Geïnduceerde pluripotente stamcellen Generation van Blood Cells Met behulp van Sendai Virus en Centrifugeren

Samenvatting

We stellen een protocol voor voor het herprogrammeren van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) naar geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Door de getransduceerde bloedcellen te plaatsen op met matrix beklede platen met behulp van centrifugatie, worden iPSC's met succes geïnduceerd uit zwevende cellen. Deze techniek suggereert een eenvoudig en effectief herprogrammeringsprotocol voor cellen zoals PBMC's en CBMC's.

Samenvatting

De recente ontwikkeling van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) bewees dat volwassen lichaamscellen kan terugkeren naar een ongedifferentieerde, pluripotente toestand. Nu is herprogrammering uitgevoerd met diverse typen volwassen somatische cellen: keratinocyten, urine cellen, fibroblasten, enz Vroege experimenten meestal door dermale fibroblasten. Maar dit vereist een invasieve chirurgische procedure om fibroblasten van patiënten te verkrijgen. Daarom suspensie cellen, zoals bloed en urine cellen werden beschouwd als ideaal voor herprogrammering vanwege het gemak van het verkrijgen van de primaire cellen. Hier melden wij een efficiënt protocol voor iPSC generatie uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC). Door uitplating de getransduceerde PBMC serieel een nieuwe matrix gecoate platen middels centrifugatie, kan deze eenvoudig protocol bieden iPSC kolonies. Deze methode is ook toepasbaar op navelstrengbloed mononucleaire cellen (CBMCs). Deze studie geeft een eenvoudige en efficiënte protocol voor de herprogrammering van PBMCs en CBMCs.

Inleiding

Stamcellen zijn een van de meest aantrekkelijke materialen klinische therapie voor de laatste decennia ¹ geweest. De aantrekkelijke eigenschappen van stamcellen pluripotentie en de mogelijkheid om te hernieuwen. In 1981, werden de eerste embryonale stamcellen (SER) geïsoleerd uit de muizenembryo ^2. Wanneer echter de techniek werd toegepast op menselijke embryo, het keek aantal ethische vragen.

In 2006, toen Dr. Yamanaka en zijn team geherprogrammeerd de eerste pluripotente cellen uit muizen somatische cellen, het gebied stamcel weer zijn mogelijkheid en interesse werd aangewakkerd ^3. Door het leveren van een aantal factoren bepaald, pluripotente stamcellen waren succesvol "opgewekt" uit volwassen lichaamscellen, en werden dus de naam "geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)." In 2007 werd deze techniek toegepast op menselijke cellen ^4, waardoor de cellen met de exacte kenmerken van de SER, maar geen van de ethische discussie. Theoretisch iPSCs kunnen uit elke celsoort die bij een individu of patiënt. Patiëntspecifieke iPSCs stijgen als een potentieel middel dat de ziekte fenotypes en epigenetische omstandigheden van elke individuele patiënt kan simuleren. Middels gen bewerken of andere methoden die de pathogene conditie kan omkeren, kan patiëntspecifieke iPSC worden gebruikt in gepersonaliseerde geneeskunde ^5. Bovendien worden iPSCs minder geassocieerd met afstoting, omdat ze dezelfde immunologische identiteit als donor, waardoor auto-transplantatie haalbaarder ^6. Daarom hebben iPSCs de meest veelbelovende platform bij de ziekte modelleren, drug discovery, en regeneratieve therapieën. Gezien deze voordelen, verbeterde protocollen die zuiverder en hogere opbrengsten kan geven in de minste hoeveelheid tijd van de kleinste cel bron zijn voortdurend in ontwikkeling. Een belangrijke overweging van het vinden van de meest efficiënte protocol voor toekomstige toepassing is het primaire celtype. De meeste vroege iPSC generatie protocols zijn geoptimaliseerd voor hechtende cellen sinds de oorspronkelijke iPSC lijnen geïnduceerd door huidfibroblasten ^4. De isolatie en bereiding van deze cellen zijn arbeidsintensief. Ook de isolatie van huidfibroblasten omvat invasieve chirurgische procedures die een belangrijke tekortkoming bredere toepassing kan worden.

