Een eenvoudige mechanische Procedure aanmaken Limbale Stem Cell Deficiency in Mouse

Samenvatting

Het volgende artikel biedt een eenvoudige, reproduceerbare techniek om effectief een duurzame muismodel van limbale stamcellen deficiëntie (LSCD). Dit diermodel is bruikbaar bij het testen en vergelijken van de werkzaamheid van behandelingen voor limbale stamcellen ziekten.

Samenvatting

Limbale stamcellen deficiëntie (LSCD) is een staat van een storing of verlies van limbale epitheliale stamcellen, waarna de hoornvliesepitheel wordt vervangen door bindvlies. Patiënten die lijden aan terugkerende afwijkingen aan de cornea, pijn, ontsteking, en het verlies van het gezichtsvermogen.

Voorheen, een muizenmodel van LSCD beschreven en vergeleken met twee andere modellen. Het doel was om een ​​consistente muismodel van LSCD dat zowel bootst het fenotype bij mensen en duurt lang genoeg om het mogelijk de ziekte pathofysiologie bestuderen en nieuwe behandelingen te evalueren produceren. Hier is de techniek gedetailleerder beschreven.

Een gemotoriseerde werktuig met een roterende frees is ontworpen om de roest ringen van het corneale oppervlak te verwijderen of om de pterygium bed glad patiënten. Het is een geschikte inrichting om het gewenste LSCD model te maken. Het is een direct beschikbaar, eenvoudig te gebruiken tool met een fijne tip dat het geschikt is voor het werken op kleine ogen maakt, zoalsin muizen. De toepassing voorkomt onnodige trauma aan het oog en het niet leidt tot ongewenste verwondingen, zoals vaak het geval is bij chemische verwonding modellen. In tegenstelling tot een botte schraper, verwijdert het epitheel van de basale membraan. In dit protocol werd het limbale gebied tweemaal afgesleten, en vervolgens werd het gehele hoornvliesepitheel geschoren van limbus tot limbus. Om stroma letsel te voorkomen, werd verzorgd het hoornvlies niet te poetsen wanneer het epitheel was al verwijderd.

Inleiding

Het hoornvliesepitheel is vereist om de duidelijkheid en integriteit van de cornea te behouden. Het voortdurend wordt ververst gedurende het hele leven van de epitheliale stamcellen die in de limbus-een smalle zone op de kruising van het hoornvlies en het bindvlies. Deze zelf-vernieuwing van limbale stamcellen spelen een cruciale rol in het regenereren van het hoornvliesepitheel, zowel normaal en na een blessure. Gedeeltelijke of volledige uitputting van stamcellen resulteert in cornea-erosie, pijn, corneale littekenvorming en neovascularisatie uiterlijk van slijmbekercellen en indien onbehandeld, corneale blindheid. Deze aandoening staat bekend als limbale stamcellen deficiëntie (LSCD) en kan idiopathische worden; erfelijke; of verworven als gevolg van chemische of thermische verwondingen, op lange termijn contactlenzen dragen, en chronische ontsteking ^1-6.

Onderzoek naar LSCD is een geschikte diermodel dat niet alleen bootst de ziekte bij mensen, maar reproduceerbaar en duurzaam met de minst eenmount van letsel aan andere hoornvlies en oculaire structuren. Dit model is noodzakelijk om behandelingen te beoordelen en de mechanismen ziekte op moleculaire en cellulaire niveaus verduidelijken. ¹ als hiervoor beschreven, met behulp van een roterende frees, kan men gemakkelijk ontwikkelen een muismodel van LSCD dat de bovengenoemde voordelen biedt en blijft gedurende ten minste drie maanden. Het doel van deze studie is om een ​​eenvoudige, reproduceerbare en duurzame muismodel van LSCD presenteren.

