Inducerende Compleet Poliep Regeneration van de aboral Physa van de Starlet Zeeanemoon Nematostella vectensis

Samenvatting

Hier demonstreren we hoe we regeneratie kunnen induceren en monitoren in de Starlet Zeeanemoon Nematostella vectensis, een model cnidarian anthozoan. We laten zien hoe we kunnen amputeren en regeneratie categoriseren met behulp van een morfologisch stadiasysteem, en we gebruiken dit systeem om een vereiste voor autofagie in regenererende poliepstructuren te onthullen.

Samenvatting

Cnidarians, en in het bijzonder Hydra, werden de eerste dieren getoond om beschadigde of doorgesneden structuren, en inderdaad dergelijke studies aantoonbaar gelanceerd moderne biologische onderzoek door het werk van Trembley meer dan 250 jaar geleden te regenereren. Momenteel de studie van regeneratie een opleving waarbij zowel "klassieke" regeneratief organismen, zoals de Hydra, planaria en Urodeles, alsook een verbreding spectrum van soorten verspreid over het gebied metazoen uit sponzen tot zoogdieren gezien. Naast haar intrinsieke belangstelling als een biologisch fenomeen, begrijpen hoe regeneratie werkt in een verscheidenheid van soorten zullen ons te informeren over de vraag of regeneratieve processen delen gemeenschappelijke kenmerken en / of soorten of context-specifieke cellulaire en moleculaire mechanismen. De starlet zeeanemoon, Nematostella vectensis, is een opkomende modelorganisme voor het regenereren. Net als Hydra, Nematostella is een lid van de oude stam, Cnidaria, maar binnen tHij klasse Anthozoa, een zuster clade de hydrozoa dat is evolutionair meer basaal. Zo aspecten van de wedergeboorte in Nematostella zal interessant zijn om te vergelijken en het contrast met die van de Hydra en andere cnidarians. In dit artikel presenteren we een methode te halveren, observeren en classificeren regeneratie van het aborale uiteinde van de Nematostella volwassene die Physa genoemd. De Physa ondergaat splijting natuurlijk als middel ongeslachtelijke voortplanting, en hetzij natuurlijke splijting of handmatig amputatie van de Physa triggers hergroei en hervorming van complexe morfologie. Hier hebben we deze eenvoudige morfologische veranderingen in een Nematostella Regeneration Staging System (de NRSS) gecodificeerd. We gebruiken de NRSS de effecten van chloroquine, een remmer van lysosomale functie blokkeert autofagie testen. De resultaten laten zien dat de regeneratie van poliep structuren, met name de mesenteria, abnormaal wanneer autofagie wordt geremd.

Inleiding

De waarneming van de wedergeboorte in één hydra was het rudimentaire gebeurtenis in de komst van de biologie als een experimentele wetenschap ^1,2. Regeneration blijft een fenomeen van buitengewoon brede aantrekkingskracht te bioloog en leg persoon gelijk. Het potentieel voor ontwikkelingsstoornissen biologen, artsen, biomedische wetenschappers en ingenieurs weefsel te begrijpen en het overwinnen van de beperkingen op de menselijke regeneratie maakt regeneratie biologie meer dan de op zich interessant.

Nu, met het gebruik van nieuwe technologieën zoals genome sequencing en winst en verlies van functie gereedschap, het veld is klaar om uit elkaar regeneratieve mechanismen plagen en om uiteindelijk te begrijpen hoe de verschillende soorten kunnen regenereren, terwijl anderen dat niet kunnen. De mate van gemeenschappelijkheid in de moleculaire, cellulaire en morfologische reacties nog worden opgehelderd, maar tot nu toe lijkt het erop dat de fundamentele reacties onder dieren die kan regenereren meer lijkt dan zijn Imagi zou hebbenned slechts tien jaar geleden ^3.

Cnidarians in het bijzonder gemakkelijk op bijna al hun lichaamsdelen regenereren midden van een breed spectrum van morfologische diversiteit. Van de eenzame zoetwater poliep, Hydra samen met de kleine mariene poliepen die immense koraalriffen te bouwen, om de complexe koloniale siphonophoren, zoals de Portugese Man-O-War, regeneratie is vaak een manier van voortplanting, in aanvulling op een mechanisme voor het repareren of de hervorming van beschadigde of verloren lichaamsdelen als gevolg van een blessure en predatie. Of de diverse soorten Cnidaria gebruiken dezelfde of verschillende mechanismen voor de regeneratie is een fundamenteel interessante vraag ^4-6.

