo en het in 5 ml 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS bij kamertemperatuur gedurende twee uur schommelen en vervolgens bij 4 ° C geïncubeerd in een 20 ml glazen fles met een schroefdop.
      Let op: PFA is een ernstig gevaar voor de gezondheid. Het is een schadelijk, bijtend irriterend en het poeder moet worden voorkomen dat in contact komt met de huid, ogen en longen. Gebruik persoonlijke beschermende kleding en een afzuigkap tijdens het bereiden van de oplossing. Zodra het is een oplossing van 4%, handschoenen, oogbescherming en een laboratoriumjas verplicht.
      LET OP: Het is belangrijk om de embryo's in fix snel om de beste te bewaren mRNA integriteit.
3. Verwijderen van obstakels vóór wholemount in situ hybridisatie.
   LET OP: Barrières worden verwijderd, omdat ze zijn scherp en kunnen embryo's beschadigen als ze gaan door middel van de in situ hybridisatie protocol, vooral als meerdere embryo's worden gekleurd in een keer.
   1. Na fixatie, plaats het embryo in een schotel van PBS onder een binoculair microscope.
   2. Gebruik van twee paar No. 5 microforceps Plaats de linker paar nauw weerszijden van de barrière in de geopereerde zijde van het embryo. Pak de slagboom met de juiste pair en trek de barrière van het embryo met de linker pair naar het embryo te houden en om weefsel te voorkomen dat het naleven van de barrière als het wordt verwijderd.
4. Verricht WISH in hoofdzaak zoals beschreven in ^11.

Resultaten

Het protocol hierboven beschreven beschrijft de methoden die bij Nishimoto et al methoden. , 2015. De paper bestudeert ledematen knop inductie en initiatie in zowel de voor- als achterbeen van het kippenembryo. Resultaten als zij voorzien van ondoordringbare barrières voor de uitgroei van de voorpoot kiem te voorkomen zijn eerder gepubliceerd ^{1, 2, 9} maar er is slechts één onderzoek beschrijft barrières been knopaanleg ¹ geweest. Achterbeen data van Nishimoto et al. 2015 worden hier gepresenteerd als representatieve resultaten van de studie van mRNA expressie volgende barrière inbrengen.

Tbx4 ​​Expressie in de LPM is niet voldoende om Initiate achterbeen uitgroei:
Figuren 2B en C (tabel 2) blijkt dat barrière insertie in stap 15 (figuur 2A) (zie protocol 3,2) beide Fgf10en Fgf8 expressie afwezig in het been kiem regio (aangeduid door de beugel) op de geopereerde rechterkant. Vergelijken met de geopereerde linkerzijde. Echter Tbx4 expressie waargenomen bij zowel fase 19 en stap 23 op de geopereerde zijde (figuur 2D en E). We concluderen dat Tbx4 expressie alleen is niet voldoende om achterbeen uitgroei starten vanaf de LPM. Andere studies in het kuiken hebben gesuggereerd dat Tbx genexpressie is voldoende om voorpoot knopvorming ^{12, 13} te initiëren.

Figuur 2C 'is opgenomen om te illustreren hoe een barrière lijkt ingebed in het been regio van het embryo na de fixatie. In de meeste gevallen belemmeringen werden verwijderd voorafgaand aan in situ hybridisatie (protocol 4,3).

RA uit de Somieten is essentieel in de LPM voordat Fgf10 Veroorzaakt Limb Bud Outgrowth:
Figuur 3A is een schematische die de toevoeging van een RA geweekt kraal distaal van een barrière ingebracht in stadium 15 (protocol 3.2.1.3). Na deze bewerking ledemaatknop uitgroei (aangeduid met een asterisk) wordt waargenomen over de toegepaste rechterkant en Tbx4, Fgf10 en Fgf8 zijn uitgedrukt in de kiem als in de controlegroep links (figuur 3B, C en D, Tabel 2) . Aldus toevoeging van RA op de LPM overwint het effect van de barrière en ledemaatknop initiatie verloopt. We concluderen dat normale ontwikkeling van de somieten RA is essentieel in de LPM voor ledemaatknop uitgroei kan worden gestart. De resulterende achterbeen knoppen zijn over het algemeen kleiner zijn dan die op de controle kant. Dit kan te wijten zijn aan de RA dosering bij LPM die niet gelijk is aan het wildtype situatie. Als het RA dosis te hoog is de apicale ectodermale Ridge (AER) kan worden ingekort en kleinere knoppen zou resulteren^{14, 15.}