De roterende braam is een handige tool die gelijkmatig verwijdert het epitheel zonder verwonden de onderliggende stroma ^1. Het is gebruikt om centrale corneale erosie ^{7, 8} in wondgenezing studies induceren. Het hierbij gepresenteerde techniek LSCD creëren een muis is niet eerder gerapporteerd. Eerder geïntroduceerde methoden schrapen het epitheel met een stompe spatel resulteren in een minder uniform letsel-vooral de limbus-en een variabel fenotype ^{1, 9,} meer uitgevoerde restauratief normale hoornvliesepitheel ^1. In tegenstelling tot de stompe schraper, de roterende frees verwijdert het epitheliale basismembraan en ^{7, 8, 10.} Andere gerapporteerde methoden om stamcellen te scheiden omvatten het gebruik van chemische stoffen, zoals natriumhydroxide, n-heptanol en benzalkoniumchloride, die niet alleen ongewenste schade kunnen veroorzaken aan de onderliggende oogstructuren, maar ook kan leiden tot significante ontsteking en daaropvolgende corneale troebelingen of epitheliale squameuze metaplasie ^11-15. De roterende braam wordt niet geassocieerd met deze ernstige complicaties. Het chirurgisch verwijderen van de limbale epitheel, alleen of met het gebruik van chemicaliën ^{10, 11, 16,} is moeilijk uit te voeren en is niet de beste optie bij dieren met kleine ogen en een dunne limbale epitheel (zoals muizen). Bovendien, verrassend, limbectomy kan nog steeds laat een aantal van de limbale epitheel achter ^10.

De hieronder beschreven techniek leidt tot een LSCD met neovascularisatied conjunctivalization dat de presentatie van de volledige LSCD bij patiënten nabootst en duurt ten minste drie maanden ^1. Het is geschikt voor mensen die willen LSCD of wondgenezing pathofysiologie, immunologie en mogelijke behandelingen in muizen te bestuderen. Eventueel met enkele wijzigingen, deze procedure kan worden uitgevoerd bij ratten of konijnen ^10. Aangezien de roterende braam efficiënt het epitheel verwijderd, kan worden gebruikt in elk onderzoek over corneale epitheel abrasie / verwonding en verwante behandeling of moleculaire biologisch onderzoek.

Protocol

Alle procedures uitgevoerd op dieren aan de Vereniging voor Onderzoek in Visie en Oogheelkunde verklaringen voor het gebruik van dieren in de visie onderzoek. Veertien van vier tot zes maanden oude mannelijke / vrouwelijke C57BL / 6J wild-type muizen werden gebruikt: tien muizen voor de schade model en vier als controle dieren (verwonde hoornvlies).

1. Dierlijke Voorbereiding

1. Verdoven een muis met een intraperitoneale injectie van 100 mg / kg ketamine en 5 mg / kg xylazine mengsel. Na de narcose in werking is getreden, knijpen de teen aan de narcose diepte te bevestigen; het dier niet reageert.
2. Inspecteer het ooglid een spleetlamp voor het uitvoeren van de experimenten de afwezigheid van een eerdere cornealetsel verifiëren.
3. Druppelen een druppel 1% tetracaïne waterstofchloride op het oog. Na 60-90 seconden, het testen van de cornea reflex om de afwezigheid van de sensatie te bevestigen. Proparacaïne hydrochloride 0,5% kan worden gebruikt.
4. Wanneer het verlies van cornea sensatiebepaalde, plaats voorzichtig een daling van 5% povidonjood op het oog en het haar rond de ogen. Veeg de daling na 1 min of verspreid het op het haar rond het oog om te voorkomen dat het haar uit te bemoeien met de penpunt.