Daarom is voor het verdere gebruik van iPSCs, een cel bron met handige overname is vereist. Bloed wordt beschouwd als een ideale bron van cellen omdat het wordt verkregen door een nogal minimaal invasieve procedure ^7-9. In deze studie hebben we een eenvoudige wijziging van het protocol genereren hiPSCs uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC). Zonder de moeilijke expansieproces van een specifiek celtype, zoals CD34 + cellen werden volledig bloed cellen of PBMC's uitgeplaat op serieel-matrix gecoate platen door centrifugeren na transductie met Sendaivirus met Yamanaka factoren. Deze werkwijze verminderde de tijd die dehechting van zwevende getransduceerde cellen en verminderde het verlies van geherprogrammeerd cellen die niet kunnen hechten op eigen kracht.

Protocol

Ethiek Verklaring: Deze studie protocol werd goedgekeurd door de institutionele review board van de Katholieke Universiteit van Korea (KC12TISI0861).

1. Isolatie van monocytische cellen van bloed

1. Isolatie van monocytische cellen (dag -5)
   1. Verkrijgen van ten minste 10 ml vers bloed van een bloed trekken in een celpreparaat buis (CPT).
   2. Breng het bloed naar een nieuwe 50-ml conische buis en verdunnen met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij een 1: 4 verhouding.
      OPMERKING: Een hogere verhouding van verdunning kan worden gebruikt voor hogere zuiverheid.
   3. Voeg 10 ml dichtheidsgradiënt media in nieuw 50-ml conische buis en voorzichtig laag het verdunde bloed bovenop de dichtheidsgradiënt media. Centrifugeer bij 750 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur (RT) zonder centrifugeren rem.
   4. Breng voorzichtig de buffy laag op een nieuwe 50-ml conische buis, voeg 30 ml PBS aan de buis en was de cellen.
   5. Centrifugeer de cellen bij 515 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   6. Gooi de PBS en resuspendeer de cellen in 0,5 ml bloed celmedium.
   7. Tel de cellen en de plaat 1 x 10 ⁶ cellen per putje van een 24-wells plaat. Voeg PBS om de omringende putjes om verdamping te voorkomen.
   8. Stabiliseren van de cellen gedurende 5 dagen bij 37 ° C in 5% CO ₂ voor transductie. Voeg een extra 0,5 ml vers bloedcel media op dagen 3-4 zonder verstoring van de cellen.