Dat RA (van de somieten) in de LPM bevestigen is vereist voor normaal onderdeel knopaanleg een inverse agonist van RAR, BMS 493, werd gebruikt. Kralen worden geïmplanteerd in het been regio LPM in stadium 15 (zie protocol 3.2.1.4) (Figuur 3E). Fgf10 expressie wordt gedownreguleerd volgende toepassing van BMS 493 kralen in de LPM, waardoor kleinere achterpoot knoppen tegenover de bedieningszijde (figuur 3F; tabel 3). Controle DMSO kralen niet deze gebreken (; Tabel 3 figuren 3G en 3H) veroorzaken. De gebreken waargenomen na BMS 493 toepassing zijn milder dan die geïnduceerd door een barrière operatie; dat wil zeggen, Fgf10 wordt nog steeds uitgedrukt en ledematen knoppen worden gevormd. Dit is waarschijnlijk omdat de effecten van BMS 493 lokaal worden beperkt om de korrels mogelijk niet alle RA door axi antagoniserenal weefsels.

Vroege Axial Signalen Geef de LPM Cellen die Later Express Tbx4:
We testten toen de LPM verwerft het vermogen om Tbx4 in de aspirant-been vormende gebied uit te drukken. De vroegste stadium waarin een barrière kan worden ingebracht, die vervolgens zal blokkeren been bud uitgroei, is het podium 10. Wij zijn de eerste die een protocol om de belemmeringen in te voegen op stadia eerder dan het podium 12. Belemmeringen ingevoegd tussen de paraxiale mesoderm en de vermoedelijke been te ontwikkelen LPM in stadium 10 (zie protocol 3,4) blok been knopvorming en de expressie van Tbx4 in de beenvormende LPM (figuren 2F en 2G, tabel 2), hetgeen suggereert dat een signaal van axiale weefsels in stadium 10 is nodig voor latere expressie van Tbx4 in achterbeen LPM. Vergelijk dit resultaat met figuren 2D en E, waar later barrière inbrengen maakt Tbx4 expressievast te stellen. Daarnaast testten we of deze axiale signaal kon RA door het waarnemen of het inverse agonist van RAR vermindert Tbx4 expressie. Een BMS 493 kraal geplaatst in het achterbeen LPM in stadium 10 (zie protocol 3.4.1.3) downregulates Tbx4 expressie (figuren 2H en 2I), terwijl controle kralen gedrenkt in DMSO hebben geen invloed op Tbx4 expressie (figuren 2J en 2K). Tezamen ondersteunen deze resultaten een model dat een RA signaal van axiale weefsels regelt onderdeel inductie door positief reguleren Tbx4 in het achterbeen LPM ^7.

Postoperatieve Death:
Tabellen 1, 2 en 3 geven details van de experimentele resultaten, inclusief het aantal chick embryo's die na de operatie en vóór de oogst stierf. Aantal sterfgevallen na microchirurgie van deze aard te verwachten. De nummers sterven kan worden bewaard tot een minimum door ervoor te zorgen dat instrumenten schoon, het gat in het ei is de minimale vereiste dat de embryo's worden achtergelaten zonder de bescherming van de plakband afdichting voor een minimumtijd en samen hiermee is dat de transactie wordt zo snel uitgevoerd mogelijk. Geen van deze activiteiten zijn zeer tijdrovend, maar handelingen met kralen en barrières te nemen een beetje meer tijd. Ondanks deze maatregelen verrichte handelingen in de vroegste stadia en die in de vleugel regio hebben meer kans op de dood veroorzaken. Er zijn grote bloedvaten rond de ledematen vormende gebieden en toevallige breuk van deze schepen kan leiden tot de dood als gevolg van bloedverlies. We vinden dat eieren in stap 8 of 9, waarvan de embryo's niet zijn geopereerd, zal sterven vaak de volgende dag geopend. Daarom is de enige oplossing voor deze problemen is een groot aantal experimenten uit te voeren.

