Methodenartikel

Microglia als een surrogaat Biosensor om te bepalen nanodeeltjes Neurotoxiciteit

DOI:

10.3791/54662

⸱

25 oktober 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Minneapolis Veterans Affairs Health Care System, 2Department of Food Science and Nutrition, University of Minnesota, 3Biomedical Informatics and Computational Biology Program, University of Minnesota, 4Minnesota Obesity Center, University of Minnesota

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia (immuuncellen van de hersenen), worden gebruikt als een surrogaat biosensor om te bepalen hoe nanodeeltjes neurotoxiciteit beïnvloeden. We beschrijven een reeks experimenten die zijn ontworpen om de microgliale respons op nanodeeltjes te meten en de blootstelling van hypothalamusneuronen aan supernatant van geactiveerde microglia om neurotoxiciteit te bepalen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanodeeltjes die in luchtvervuilende stoffen worden aangetroffen, kunnen neurotransmitterprofielen veranderen, neuro-inflammatie verhogen en de hersenfunctie veranderen. Daarom zal de hier beschreven test helpen bij het verduidelijken van de rol van microglia bij neuro-inflammatie en neurodegeneratieve ziekten. Het gebruik van microglia, residente immuuncellen van de hersenen, als een surrogaat biosensor biedt nieuwe inzichten in hoe inflammatoire reacties neuronale beschadigingen mediëren. Hier gebruiken we een geïmmortaliseerde muis-microgliale cellijn, aangeduid als BV2, en beschrijven een methode voor blootstelling aan nanodeeltjes met behulp van zilveren nanodeeltjes (AgNP's) als standaard. We beschrijven hoe microglia aan nanodeeltjes kunnen worden blootgesteld, hoe nanodeeltjes uit het supernatant kunnen worden verwijderd, en hoe supernatant van geactiveerde microglia kan worden gebruikt om toxiciteit te bepalen, waarbij de overleving van hypothalamuscellen als maatstaf wordt gebruikt. Na blootstelling aan AgNP's werd de activering van BV2-microglia gevalideerd met behulp van een tumornecrosefactor alfa (TNF-α) enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA). Het supernatant werd vervolgens gefilterd om de AgNP te verwijderen en om cytokinen en andere uitgescheiden factoren in het geconditioneerde medium te laten blijven. Hypothalamuscellen werden vervolgens blootgesteld aan supernatant van AgNP-geactiveerde microglia en de overleving van neuronen werd bepaald met behulp van een resazurin-gebaseerde fluorescentie-assay. Deze techniek is nuttig voor het gebruik van microglia als een surrogaat biomarker van neuro-inflammatie en het bepalen van het effect van neuro-inflammatie op andere celtypen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Milieuverontreinigingen, bijzonder diegenen van de nanodeeltjes (NP) range (1-20 nm diameter), zijn gekoppeld aan obesitas en andere neurodegeneratieve ziekten als gevolg van het vermogen om de bloed-hersenbarrière passeren 1-3. Verhoogde blootstelling aan verontreiniging kan ontsteking veroorzaken in het centrale zenuwstelsel waaronder de hypothalamus 1. Een mogelijk mechanisme waarop dit gebeurt kunnen plaatsvinden door middel nanodeeltjes activatie van microglia (hersenen immuuncellen) 4. Voorafgaande studies die in vivo modellen om de effecten van NPs gezondheid hersenen die tijdrovend, kostbaar zijn bestuderen, en niet direct de vraag hoe NPs beïnvloeden microglia beantwoorden. Microglia spelen een veelzijdige rol in het centrale zenuwstelsel, zoals het onderhoud van de hersenen en micro communiceren met omgeving neuronen via de afgifte van uitgescheiden factoren en cytokinen. Afhankelijk van de stimuli, kan microglia worden geactiveerd om een ​​M1 pro-inflammatoire of een M2 anti-inflammatoire toestand. Bijvoorbeeld M1 geactiveerde microglia vrijgeven pro-inflammatoire cytokines zoals tumor necrose factor alpha (TNF-α), terwijl M2 microglia afgifte anti-inflammatoire cytokinen geactiveerd zoals interleukine-4 (IL-4). Om onze surrogaat in vitro biosensor te valideren voor het bepalen van neurotoxiciteit van luchtverontreinigende stoffen, we gemeten microglia respons op 20 nm zilver nanodeeltjes (AgNPs). Het doel van dit artikel wordt beschreven hoe een in vitro microgliacellen cellijn kan worden gebruikt als een surrogaat marker voor biosensor testen muizen microgliale reactie op NPs en hoe microgliale activering beïnvloedt hypothalamus cellen. De lange termijn beoogde toepassing van deze gevalideerd model is om de effecten van real-world stoffen op de gezondheid van de hersenen en neurodegeneratieve ziekte te testen. Wij een gedetailleerde beschrijving van een in vitro 96 putjes format assay voor het meten van microgliale activering en hypothalamus celoverleving na blootstelling van mic roglial geconditioneerde media.