2. Transductie door Sendai Virus

1. Transductie (Dag 0)
   1. Verzamelen en overdragen van de bloedcellen aan een 15-ml conische buis en tel ze met behulp van een hemocytometer.
   2. Bereid 3 x 10 ⁵ cellen per transductie en centrifugeer de cellen bij 515 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   3. Verwijder het supernatant door afzuigen en resuspendeer de cellen in 0,5 ml bloed celmedium.
   4. Overdracht van de cellen om een ​​putje van een niet-gecoate 24-well plaat.
   5. Ontdooi de Sendai virus mengsel in ijs en voeg deze toe aan de suspended cellen. Voeg Sendaivirus aan de cellen op basis van de aanbevelingen van de fabrikant.
   6. Dicht de plaat met een afdichtfilm en Centrifugeer bij 1150 xg gedurende 30 min bij 30 ° C.
   7. Na centrifugatie Incubeer de cellen bij 37 ° C in _5% CO2 gedurende de nacht (O / N).
2. Celoverdracht naar voedermatrix (Dag 1)
   1. De volgende dag, jas een 24-wells plaat met vitronectine. Verdun de oplossing vitronectine in PBS gedurende een laatste 5 ug / ml concentratie. Voeg 1 ml vitronectine aan een putje van een 24-wells plaat en incubeer deze bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur. Verwijder de bekledingsoplossing voor gebruik. Beklede platen kunnen worden opgeslagen kamertemperatuur 3 dagen.
   2. Breng al de media die de cellen en het virus aan de beklede put.
   3. Verzamel de resterende cellen met een extra 0,5 ml vers bloed celmedium toevoegen aan de cel-bevattende put.
   4. Centrifugeer de plaat bij 1150 xg gedurende 10 min bij 35 ° C.
   5. na centrifugation Verwijder het supernatant, voeg 1 ml iPSC media te houden en de cellen bij 37 ° C in 5% CO ₂ O / N.
3. Tweede cel overdracht (dag 2)
   1. Bekleden van de putjes van een nieuwe plaat met 24 putjes met 5 ug / ml vitronectine, zoals beschreven in stap 2.2.1. Gebruik een putje van de plaat voor elke transductie.
   2. Breng de celsuspensie van de eerste plaat van de nieuw beklede vitronectine plaat.
      LET OP: Als dit niet nodig is, kan schorsing cellen worden weggegooid. De in stap 2.3 genoemde procedure kan 2-3 keer worden herhaald met de opschorting cellen. Als de stappen worden herhaald, de oogst van de cellen.
   3. Ondertussen, voeg 1 ml iPSC media om de bron van de eerste plaat, onderhoud en incubeer deze bij 37 ° C in 5% CO ₂ O / N.
   4. Handhaaf de aangehechte cellen bij 37 ° C en 5% CO ₂ en voeren een dagelijkse media verandering iPSC verse media. Kolonies zal verschijnen op de dagen 14-21 na transductie.
   5. Centrifuge de nieuw beklede plaat met de celsuspensie bij 1150 xg en 35 ° C gedurende 10 minuten.
   6. Na centrifugatie Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO ₂ O / N.
   7. De volgende dag, verwijder het supernatant en te vervangen door verse iPSC media.
      OPMERKING: De bij stap 2.3 genoemd kan 2-3 keer worden herhaald met de suspensie cellen. Als de stappen worden herhaald, de oogst van de cellen in het supernatant en herhaal stap 2,3.
   8. Handhaving van de bijgevoegde cellen met dagelijkse media veranderingen tot 80% samenvloeiing wordt bereikt.