d / 54618 / 54618fig2.jpg "/>
Figuur 2. Marker Gene Expression Wijzigingen volgende Barrier of Bead Insertion bij Vermoedelijke Been niveau. (A) schematische weergave barrière positie (groene lijn) op de vermoedelijke been niveau (somieten 26-32) in een fase 15 embryo. (B - E en G) WISH analyse bediende embryo's. De beengebied is uiteengezet (tussen haakjes). (B) Fgf10 expressie afwezig is in de geopereerde LPM, maar robuuste expressie wordt gedetecteerd in de linker knop. (C) Fgf8 expressie afwezig is in de geopereerde zijde, suggereert er geen AER. (C) Dezelfde embryo vóór het blok werd verwijderd. (D) Tbx4 wordt uitgedrukt in de LPM tegelijk rostro-caudale niveau als controle kiem. (E) Tbx4 expressie wordt gehandhaafd in het rechterbeen gebied ondanks afwezigheid van ledematen groei. (F) Schematische weergave van een podium 10 kippenembryo tonen barrière positie (groene lijn) op de vermoedelijke been niveau. (G) Tbx4 expressie afwezig is in de geopereerde juiste LPM (beugel). (H) Schematische weergave van een stage 10 kippenembryo toont BMS 493 bead positie (paarse cirkel) en vermoedelijke been niveau. (I) Tbx4 expressie wordt gedownreguleerd over de toegepaste rechterkant na behandeling met BMS 493. (J) Schematische weergave van een stage 10 kippenembryo met de beschrijving DMSO kraal positie (grijze cirkel). (K) Tbx4 wordt uitgedrukt op de geopereerde rechterkant op een vergelijkbaar niveau met dat van controle linkerkant na behandeling met alleen DMSO. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van ^7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

d / 54618 / 54618fig3.jpg "/>
Figuur 3. RA Reddingen Limb Bud's Absence Veroorzaakt door Barrier Insertion en is essentieel in de LPM Voorafgaand aan Been Bud uitgroei. (A) Schematische weergave aangeeft barrière positie (groene lijn) op de vermoedelijke been niveau (somieten 26-32) en een RA-doordrenkte kraal (rode cirkel). (B - D) RA reddingen been bud uitgroei (aangegeven met een asterisk). (B) Tbx4 expressie is aanwezig in de geredde been knop vergelijkbaar met de niet-geopereerde zijde. (C) Fgf10 uitgedrukt in de geredde been kiem vergelijkbaar met de niet-geopereerde zijde. (D) Fgf8 wordt uitgedrukt in de AER van de geredde rechterbeen bud. (E) Schematische aangegeven waar BMS 493 kralen (paars cirkels) in de vermoedelijke been LPM van het podium 15 embryo's werden geplaatst. (F) Fgf10 expressie wordt gedownreguleerd over de toegepaste rechterkant en de poot kiem klein volgende BMS 493 behandeling. Kralen zijn asterisk. (G) Vergelijkbare schema om (E), die de positie van de controle DMSO kralen (grijze cirkels). (H) DMSO kralen (aangegeven door sterretjes) had geen effect Fgf10 expressie of been knopgrootte. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van ^7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Stage barrière geplaatst (+ bead) *	Uitgevoerd	Wing ontbrekende **	Wing aanwezig **	aantal doden
Stage 12-14	40	24	1	15
Stage 8/9	65	23	0	42
Stage 12-13 (FGF4 bead)	41	7 (kraal ontbrekende)	17	17
Stage 12-13 (RA bead)	75	9 (kraal ontbrekende)	32	34
Stage 13 (controle bead)	5	3	0	2
* 0,7-1 mm folie barrières geplaatst tussen somieten 15-20 en de laterale plaat mesoderm. 0,35 mg / ml FGF4 bead. 0,05-0,1 mg / ml RA bead.
DMSO controle kraal.
** Chick embryo vaste fasen 21-23

Tabel 1. Wing Level Barrier en Bead Experiment Outcomes.