Microgliale activering werd bepaald na AgNP blootstelling door TNF-α enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA). Om het effect van geactiveerde microglia op hypothalamus cellen te bepalen werden de AgNPs uit microglia supernatant (geconditioneerde media) met een filtreerinrichting. De filtratie-apparaat behoudt cytokines met uitsluiting van de AgNPs op basis van grootte. In het kort supernatans van microglia behandeld met of zonder AgNPs werd verzameld, toegevoegd aan de filters en gecentrifugeerd bij 14.000 xg gedurende 15 min. We konden vervolgens de invloed van microgliale uitgescheiden cytokines op hypothalamus cellevensvatbaarheid te bepalen. Cel toxiciteit na blootstelling aan geconditioneerde media (bevattende cytokines) werd bepaald via een resazurin gebaseerde assay zoals eerder beschreven 5,6. Metabool actieve cellen reduceren resazurin en produceren een fluorescentiesignaal evenredig met het aantal levensvatbare cellen 7.

nt "> Er zijn verschillende voordelen van het gebruik van deze techniek anderen (zoals co-cultuur, trans-well opstellingen of in vivo). Ons model biedt de mogelijkheid om direct activeren microglia en bepalen of uitgescheiden factoren toxisch voor neuronen 8 . het huidige protocol gebruikt geïmmortaliseerde BV2 microglia gestimuleerd met 20 nm diameter nanodeeltjes en geïmmortaliseerde muizen hypothalamus cellen (aangeduid mHypo-A1 / 2) 9 voor het bepalen van verdere reactie. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor deze specifieke omstandigheden, de werkwijzen kunnen worden veranderd te worden gebruikt in andere modellen van microgliale geïnduceerde celdood of andere celtypen waaronder primaire microglia en neuronen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Microgliale Cell Culture Onderhoud

  1. Warme celkweekmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine / neomycine (PSN) tot 37 ° C.
  2. Verkrijgen bevroren voorraad van BV2 microglia cellen bij passage 18-25 uit de opslag bij -80 ° C. Snel ontdooien cellen in 37 ° C waterbad.
  3. Voorzichtig cellen overbrengen naar een 75 cm2 kolf ontlucht met 10 ml celkweekmedium.
  4. Incubeer kolf in 5% CO2 bij 37 ° C. Zuig media na 24 uur en te vervangen door vers medium. Grow cellen tot ongeveer 70 - 80% samenvloeiing.

2. Tellen en Plating Cellen

  1. In een 37 ° C waterbad, warm DMEM en 1x-trypsine-EDTA-oplossing.
  2. Aspireren media van cellen en voeg 500 ul van trypsine. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2-5 min.
  3. Met behulp van een schraper, verwijdert cellen uit de kolf en op te schorten in 5 mlDMEM. Cellen passeren door een 70 urn zeef in een 50 ml buisje driemaal.
  4. Aantal cellen met een hemocytometer en zaden 8000 cellen / putje in een ommuurde zwarte heldere bodem plaat in een eindvolume van 200 ul DMEM gesupplementeerd met 10% FBS en 1% PSN. Incubeer plaat in 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 24 uur.
  5. Verwijderen oude DMEM en vervangen door 200 ui DMEM aangevuld verwarmd met 1% PSN serum verhongeren microglia. Incubeer plaat in 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 24 uur.

3. Activeren Microglia

  1. In afzonderlijke buisjes verdund AgNPs (0,01, 0,05 of 0,1 ug / ml) en voertuig / neutraal sturingspunt (natriumcitraat, 0,04 mM) in serumvrij DMEM aangevuld met 1% PSN uiteindelijke werkende concentraties.
  2. Verwijder 100 ul van de media uit elk putje en te vervangen door 100 ul van een passende behandeling verbinding.
  3. Incubeer plaat in 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 24 uur.