Wij, en anderen zijn het ontwikkelen van de anthozoan, Nematostella vectensis als een model voor regeneratie ^7-17. We hebben onlangs ontwikkelde een staging-systeem voor het beschrijven van de regeneratie van een hele lichaam van een morfologisch uniform stukje weefsel doorsneden uit de Aboral einde van de poliep ^10. Terwijl Nematostella poliepen kan regenereren wanneer doorsneden op elk niveau, hebben we gekozen om volwassenen te snijden op een aboral positie in de meest morfologisch eenvoudige regio, de Physa, mede omdat deze dicht bij de normale vlak van natuurlijke aseksueel kernsplijting ^18, en ook omdat het vergunningen observatie en moleculaire analyse van hoe een hele lichaam in elkaar zetten van de eenvoudigste morfologische componenten.

De Nematostella Regeneration Staging System (NRSS) voorziet in een relatief eenvoudige set van morfologische benchmarks die kunnen worden gebruikt om de voortgang van elk aspect van de wedergeboorte scoren door een geamputeerde Physa, onder normale kweekomstandigheden of experimenteel verstoorde situaties zoals kleine molecule behandelingen, genetische manipulatie of milieu-wijziging. Zoals verwacht, is de NRSS steeds aangenomen morfologisch stellage waarop de cellulaire en moleculaire gebeurtenissen regeneratie kan worden verwezen10.

Tenslotte onze manier van snijden produceert een gapend gat verschillende ordes van grootte hoger dan de pin punt lek gebruikt in een recent onderzoek ^17, maar beide wonden te helen in ongeveer 6 uur. Documenteren visueel arrestatie en verschillende fasen van wondsluiting moet voorstellen experimentele benaderingen om de schijnbare onafhankelijkheid van de grootte van een wond en de tijd die nodig is om te sluiten leggen. Zo kan een dieper visuele begrip van de aboral amputatie proces, die door dit protocol, zal verder onderzoek helpen in dit model regeneratie systeem en de toepassing van deze enscenering systeem met behulp van Nematostella vectensis verbreden.

Protocol

1. Conditionering van dieren voor de temperatuur, voeding en licht / donker-cyclus

1. Verkrijgen Nematostella vectensis volwassenen uit een van de vele Nematostella laboratoria over de hele wereld, of een non-profit leverancier (tabel 1)
2. Handhaaf Nematostella bij constante temperatuur (meestal tussen 18 en 21 ° C) in het donker, in "1 / 3x" kunstmatige zeewater (ASW) bij een zoutgehalte van 12 delen per duizend (ppt). Handhaaf culturen in eenvoudige natronkalkglas cultuur gerechten, typisch 250 ml of 1,5 liter capaciteit ^11.
   Let op: Deze eenvoudige kweekomstandigheden worden vaak gebruikt onder de labs die Nematostella studeren, maar de cultuur zorg kan ook worden geautomatiseerd ^19.
3. Feed Nematostella vers uitgekomen Artemia naupliën 2 - 4x per week. Hatch Artemia cysten in volle sterkte (36 ppt) of 1 / 3x ASW bij 30 ° C, in een ondiepe rechthoekige glazen schaal ²⁰ ofelk van een aantal kleine schaal, commerciële of zelfgemaakte pekelgarnalen broederijen. Als een incubator niet beschikbaar is, zal garnalen uitkomen bij kamertemperatuur maar doen dat langzamer.
   Opmerking: Dit vereist vaak meer dan 24 uur voltooid.
4. Vervang anemoon cultuur water minstens een keer per week. Voor de beste volwassen gezondheid, grondig te reinigen (zonder zeep) de cultuur kommen een keer per week van de geaccumuleerde slijm afscheidingen, die de vacht van de kom en val niet opgegeten voedsel en afval, en kan verwarren de dieren.