Stage barrière geplaatst (+ bead) *	Uitgevoerd	Been ontbreekt **	Been aanwezig **	aantal doden
Stage 12-15	43	39	0	4
Stage 10/11	23	16	0	7
Etappe 15 (FGF4 bead)	8	0	5	3
Etappe 15 (RA bead)	18	0	18	0
* 0,7-1,3 mm folie barrières geplaatst tussen somieten 26-32 en de laterale plaat mesoderm. 0,35 mg / ml FGF4 bead. 0,05-0,1 mg / ml RA bead.
** Chick embryo vaste fasen 18-24

Tabel 2. Leg Level Barrier en Bead Experiment Outcomes.

Uitgevoerd	Leg bud klein	Been bud wat klein	Been bud normale grootte	aantal doden
BMS 493 kralen *
15	12	3	0	0
DMSO kralen **
12	0	3	9	0
* 2-3 kralen gedrenkt in 5 mg / ml BMS 493 geplaatst in het juiste stadium 14-15 LPM op been niveau.
** 2-3 kralen gedrenkt in DMSO alleen in de juiste fase 15 LPM geplaatst aan been niveau.
Kippenembryo's vastgesteld op fasen 17-19.

Tabel 3. Leg Level BMS 493 Bead Experiment Outcomes.

Discussie

We beschrijven het gebruik van ondoordringbare barrières voor ledematen knopvorming in het kippenembryo voorkomen. Deze techniek heeft een aantal kritische stappen. Volgende voorlopige experimenten bleek dat het scharnier gevormde barrières gebruikt in ^{9, 10} blijven op hun plaats in het embryo beter dan rechte barrières. Het distale platte kant van de barrière kleeft aan het vitelline membraan en houdt de barrière op zijn plaats (figuur 2C). Zorgvuldige voorbereiding scharnier gevormde belemmeringen van aluminiumfolie zoals beschreven in stap 1.6 protocol is essentieel voor het succes van de operatie. Een tweede belangrijk stap is ervoor te zorgen dat de eieren niet uit de incubator worden gelaten te lang na windowing en rustplaatsen alvorens te gaan werken op het embryo. In onze ervaring, embryo's overleven een operatie beter als ze op of in de buurt incubatietemperatuur wanneer de operatie wordt uitgevoerd. Operaties moeten daarom worden zo snel mogelijk uitgevoerd en de eieren opnieuw afgesloten promptly te zorgen voor een goede overlevingskansen. Veel onderzoekers een druppeltje antibiotica om het embryo na microchirurgie, voordat de eieren in de incubator. De aanwezigheid van de vloeistof belet de belemmeringen uit goed plakken in stand. Toevoeging van antibiotica kan ook kralen los na plaatsing. Dus niet het gebruik van antibiotica, snelle operaties en een goede hygiëne van de instrumenten wordt aanbevolen om infecties te voorkomen. Afvegen instrumenten met 70% ethanol na elke fase van een operatie is van essentieel belang om te voorkomen dat instrumenten van steeds plakkerig van het contact met de vitelline membraan dat kan leiden tot zowel barrières of kralen om zich te houden aan een tang (zie protocol stap 3.1.2.2). Beide soorten kralen gebruikt kon niet op zijn plaats na de operatie valt. Wanneer de barrière positie de volgende dag werd gecontroleerd was het niet mogelijk om te zien door de barrière te gaan of de kraal bleef op zijn plaats is of niet. In gevallen waarin de kraal waren uitgevallen werd vleugel bud uitgroei niet gered ( tabel 1). Het vermijden van het overbrengen van vloeistof met de kraal als ze implanteren betekent dat kralen vasthouden gemakkelijker om de cut gezicht van het LPM (zie protocol 2.3.2.3). Tenslotte zorgen dat embryo's worden vastgesteld onmiddellijk na de oogst is van cruciaal belang voor een goede verdere analyse van genexpressie (zie protocol stap 4.2).