3. geherprogrammeerd Cell Onderhoud

1. Vroeg onderhoud na de 24-well plaat cultuur
   1. 7-10 dagen na transductie, wanneer de cellen confluent, stelt een vitronectine gecoate, 60 mm schaal. Vitronectine verdunde oplossing in PBS gedurende een laatste 5 ug / ml concentratie. Voeg 1 ml van vitronectine aan de schaal en incubeer deze bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur.
   2. was decellen met PBS en voeg 1 ml PBS / 1 mM EDTA om de cellen los te maken.
   3. Incubeer ze op 37 ° C en 5% _CO2 gedurende 2 min.
   4. Oogst de cellen en centrifugeer ze op 250 xg en KT 2 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 3 ml vers iPSC media.
   5. Plaat alle geresuspendeerde cellen op de nieuw beklede 60-mm schaal.
   6. Voeg 10 mM RHO kinase remmer aan de cellen en te onderhouden bij 37 ° C in _5% CO2 totdat de cellen 80% confluent.
2. Split voor kolonie uiterlijk (Subklonering Voorbereiding)
   1. Bereid een vitronectine beklede, 100-mm schaaltje, zoals beschreven in stap 3.1.2.
   2. Was de cellen met PBS en voeg 1 ml PBS / 1 mM EDTA om de cellen los te maken.
   3. Incubeer ze op 37 ° C en 5% _CO2 gedurende 2 min.
   4. Oogst de cellen en centrifugeer ze op 250 xg en KT 2 min.
   5. Tel de cellen met een hemocytometer en bereiden 1 x 10 ⁴ cellen per schaal.
   6. Centrifugeer de cellen bij 250 xg en KT 2 min.
   7. Resuspendeer 1 x 10 ⁴ cellen in 6 ml iPSC media, plaat ze op het beklede 100-mm schaaltje en voeg 10 mM RHO kinaseremmer aan de media.
   8. Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% _CO2 gedurende een week tot grote kolonies verschijnen.
      LET OP: Onderhouden en uitbreiden van de kolonies voor subklonering. Subklonering gebeurt meestal in minder dan 5 passages.
3. Kolonie plukken met behulp van iPSC kolonie los oplossing
   1. Een week voor kolonie picking zaad 1 x 10 ⁴ cellen op vitronectine beklede, 100-mm schaaltje, zoals vermeld in stap 3.2.7.
   2. Bereid een vitronectine beklede, 60-mm schaal door toevoeging van 2 ml vitronectine oplossing en incubatie bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur.
   3. Door het observeren door een microscoop (40X of 100X vergroting), markeer kolonies met duidelijke grenzen met behulp van een markeerstift. Verwijder de vitronectine oplossing uit de nieuwe plaat gemaakt in stap 3.3.2 en voeg 6 mlvan iPSC medium, aangevuld met 10 mM RHO kinase.
   4. Verwijder het kweekmedium van de cellen en wassen met 3 ml PBS.
   5. Voeg 1 ml iPSC kolonie losmaken oplossing en incubeer ze gedurende 30 s bij kamertemperatuur.
   6. Verwijder de oplossing van de plaat en incubeer het op kamertemperatuur gedurende nog 30 sec.
   7. Met behulp van een P200 pipet, trek 200 ul van de media van de plaat en verwijder de beoogde kolonies door pipetteren. Breng de verstrooide koloniën de nieuwe 100-mm schaaltje.
   8. Incubeer en onderhouden van de cellen bij 37 ° C in _{5% CO2.}
      NB: Na het verkrijgen van een zuivere iPSC kolonie, werden de cellen gehandhaafd totdat zij passage bereikt 10. karakterisatie werd gedaan na ten minste 10 passages. Antilichaam verdunningen en primer gegevens worden in tabellen 1 en 2.

Resultaten

Dit protocol geeft een eenvoudige methode om PBMC's geïsoleerd uit bloed herprogrammeren. Door gecombineerde seriële platen en centrifugeren, werden iPSCs succes gegenereerd. Met deze methode kan iPSC worden gegenereerd met een kleine hoeveelheid bloed cellen zonder isoleren of expanderen van een specifiek celtype. Wij hebben met succes gegenereerd iPSCs van slechts 1x10 ⁴ cellen in een kleine celcultuur plaat.

...

Discussie

Omdat embryonale stamcellen (SER) toonde diverse tekortkomingen, werd de behoefte aan een alternatief gereedschap nodig. Daarom is de ontwikkeling van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) door Yamanaka kwam onder de internationale schijnwerpers. Het is bijna tien jaar geleden Yamanaka ontdekt dat pluripotentie kan worden geïnduceerd door toevoeging van slechts vier genen in volwassen somatische cellen. Sinds iPSCs worden "opgewekt" van volwassen lichaamscellen, kunnen zij ethische kwesties die ooit de ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 ml Cornical Tube	SPL	50050
15 ml Cornical Tube	SPL	50015
10 ml Disposable Pipette	Falcon	7551
5 ml Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
24-well Plate	TPP	92024
PBMC Isolation Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03
StemSpan	STEMCELL Technologies	9805	Blood cell media
CC110	STEMCELL Technologies	8697	Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit	Life Technologies	A16518
TeSR-E8 Media	STEMCELL Technologies	5940	iPSC media
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	Rinse Buffer
Sodium Chloride	Duchefa Biochemie	S0520.1000	Rinse Buffer
Tween-20	BIOSESANG	T1027	Rinse Buffer
Hydrochloric Acid	Duksan	1129	Rinse Buffer