Microglia (immuuncellen van de hersenen), worden gebruikt als een surrogaat biosensor om te bepalen hoe nanodeeltjes neurotoxiciteit beïnvloeden. We beschrijven een reeks experimenten die zijn ontworpen om de microgliale respons op nanodeeltjes te meten en de blootstelling van hypothalamusneuronen aan supernatant van geactiveerde microglia om neurotoxiciteit te bepalen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Microglia als een surrogaat Biosensor om te bepalen nanodeeltjes Neurotoxiciteit
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Nanodeeltjes die in luchtvervuilende stoffen worden aangetroffen, kunnen neurotransmitterprofielen veranderen, neuro-inflammatie verhogen en de hersenfunctie veranderen. Daarom zal de hier beschreven test helpen bij het verduidelijken van de rol van microglia bij neuro-inflammatie en neurodegeneratieve ziekten. Het gebruik van microglia, residente immuuncellen van de hersenen, als een surrogaat biosensor biedt nieuwe inzichten in hoe inflammatoire reacties neuronale beschadigingen mediëren. Hier gebruiken we een geïmmortaliseerde muis-microgliale cellijn, aangeduid als BV2, en beschrijven een methode voor blootstelling aan nanodeeltjes met behulp van zilveren nanodeeltjes (AgNP's) als standaard. We beschrijven hoe microglia aan nanodeeltjes kunnen worden blootgesteld, hoe nanodeeltjes uit het supernatant kunnen worden verwijderd, en hoe supernatant van geactiveerde microglia kan worden gebruikt om toxiciteit te bepalen, waarbij de overleving van hypothalamuscellen als maatstaf wordt gebruikt. Na blootstelling aan AgNP's werd de activering van BV2-microglia gevalideerd met behulp van een tumornecrosefactor alfa (TNF-α) enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA). Het supernatant werd vervolgens gefilterd om de AgNP te verwijderen en om cytokinen en andere uitgescheiden factoren in het geconditioneerde medium te laten blijven. Hypothalamuscellen werden vervolgens blootgesteld aan supernatant van AgNP-geactiveerde microglia en de overleving van neuronen werd bepaald met behulp van een resazurin-gebaseerde fluorescentie-assay. Deze techniek is nuttig voor het gebruik van microglia als een surrogaat biomarker van neuro-inflammatie en het bepalen van het effect van neuro-inflammatie op andere celtypen.
Inleiding
Milieuverontreinigingen, bijzonder diegenen van de nanodeeltjes (NP) range (1-20 nm diameter), zijn gekoppeld aan obesitas en andere neurodegeneratieve ziekten als gevolg van het vermogen om de bloed-hersenbarrière passeren 1-3. Verhoogde blootstelling aan verontreiniging kan ontsteking veroorzaken in het centrale zenuwstelsel waaronder de hypothalamus 1. Een mogelijk mechanisme waarop dit gebeurt kunnen plaatsvinden door middel nanodeeltjes activatie van microglia (hersenen immuuncellen) 4. Voorafgaande studies die in vivo modellen om de effecten van NPs gezondheid hersenen die tijdrovend, kostbaar zijn bestuderen, en niet d....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Microgliale Cell Culture Onderhoud
- Warme celkweekmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine / neomycine (PSN) tot 37 ° C.
- Verkrijgen bevroren voorraad van BV2 microglia cellen bij passage 18-25 uit de opslag bij -80 ° C. Snel ontdooien cellen in 37 ° C waterbad.
- Voorzichtig cellen overbrengen naar een 75 cm2 kolf ontlucht met 10 ml celkweekmedium.
- Incubeer kolf in 5% CO2 bij 37 ° C. Zuig media na 24 uur en te vervangen door vers medium. Grow cellen tot ongeveer 70 - 80% samenvloeiing.
....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We laten zien dat microglia fungeren als surrogaat biosensor voor hersenen reactie op nanodeeltjes met het bovenstaande protocol. Onze resultaten zijn onder andere meting van de toxische effecten van microglia activatie op downstream neuronale celdood. Figuur 1 toont een workflow van het protocol bij microglia activeren en bepalen of uitgescheiden cytokines levensvatbaarheid van de hypothalamus neuronen te verminderen. TNF-α secretie was significant toegenomen na blootst.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Recente studies ondersteunen dat blootstelling aan het milieu bijdraagt aan obesitas en andere neurodegeneratieve ziekten 11,12. Echter, technieken die in eerdere studies werden gebruikt, zijn tijdrovend en duur. Economische overwegingen, fysiologisch relevante afleveringssystemen, ethische kwesties met uitgebreid gebruik van in vivo diermodellen en de moeilijkheid om bevindingen te vertalen in zinvolle gezondheidsadviezen zijn enkele van de grote uitdagingen die de vooruitgang in het onderzoek naar N.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door het Amerikaanse Department of Veterans Affairs BLR&D IK2 BX001686 (aan TAB), en subsidies van het University of Minnesota Healthy Foods, Healthy Lives Institute (aan CMD, JPN, en TAB) en de Minnesota Veterans Medical Research & Education Foundation (aan TAB). We danken Drs. Philippe Marambaud (Feinstein Institute for Medical Research, Manhasset, NY) en Weihua Zhao (Methodist Hospital, Houston, TX) voor het verstrekken van de BV2 cellijn.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cellen/Reagentia | |||
| Mouse microgliale cellijn (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italië) | ATL03001 | |
| Volwassen muis hypothalamus cellijn mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetaal bovien serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicilline/Streptomycine/Neomycine | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Zilveren nanodeeltjes (20 nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Celviabiliteitsreagens | Invitrogen | A13262 | |
| Muis TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Natriumcitraat | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Apparatuur | |||
| 96 W Optische Bodemplaat, Zwart Polystyreen, Voor Celcultuur Behandeld, met deksel, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugaalfiltereenheid met Ultracel-10 membraan | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50 ml Conische Centrifugeerbuizen | Corning, Inc | 14-432-22 | |
| Falcon Celzeevers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabelcentrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
Referenties
- Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease. Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).
- Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. Physiological daily inhalation rates for health risk asse....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