2. Schurend het hoornvliesepitheel

1. Draag chirurgische handschoenen en een jurk. Bereid de benodigde hulpmiddelen: een steriel roterende braam en een paar steriele pincet. Voor een betere controle, gebruik gebogen pincet. Plaats het gereedschap op een steriele plaat tijdens de procedure.
2. Met behulp van de gebogen pincet, stabiliseren het oog door grijpen de deksels van de nasale kant en voorzichtig proptosing het oog. Vermijd het gebruik van te veel druk.
3. Onder een chirurgische microscoop, scheren 360 ° rond de limbale gebied twee keer met behulp van de steriele roterende braam. Ga rond de limbus met een snelheid van 5-6 sec per ronde.
   NB: De braam heeft een vaste snelheid. Echter, voor te roteren met de vastgestelde snelheid, het "einde moer" worden volledig vastgedraaid.
4. Verwijder de hele hoornvliesepitheel van limbus tot limbus met de roterende braam. Voor betere resultaten, verplaats het gereedschap in een circulaire mode en houd hem enigszins parallel aan het oppervlak van de cornea te werken met de zijkant van haar tip. Zorg ervoor het stroma door niet opnieuw het poetsen van de gebieden waar het epitheel is al verwijderd niet te verwonden. Gebruik geen druk op het oog niet van toepassing. Reinig de brush tip zoals vereist.
5. Druppelen een druppel steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing op het hoornvlies en veeg eventueel vrijstaande epitheelvellen met een zacht schoonmaakdoekje.
6. Scheer de resterende epithelium, indien aanwezig.
7. Besteed aandacht aan de staart van de muis tijdens de operatie.
   LET OP: Als een beweging zich voordoet, heeft de narcose diepte verschoten en verdere injectie nodig is. Een derde tot tweederde van de primaire geïnjecteerde volume voldoende. Heeft het dier met het verdovingsmiddel medicatie overdosis.
8. Steriliseer alle instrumenten voordat u ze op een andere oog.

3. Bevestig Compleet Epitheliale Removal

1. Breng een druppel van 1 mg / ml fluoresceïne sodium op het hoornvlies. Reinig het hoornvlies na 30 sec en onderzoek onder een microscoop met een kobaltblauw filter om de volledige verwijdering van het epitheel te controleren.
   LET OP: Cornea gebieden met epitheliale gebreken worden gevisualiseerd in groen.

4. Post-Onderhoudstoets

1. Leg het dier op een verwarming deken en bewaar deze op een veilige plaats (bijvoorbeeld in zijn kooi), terwijl in het kader van herstel. Heeft een onbewuste dier niet te houden in het gezelschap van bewuste degenen.
2. Breng 1% erytromycine oogzalf. Dit zal ook voorkomen droge ogen. Ga door met de applicatie het antibioticum dagelijks voor een week.
3. Injecteer 0,1 mg / kg subcutaan buprenorfine na de procedure en opnieuw na 12 uur. Verdere injectie tweemaal per dag gedurende twee dagen.
4. Observeer het dier voor 30 - 45 min, tot volledig herstel van anesthesie.
   NOTITIE: Lichte beweging van de ademhalingsspieren van de ventrale oppervlak aan dierlijk welzijn terwijl onder herstel.

Resultaten

Binnen een maand na het uitvoeren van deze techniek, 100% van de cornea ontwikkelde oppervlakkige neovascularisatie (Figuur 1A. Er werden foto's genomen met een camera verbonden met een spleetlamp onder helderveld en kobalt blauw filter). In 18/20 (90%) van de ogen, neovascularisatie betrokken het gehele hoornvlies (Figuur 1A). In 2/20 (10%), werd neovascularisatie waargenomen in drie van de vier kwadranten cornea, maar toch bereikte het corneale cen...

Discussie

Dit artikel beschrijft een reproduceerbare en betrekkelijk eenvoudige techniek om een ​​muismodel van LSCD creëren. Er zijn een aantal belangrijke aspecten van dit model dat het vermelden waard zijn. Ten eerste, in tegenstelling modellen die chemicaliën ^{11, 12} gebruikt, de schade betreft hoofdzakelijk de oppervlakte-epitheel (en basaalmembraan), met minimale schade aan de onderliggende hoornvliesstroma of andere intraoculaire structuren. Er is dus slechts beperkte ontsteking en littekenvorming, die beide de p...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Roterende bijl: AlgerBrush II roestring verwijderaar	Rumex International Co, Clearwater, FL	16-141	0,5 mm bijl. Ook verkrijgbaar bij andere bedrijven.
Chirurgisch microscoop	Wild Heerbrugg, Zwitserland	Wild M691
Digitale camera	Nikon, Thailand
Nikon FS-2 spleetlamp	Nikon, Japan
Polyklonaal anti-CK12 antilichaam	Santa Cruz Blotechnology, CA,	SC-17101	1:100 concentratie
Monoklonaal anti-CK8 antilichaam	TROMA-I-s, Iowa City, IA	AB_531826	1:50 concentratie