2. Selectie en Ontspanning van nutritioneel Geconditioneerd Dieren

1. Select-maat aangepast poliepen van ongeveer dezelfde lengte (3-5 cm, wanneer natuurlijke, ontspannen) en plaats ze in een kom gescheiden van de kolonie gedurende drie dagen voor amputatie.
   Opmerking: Het aantal dieren geselecteerd voor het snijden wordt bepaald door het experiment wordt uitgevoerd, natuurlijk, maar in het algemeen er minimaal vijf dieren per monsterpunt zes replicaties. aldusin een typisch experiment minste 30 dieren worden voorgeselecteerd. In het algemeen is het verstandig om meer dan het minimum aantal (30) sinds amputaties die onregelmatig (zie hieronder) kan later van invloed scoren zijn te selecteren.
2. Verwijder de schotel van geselecteerde dieren uit de incubator naar kunstlicht ten minste één uur voor amputatie.
   Opmerking: Blootstelling aan licht en trillingen van de behandeling zal waarschijnlijk leiden tot de dieren te contracteren, dus ze moeten worden aangepast of "relaxed" door incubatie op de labtafel. Dieren zullen vuurvaste aan te raken en blootstelling aan licht te worden en op dat punt kan worden verplaatst door zachte pipetteren.
3. Optioneel: Verdoven van de dieren door het toevoegen van 7,5% _MgCl2 (in 1 / 3x ASW). Voorzichtig voeg de _{MgCl2-oplossing} in de kom met een standaard kunststof 5 ml pipet.
   Opmerking: Hoewel de dieren uiteindelijk gewend zal worden om het licht en de fysieke manipulatie, kan het voordelig zijn om dieren te verdoven te handhaven of "fix" thij ontspannen toestand nadat ze langwerpige ^16,21,22 zijn geworden.
4. Gebruik een brede boring (> 0,5 cm) plastic pipet over te dragen (in 1 / 3x ASW) vijf dieren van het zwembad worden geamputeerd, in de bodem van een steriele glazen snijden schotel van 100 mm diameter met 12 ppt ASW. Plaats de schotel op het podium van een stereomicroscoop met variabele vergroting tussen 10 - 40X.
   Opmerking: Als de dieren niet verdoofd en ontspannen voor het snijden, kunnen ze nog steeds reageren op aanraking en stereoscoop verlichting en daarmee kan het nodig zijn een paar minuten om weer ontspannen te worden.

3. Amputatie

1. Met een steriele scalpel, amputeren de aboral Physa uit elke poliep, met als doel een deel van de Physa die ongeveer zo lang als breed en met niet mesenterium verkrijgen.
   Opmerking: de ideale cut site is gewoon aboral de beëindiging van het mesenterium. Op het vlak van snijden er een overgang van mesenterium goede dunne lines overeenkomstig elke mesenteriale insertie (zie figuur 1, pijlen). Afwezigheid van mesenterium is van cruciaal belang, omdat het slijm dat kan vergemakkelijken 'inpluggen' het gat ^17,30 produceert.
   1. Plaats de scalpel in contact met het dier op de gewenste plaats van amputatie. Doe dit hetzij zonder hulp (vrije hand) of door voorzichtig grijpen lichaam van het dier met een # 5 pincet (Dumont stijl of soortgelijke).
   2. Snij door het weefsel door gebruik te maken van de gebogen blad van de scalpel in een 'rockende' beweging over het lichaam.
      Opmerking: Het weefsel moet netjes te snijden als de scalpel wordt gewiegd en te bevrijden van het gewenste gedeelte van Physa van de donor. Echter, als een klein stukje weefsel nog steeds het lichaam en de Physa verbindt, snijd het met de scalpel. Probeer niet om de aangesloten stukken te scheiden door te trekken, omdat dit de Physa kan beschadigen.
2. Verwijder elke geamputeerde 'donor' poliep van het gerecht en terug te sturen naar een SEPArate kom met label 'gepoolde geamputeerden'; dateren de kom en terug te sturen naar de stam.
   Opmerking: geamputeerde poliepen zal de aboral wond binnen een dag te genezen en dan kan normaal worden gevoed. Zij zullen een normaal uitziende Physa binnen twee weken waarna het Physa opnieuw kan worden geamputeerd indien gewenst regenereren.
3. Spoel de uitgesneden Physa dat de snij schotel 12 ppt ASW blijven, vervolgens over elk Physa een afzonderlijk steriel putje in een multi-well celcultuur plaat die al 10 ml 12 ppt ASW in elk putje.
   Opmerking: Dit voorbeeld maakt gebruik van een zes goed plaat, met elk putje die 10 ml van zeewater en vijf uitgesneden Physa. In het algemeen zeewater moet het Physa voldoende dekking om de blootstelling aan lucht te voorkomen als gevolg van beweging in de behandeling en de potentiële verdamping. De plaat of putten moet een deksel hebben.
4. Herhaal stap 3,1-3,3 ten minste 5 Physa te verzamelen in elk putje gereserveerd voor elke experimentele behandeling.
5. Incubeer de Physa bij een temperatuur die provide het beste tarief van de wedergeboorte van de geplande experimentele ondervragingen. Plaats de plaat met de Physa in een incubator temperatuur gebracht, bij een vaste temperatuur bepaald door de gewenste snelheid van regeneratie.
   Opmerking: De Physa zal ontbrekende weefsels regenereren en vormen een volledige poliep bij incubatie bij temperaturen tussen 15 en 27 ° C. De snelheid van regeneratie temperatuurafhankelijk is, behalve voor de eerste twee fasen. De gemiddelde dag voor het bereiken Fase 4 voor alle temperaturen 7 d na het uitsnijden en dit valt ook samen met regeneratie bij 21 ° C. Bij 27 ° C, wordt Fase 4 ongeveer 3 dagen eerder bereikt en bij 15 ° C, wordt Fase 4 vertraagd met ongeveer 3 d tegenover regeneratie bij 21 ° C (zie eveneens referentie 10).

4. Het beoordelen van Regeneratie met de Nematostella Regeneration Staging System (NRSS)

1. De score van de Physa met behulp van een stereo-samengestelde microscoop met een variabele magnificatie (10 - 80X). De score van de vers gesneden Nematostella Physa Fase 0 en blijven scoren op hetzelfde tijdstip iedere dag na de amputatie (dpa) met behulp van de NRSS ^10.
   Opmerking: Voor key staging criteria en details verwijzen Reference 10.
   1. Score Physa Fase 0 (open wond) indien een vers gesneden Physa verschijnt als een beker- vormige massa die lijkt op een slappe ballon, met een open wond is waarschijnlijk zichtbaar is.
      Opmerking: De wondranden Ook elkaar blijven vanaf het begin, maar het weefsel nog ingeklapt en stijfheid ontberen. De randen van de open wonde kunnen worden waargenomen radiale contractie van de wond geneest ondergaan.
   2. Score Physa Fase 1 (Wound Closed) als de amputatie wonde lijkt gesloten.
      Let op: de wond locatie komt overeen met de toekomst mondelinge paal. Het buitenoppervlak rondom de toekomst orale paal kunnen gaan verschillende bogen die overeenkomt met de onderliggende stervormig symmetrisch endodermale mesenteriale inserties geven.
   3. score physa Fase 2 (Radial bogen) indien het oppervlak van de orale paal verschijnt opgeblazen, onthullen acht verhoogde bogen gerangschikt in een stervormig symmetrisch patroon en van elkaar gescheiden door groeven. Observeren kleine, halfbolvormige blebs aan de top van de bogen. Ze zal ongeveer zo groot als breed, waarschijnlijk van voorbijgaande aard, en bestond aanvankelijk uit door een enkele ectodermale cellaag.
      Let op: In sommige gevallen kan dubbellaags blebs stabiliseren. Opmerking: In dit of een latere fase een slijmlaag lijken de Physa (figuur 2) in een membraneuze 'omhulsel' kapselen. Het inkapselend materiaal moet worden verwijderd een doelpunt te vergemakkelijken.
   4. Score Physa Fase 3 (tentakel) als de toppen van de tentakels bevattende mesodermale en ectodermale weefsels lagen stabiel worden gevormd aan de orale einde van ten minste enkele radiale bogen.
      Opmerking: De tentakels zijn langer dan breed zijn en minimaal beweeglijk. De Physa zal tonen gestegen, maar variabele inflatie, zodat mesenterium rudimenten kan worden visbaar uitstrekt vanaf de mesenteriale inbrengen in de lichaamsholte (coelenteron).
   5. Score Physa Fase 4 (Linear mesenteria) indien het Physa bevat acht verschillende, zichtbare mesenteria dat in het lichaam muur tot in de coelenteron van toevoegingen, met orale-aboral lengtes die meer dan twee keer de radiale breedte gemeten van waar ze lijken aan te sluiten zijn de keelholte aboral aan zijn uiteinde (enterostome).
      Opmerking: vier of minder mesenteria hebben "geplooide" interne vrije randen. De keelholte zichtbaar. Meer dan acht tentakels zichtbaar, beweeglijk en soms rechtstreeks zij in het lichaam.
   6. Score Physa Fase 5 (voornamelijk geplooide mesenteria) indien de Physa heeft meer dan vier mesenteria met plooien en de plooien is voller en bochtige dan in fase 4. Het dier heeft een bijna "normale" volwassen uitstraling, maar er zijn geen zichtbare gonadale cellen.

Resultaten

De voortgang van morfologische gebeurtenissen tijdens regeneratie afgesneden Physa wordt getoond in Figuur 1A, die representatief uitzicht Physa in elke NRSS fase omvat. De typische Physa cut site is aangegeven op de volwassen (pijlpunten). De foto's in figuur 1A tonen geleidelijke herstel van mondelinge en anatomische eigenschappen van vers gesneden Physa door middel van volledig gevormd poliep. Figuur 1B, C de inrichting van intern...

Discussie

Gebruik van Nematostella als model voor wondgenezing en regeneratie wordt steeds populairder. Aldus is het belangrijk om te kunnen de morfologische patroon van een bepaald protocol zien voordat effectieve cellulaire en moleculaire analyses kunnen worden toegewezen en vergeleken. Nematostella een hoge regeneratieve "flexibiliteit", in staat om bijna hervormen ontbrekende structuur afgezet op elke locatie, op post-planula levensstadia. Zo hebben verschillende onderzoekers onderzocht regeneratie...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Nematostella vectensis, volwassenen	Marine Biological Lab (MBL)		non-profit leverancier
Glazen kweekbakje, 250 mL	Carolina Biological Supply	741004	250 mL
Glazen kweekbakje, 1.500 mL	Carolina Biological Supply	741006	1.500 mL
Polyethyleen overdrachtspijp, 5 mL	USA Scientific	1022-2500	smalle boring, gegradueerd
Polyethyleen overdrachtspijp, taps toelopend	Samco	202-205	snijd 1 inch van de punt af om een brede boring te maken
Wegwerp scalpel	Feather Safety Razor Co. Ltd	nr. 10	mesje moet gebogen zijn
#5 Dumont fijne punttang	Roboz	RS5045	alternatieve leveranciers beschikbaar
Pyrex petrischaal, 100 mm diameter	Corning	3160	kan worden vervangen door andere glazen petrischalen
Steriele 6-well plaat	Corning Falcon	353046	of soortgelijk van andere fabrikant
Steriele 12-well plaat	Nunc	150628	of soortgelijk van andere fabrikant
Steriele 24-well plaat	Cellstar, Greiner bio-one	662-160	of soortgelijk van andere fabrikant
Brineeuw kweekset	San Francisco Bay; drsfostersmith.com	CD-154005	optie voor het kweken van brineeuw
pyrex bakvorm	gewoon in supermarkten		optie voor het kweken van brineeuw
kunstmatig zeewater mix 50 gal of meer	Instant Ocean; drsfoster-smith.com	CD-116528	andere merken kunnen volstaan
Kunststof emmer voor voorraad ASW bereiding	diverse		gewone 25 gallon plastic vuilnisbak OK
Polypropyleen Carboy	Carolina Biological Supply	716391	Voor werkende voorraad ASW bij 12 ppt
Meetbeker, 4.000 mL	PhytoTechnology Laboratories	B199	Voor verdunning van 36 ppt ASW naar 12 ppt
Stereomicroscoop en lichtbron	diverse		met continue 1 - 40X vergroting