Dit protocol wijzigt eerder gepubliceerde experimenten die barrières gebruikt om ledematen bud initiatie te voorkomen, bevat specifieke optimale breedte voor slagbomen en introduceert een combinatie van barrière en kralen plaatsing gevolgd door de analyse van genexpressie. We hebben met gebruikelijke aluminiumfolie, die goedkoop en gemakkelijk beschikbaar in alle laboratoria, produceert resultaten gelijk aan die welke eerder gebruikte tantaal folie. De folie kan worden achtergelaten in het embryo wanneer uit de uitvoering in situ hybridisatie (figuur 2C '), maar verwijderen we het meestal als er meer dan één embryo wordt verwerkt om de scherpe randen van de folie beschadigen embryo's te voorkomen. PIlot studies aangetoond dat de breedte van beengebied belemmeringen is bijzonder belangrijk. Aanvankelijk was de barrières trialed waren te kort en been bud uitgroei was niet verhinderd. 1,2-1,3 mm is de optimale breedte voor een barrière been bud uitgroei volledig te blokkeren. De smalste vleugel barrières die men nauwkeurig kan plaatsen om te voorkomen dat bud uitgroei de beste overlevingskansen. Dit kan zo smal 0,5-0,7 mm. Echter, barrières die iets breder zijn, zijn meer waarschijnlijk resulteren in volledige blokkering van de vleugel bud uitgroei omdat ze zorgen voor een kleine onnauwkeurigheid van plaatsing (wij gebruikten 0,7-1 mm). Vermijden van de bloedvaten bij het maken van de incisie is van cruciaal belang voor de vleugel bud niveau barrières. Halfdoorlatende barrières zijn eerder gebruikt om het kuiken ledematen kiem halveren. MacCabe en Parker, 1976 en Summerbell, 1979 beide gebruikte filters 0,45 urn en 0,8 urn poriegrootte, respectievelijk ^{16, 17.} Zij rapporteerden dat diffundeerbaar signalen door de poriën in het filter en dat kan passerenbehaalde resultaten met behulp van halfdoorlatende barrières waren midden tussen een ledemaat knop met geen belemmering aanwezig en één met een ondoordringbare tantaal folie barrière. Dit protocol kan worden aangepast om semi-permeabele barrières met variërende poriëngrootte om kandidaat signalen op basis van grootte of op de dynamiek van het signaal diffusie wijzigen differentiëren.

Dit protocol heeft verschillende beperkingen vooral geassocieerd met het model organisme zelf. Dergelijke technieken kunnen worden gebruikt om verdere vragen ledematenontwikkeling alsmede andere vragen van gewervelde embryogenese sonde. Een voorwaarde is dat het orgel / gebied in kwestie moet ontwikkelen als het kippenembryo is toegankelijk voor interventie. De aanwezigheid van grote bloedvaten in het gebied waar een barrière moet worden geplaatst maakt barrière plaatsing later dan stage 13 of 14 technisch uitdagend. Als grote bloedvaten tijdens barrière plaatsing worden gesneden kan deze embryo sterfte veroorzaken. Ons onderzoek wanneer de transcriptiefactoren TBX5 en Tbx4 eerst geïnduceerd in de LPM beperkt door de vroegste fase waarin we een barrière die later respectievelijk zou uiteindelijk tegenover ofwel de vleugel of been kiem kunnen plaatsen. Het kan worden verhelderend om te proberen Tbx gen inductie te blokkeren in eerdere stadia, dichter bij de gastrulatie. De vroegste een barrière kunnen in de vermoedelijke vleugelgebied geplaatst succesvol was stap 8 en in het beengebied trap 10. Dit protocol is waarschijnlijk niet geschikt voor de studie van genexpressie dan ledemaatknop komen vanwege daaropvolgende snelle groei van de barrière en resultaten zou verdringen zou hebben alleen betrekking op de eerste positie van de slagboom.