4. Filtering geconditioneerde media

  1. Verzamel 200 pl medium supernatant uit elk putje en over in een filter (molecuulgewicht cutoff van 10 kDa) met verzamelbuis (1,5-2 ml).
  2. Centrifugeer bij 14.000 xg bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
  3. Gooi het doorstroomkanaal (supernatant met deeltjes) en plaats de filter omgekeerd in een nieuwe verzamelbuis.
  4. Centrifugeer bij 1000 xg bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
    Opmerking: Het verkregen gefiltreerde medium (bevattende uitgescheiden cytokinen) wordt geconcentreerd door zesvoudige.
  5. Breng het volume van het concentraat tot 400 ul vers DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% PSN en bewaar op ijs.
    OPMERKING: Om ervoor te zorgen resterende AgNPs zijn van een gefilterde media verwijderd, wordt een AgNP concentratie op basis van de karakteristieke piek bij ongeveer 390-420 nm 10. Kort samengevat, aliquots van ongefilterde AgNPs (0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1 en 0,2 ug / ml zoals beschreven in stap 3,1) en gefiltreerdmediumcontrole (natriumcitraat, 0,04 mM) in serumvrij DMEM. Aliquot 50 pi gefilterde monsters en standaarden in een zwart ommuurde duidelijk bodemplaat. Met behulp van een spectrofotometer, meet absorptie bij 390-410 nm en vergelijken lezingen aan de AgNP concentratie curve. Indien gefilterde monsters dezelfde absorptiewaarde als het voertuig controle monster, kan worden aangenomen resterende AgNPs verwijderd.
  6. Gebruik de helft van de gefiltreerde media TNF-α secretie volgende instructies bepalen van een commercieel verkrijgbare kit.

5. hypothalamus Cell Culture Onderhoud

  1. Warme DMEM kweekmedium aangevuld met 10% FBS en 1% PSN tot 37 ° C.
  2. Verkrijgen bevroren voorraad van de hypothalamus (mHypo-A1 / 2) cellen bij passage 18-25 opgeslagen bij 80 ° C. Snel ontdooien cellen in 37 ° C waterbad.
  3. Voorzichtig cellen overbrengen naar een 75 cm2 kolf ontlucht met 10 ml celkweekmedium.
  4. Incubeer kolf in 5% CO 2 bij 37 ° C. Zuig media na 24 uur en te vervangen door vers medium. Cellen groeien tot ongeveer 70 - 80% confluentie.

