Een low-cost, is makkelijk te gebruiken en krachtige systeem opgezet om potentiële behandelingen die bloed retinale barrière schending geïnduceerd door histamine kon verbeteren evalueren. Bloedvat lekkage Müller celactivering en de continuïteit van neuronale processen worden gebruikt om de schadereactie en de omkering van een potentieel geneesmiddel, lipoxine A4 beoordelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een acute retinale model voor het evalueren van Blood Retina Barrier Breach en potentiële geneesmiddelen voor de behandeling
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een laagdrempelig, gebruiksvriendelijk en krachtig modelsysteem is opgezet om mogelijke behandelingen te evalueren die een schending van de bloed-retinabarrière kunnen verbeteren. Een ontstekingsfactor, histamine, wordt aangetoond om de integriteit van de bloedvaten in de gekweekte retina te compromitteren door positieve kleuring van IgG buiten de bloedvaten. De effecten van histamine zelf en die van kandidaat-geneesmiddelen voor mogelijke behandelingen, zoals lipoxine A4, worden beoordeeld aan de hand van drie parameters: lekkage van bloedvaten via IgG-immunokleuring, activering van Müller-cellen via GFAP-kleuring en verandering in neuronale dendrieten door kleuring voor MAP2. Bovendien maakt de gelaagde organisatie van de retina een gedetailleerde analyse mogelijk van de processen van Müller- en ganglioncellen, zoals veranderingen in breedte en continuïteit. Hoewel de gepresenteerde gegevens betrekking hebben op varkensretinacultuur, is het systeem toepasbaar op meerdere soorten. Het model biedt dus een betrouwbare tool om de vroege effecten van een verminderde integriteit van de retinale bloedvaten op verschillende celtypen te onderzoeken en ook om potentiële kandidaat-geneesmiddelen voor behandeling te evalueren.
Inleiding
Een groeiende hoeveelheid bewijsmateriaal ondersteunt het bestaan van bloed retinale barrière (BRB) 1-5 en de gelijkenis met de bloed-hersenbarrière (BBB) 6,7. Compromis van de BBB is nauw verbonden causaal of diagnostische merker van chronische neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD) 8,9 en acute aandoeningen zoals delirium 10. Mechanistische inzichten in deze pathologieën en ontdekkingen voor potentiële drug targets zijn over het algemeen belemmerd door de beperkte toegankelijkheid en netwerk complexiteit van de hersenen. Alternatieven zoals in vivo beeldvorming 11, hersenen o....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle protocollen werden uitgevoerd in overeenstemming met het beleid van de Animal Care en gebruik Comite institutionele waar van toepassing.
1. Voorbereiding
- Bereid de stabilisatie media met 75% Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 25% Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Meng goed, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C tot gebruik.
- Bereid de fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en steriliseer in de autoclaaf. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur. Verwarm de PBS tot 37 ° C vóór het experiment (5 ml per putje).
- Bereid 10%, 20% en 30% sucrose in PBS. Filter alle oplossingen individueel via apar....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We presenteren een goedkope, tijdbesparende en gemakkelijk te gebruiken kunnen mogelijke behandelingen die bescherming kan bieden tegen BRB breuk veroorzaakt door histamine evalueren. IgG wordt beperkt binnen de vaten controle retina (Figuur 1A), maar lekt uit de bloedvaten bij blootstelling histamine (Figuur 1B), hetgeen bevestigt dat het model tot stand is gebracht.
LXA4 werd gekozen om het .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit rapport presenteren we een krachtig ex vivo acuut retinale model van BRB-disfunctie met behulp van de varkensretina. Dit modelsysteem vereist geen speciale instrumenten en kan gemakkelijk worden aangepast onder de meeste laboratoriumomstandigheden. Om een succesvol resultaat te verkrijgen, vereisen verschillende stappen echter speciale aandacht. Nadat de oogbollen uit de bron zijn verkregen, moeten ze worden bewaard op 4 °C of op ijs en zo snel mogelijk worden verwerkt. Wanneer het effect van een behandel.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Bringhurst Meats (Berlin, NJ) wordt erkend voor hun oprechte hulp bij het leveren van de varkensoogbollen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
| Sucrose | J.T.Baker | 4072-05 | |
| Histamine | Sigma | H7125-1G | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | ||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Freezing Media | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
| Normal Goat Serum | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP Antibody | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 Antibody | EMD Millipore | MAB3418 | |
| FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Laser Confocal Microscope | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |
Referenties
- Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. Blood-retinal barrier. J Ophthalmol. 21, 3(2011).
- Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
- Kumagai, A. K.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