Die soortgelijke beperkingen van het kippenembryo in dit verband zijn ten opzichte van andere gewervelde modelorganismen veel. Het kippenembryo is een zeer geschikt diermodel voor dergelijke fysiek ingrijpen in een vertebraat embryo. De embryo's zijn relatief groot en zijn gemakkelijk bereikbaar through de eierschaal. Men kan terugkeren naar het embryo voor verdere experimenten (zoals afvoeren van een kraal ¹⁸ of belemmering) of controleren voortgang door eenvoudig de cassette venster verwijderen. Er is mogelijk ruimte voor live-imaging of time lapse imaging bevatten. We beschrijven een werkwijze windowing kippeneieren die bijzonder geschikt bij het rijden in een vroeg stadium embryo. Bij ledemaat studies is zeer belangrijk en nuttig dat er een contralaterale ledemaat controle voor elk experiment is een ideale interne controle voor elke biologische repliceren.

De combinatie van het gebruik van ondoordringbare barrières voor ledematen uitgroei en kralen gedrenkt in signaalmoleculen voorkomen is niet eerder gerapporteerd. Onze analyse van mRNA expressie na dergelijke interventies is ook roman. Deze technieken konden we de moeilijke probleem van als lidmaat specifieke transcriptiefactoren Tbx5 en Tbx4 worden geïnduceerd in de LPM en ook ontledenaantonen dat later vóór knopaanleg ledematen, de aanwezigheid van deze genen in de Tbx LPM is niet voldoende voor het activeren van Fgf10 transcriptie en de start van ledemaatknop uitgroei. Figuren 2G, 2D en 2E illustreren deze bevindingen ook. De afwezigheid van Tbx4 expressie na het inbrengen van een barrière in stadium 10 in figuur 2G is in schril contrast met zijn aanwezigheid in 2D en 2E volgende barrière inbrengen in de eerste fase 15, na de inductie van Tbx4. De implantatie van RA geweekte kralen vergemakkelijkt de redding van ledematen knopaanleg volgende barrière inbrengen en zo punten te RA uit de somieten zijn essentieel in de LPM voordat ledematen knop uitgroei kan beginnen. Dergelijke technieken kunnen worden gebruikt om verdere vragen lidmaatonwikkeling maar ook andere vragen van gewervelde embryogenese lossen. Gebieden van de hersenen, ogen en romp waarschijnlijk geschikt.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2	Fine Science Tools  www.finescience.de	11251-20
Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2	Fine Science Tools  www.finescience.de	11241-30
Dumont strong forceps, type AA	Fine Science Tools  www.finescience.de	11210-10
Curved scissors with blades 2.5 cm long	Fine Science Tools  www.finescience.de	14061-11
Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5 cm long	Fine Science Tools www.finescience.de	11065-07
Steel pin, 0.2 mm wide	Fine Science Tools  www.finescience.de	26002-20
Sharpening stone, square	Fine Science Tools  www.finescience.de	29008-01
Mineral oil
Needle holder	Fine Science Tools  www.finescience.de	26016-12
Clear tape, 50 mm x 66 m	www.5staroffice.com	295985
FGF4 protein			Een geschenk van Cliff Tabin.
all-trans-retinoic acid	Sigma www.sigmaaldrich.com	R2625-50MG	Onthoud om te beschermen tegen licht.
BMS 493	Sigma www.sigmaaldrich.com	B6688-5MG
Scalpel blade No. 15	www.swann-morton.com	cat no. 0105
Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel	Bio-Rad www.bio-rad.com	153-7301	Kralen voor het leveren van eiwit.
AG1-X2 Ion exchange resin	Bio-Rad www.bio-rad.com	140-1251	Kralen voor het leveren van RA of BMS 493.
Incubator for eggs	Memmert www.hce-uk.com	LAB128
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma www.sigmaaldrich.com	P6148-1KG	Schadelijk, irriterend, corrosief.  Behandel poeder in een afzuigkap met volledige beschermende kleding.
Ethanol	Sigma www.sigmaaldrich.com	32221-2.5L
DMEM, high glucose	Gibco www.thermofisher.com	41965-039	500 ml
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific webshop.fishersci.com	D/4121/PB08	500 ml
Binocular Microscope	Leica www.leica-microsystems.com	MZ6	Vervangen door M60
Chicken eggs	Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com		Brown Eggs