6. Het bepalen van de hypothalamus Cell Toxicity

  1. Warme DMEM en 1 x trypsine-EDTA-oplossing in een 37 ° C waterbad.
  2. Aspireren media van de hypothalamus cellen en voeg 500 ul van trypsine. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2-5 min. Verwijderen cellen van kolf met een schraper zoals hierboven in stap 2.
  3. Aantal cellen met een hemocytometer en plaat hypothalamus cellen bij 5000 cellen / putje in een zwarte wanden heldere bodemplaat in een eindvolume van 200 ul DMEM gesupplementeerd met 10% FBS en 1% PSN en overnacht incuberen in 5% CO2 bij 37 ° C .
  4. Verwijder 100 pl oude media met een multichannel pipet en voeg 100 gl gefiltreerd geconcentreerd geconditioneerd medium tot een uiteindelijke concentratie van 1x.
  5. Incubeer plaat in 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 24 uur.
  6. Voeg 221, l Resazurin reagens en incubeer dienblad 20 min in 5% CO2 bij 37 ° C.
  7. Met behulp van een multimode spectrofotometer, opnemen fluorescentie (560 nm EX / 590 nm EM) levensvatbaarheid van de cellen te meten. Rapporteren resultaten als relatieve fluorescentie-eenheden (RFU).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We laten zien dat microglia fungeren als surrogaat biosensor voor hersenen reactie op nanodeeltjes met het bovenstaande protocol. Onze resultaten zijn onder andere meting van de toxische effecten van microglia activatie op downstream neuronale celdood. Figuur 1 toont een workflow van het protocol bij microglia activeren en bepalen of uitgescheiden cytokines levensvatbaarheid van de hypothalamus neuronen te verminderen. TNF-α secretie was significant toegenomen na blootst...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recente studies ondersteunen dat blootstelling aan het milieu bijdraagt aan obesitas en andere neurodegeneratieve ziekten 11,12. Echter, technieken die in eerdere studies werden gebruikt, zijn tijdrovend en duur. Economische overwegingen, fysiologisch relevante afleveringssystemen, ethische kwesties met uitgebreid gebruik van in vivo diermodellen en de moeilijkheid om bevindingen te vertalen in zinvolle gezondheidsadviezen zijn enkele van de grote uitdagingen die de vooruitgang in het onderzoek naar N...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door het Amerikaanse Department of Veterans Affairs BLR&D IK2 BX001686 (aan TAB), en subsidies van het University of Minnesota Healthy Foods, Healthy Lives Institute (aan CMD, JPN, en TAB) en de Minnesota Veterans Medical Research & Education Foundation (aan TAB). We danken Drs. Philippe Marambaud (Feinstein Institute for Medical Research, Manhasset, NY) en Weihua Zhao (Methodist Hospital, Houston, TX) voor het verstrekken van de BV2 cellijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cellen/Reagentia
Mouse microgliale cellijn (BV2)Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italië)ATL03001
Volwassen muis hypothalamus cellijn mHypoA-1/2 Cellutions Biosystems Inc.CLU172
Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle’s MediumInvitrogen10313-039
Fetaal bovien serum PAA LabsA15-751
Penicilline/Streptomycine/NeomycineThermo Fisher Scientific15640-055
Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200056
Zilveren nanodeeltjes (20 nm)Sigma-Aldrich730793

PrestoBlue Celviabiliteitsreagens		InvitrogenA13262
Muis TNF-α ELISA Max DeluxBiolegend430904
LipopolysaccharideSigma-AldrichL4391
NatriumcitraatSigma-AldrichS4641
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Apparatuur
96 W Optische Bodemplaat, Zwart Polystyreen, Voor Celcultuur Behandeld, met deksel, SterileThermo Fisher Scientific165305
Amicon Ultra-0.5 Centrifugaalfiltereenheid met Ultracel-10 membraanEMD MilliporeUFC501008
SpectraMax M5 Multi-Mode MicroplateMolecular DevicesM5
Falcon 50 ml Conische CentrifugeerbuizenCorning, Inc
14-432-22
Falcon Celzeevers 70 μmCorning, Inc08-771-2
Tabelcentrifuge 5430Eppendorf22620560

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease. Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).
  2. Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. Physiological daily inhalation rates for health risk assessment in overweight/obese children, adults, and elderly. Risk Anal. 34, 567-582 (2014).
  3. Jerrett, M., et al. Traffic-related air pollution and obesity formation in children: a longitudinal, multilevel analysis. Environ Health. 13, 49(2014).
  4. Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int J Environ Res Public Health. 8, 2980-3018 (2011).
  5. Duffy, C. M., et al. Role of orexin A signaling in dietary palmitic acid-activated microglial cells. Neurosci Lett. 606, 140-144 (2015).
  6. Butterick, T. A., et al. Use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model. J Vis Exp. , (2014).
  7. Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl Biochem Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
  8. Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, 229-237 (1990).
  9. Belsham, D. D., et al. Ciliary neurotrophic factor recruitment of glucagon-like peptide-1 mediates neurogenesis, allowing immortalization of adult murine hypothalamic neurons. FASEB J. 23, 4256-4265 (2009).
  10. Paramelle, D., et al. A rapid method to estimate the concentration of citrate capped silver nanoparticles from UV-visible light spectra. Analyst. 139, 4855-4861 (2014).
  11. Wei, Y., et al. Chronic exposure to air pollution particles increases the risk of obesity and metabolic syndrome: findings from a natural experiment in Beijing. FASEB J. , (2016).
  12. Levesque, S., Surace, M. J., McDonald, J., Block, M. L. Air pollution & the brain: Subchronic diesel exhaust exposure causes neuroinflammation and elevates early markers of neurodegenerative disease. J Neuroinflammation. 8, 105(2011).
  13. Block, M. L., et al. The outdoor air pollution and brain health workshop. Neurotoxicology. 33, 972-984 (2012).
  14. Carson, M. J., