We stellen een protocol voor voor het herprogrammeren van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) naar geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Door de getransduceerde bloedcellen te plaatsen op met matrix beklede platen met behulp van centrifugatie, worden iPSC's met succes geïnduceerd uit zwevende cellen. Deze techniek suggereert een eenvoudig en effectief herprogrammeringsprotocol voor cellen zoals PBMC's en CBMC's.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Geïnduceerde pluripotente stamcellen Generation van Blood Cells Met behulp van Sendai Virus en Centrifugeren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De recente ontwikkeling van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) bewees dat volwassen lichaamscellen kan terugkeren naar een ongedifferentieerde, pluripotente toestand. Nu is herprogrammering uitgevoerd met diverse typen volwassen somatische cellen: keratinocyten, urine cellen, fibroblasten, enz Vroege experimenten meestal door dermale fibroblasten. Maar dit vereist een invasieve chirurgische procedure om fibroblasten van patiënten te verkrijgen. Daarom suspensie cellen, zoals bloed en urine cellen werden beschouwd als ideaal voor herprogrammering vanwege het gemak van het verkrijgen van de primaire cellen. Hier melden wij een efficiënt protocol voor iPSC generatie uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC). Door uitplating de getransduceerde PBMC serieel een nieuwe matrix gecoate platen middels centrifugatie, kan deze eenvoudig protocol bieden iPSC kolonies. Deze methode is ook toepasbaar op navelstrengbloed mononucleaire cellen (CBMCs). Deze studie geeft een eenvoudige en efficiënte protocol voor de herprogrammering van PBMCs en CBMCs.
Inleiding
Stamcellen zijn een van de meest aantrekkelijke materialen klinische therapie voor de laatste decennia 1 geweest. De aantrekkelijke eigenschappen van stamcellen pluripotentie en de mogelijkheid om te hernieuwen. In 1981, werden de eerste embryonale stamcellen (SER) geïsoleerd uit de muizenembryo 2. Wanneer echter de techniek werd toegepast op menselijke embryo, het keek aantal ethische vragen.
In 2006, toen Dr. Yamanaka en zijn team geherprogrammeerd de eerste pluripotente cellen uit muizen somatische cellen, het gebied stamcel weer zijn mogelijkheid en interesse werd aangewakkerd 3. Door het leveren van e....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Ethiek Verklaring: Deze studie protocol werd goedgekeurd door de institutionele review board van de Katholieke Universiteit van Korea (KC12TISI0861).
1. Isolatie van monocytische cellen van bloed
- Isolatie van monocytische cellen (dag -5)
- Verkrijgen van ten minste 10 ml vers bloed van een bloed trekken in een celpreparaat buis (CPT).
- Breng het bloed naar een nieuwe 50-ml conische buis en verdunnen met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij een 1: 4 verhouding.
OPMERKING: Een hogere verhouding van verdunning kan worden gebruikt voor hogere zuiverheid. - Voeg 10 ml dichtheidsgradiënt media in nieuw 50-ml ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol geeft een eenvoudige methode om PBMC's geïsoleerd uit bloed herprogrammeren. Door gecombineerde seriële platen en centrifugeren, werden iPSCs succes gegenereerd. Met deze methode kan iPSC worden gegenereerd met een kleine hoeveelheid bloed cellen zonder isoleren of expanderen van een specifiek celtype. Wij hebben met succes gegenereerd iPSCs van slechts 1x10 4 cellen in een kleine celcultuur plaat.
.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Omdat embryonale stamcellen (SER) toonde diverse tekortkomingen, werd de behoefte aan een alternatief gereedschap nodig. Daarom is de ontwikkeling van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) door Yamanaka kwam onder de internationale schijnwerpers. Het is bijna tien jaar geleden Yamanaka ontdekt dat pluripotentie kan worden geïnduceerd door toevoeging van slechts vier genen in volwassen somatische cellen. Sinds iPSCs worden "opgewekt" van volwassen lichaamscellen, kunnen zij ethische kwesties die ooit de .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het Basisonderzoeksprogramma via de Nationale Onderzoeksstichting van Korea (NRF), gefinancierd door het Ministerie van Wetenschap, ICT en Toekomstplanning (2013R1A1A1076125).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Plasticware | |||
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 ml Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 ml Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 ml Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 ml Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| 24-well Plate | TPP | 92024 | |
| PBMC Isolation Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| StemSpan | STEMCELL Technologies | 9805 | Blood cell media |
| CC110 | STEMCELL Technologies | 8697 | Blood cell media supplement (100x) |
| iPSC Generation and Culture Materials | |||
| CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A16518 | |
| TeSR-E8 Media | STEMCELL Technologies | 5940 | iPSC media |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TrypLE express (TrypLE) | Life Technologies | 12604-039 | |
| ReleSR | STEMCELL Technologies | 12604-039 | Colony detaching solution |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | Rinse Buffer |
| Sodium Chloride | Duchefa Biochemie | S0520.1000 | Rinse Buffer |
| Tween-20 | BIOSESANG | T1027 | Rinse Buffer |
| Hydrochloric Acid | Duksan | 1129 | Rinse Buffer |
Referenties
- Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).
- Martin, G. R. Isolation of a plur....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Meer artikelen verkennen
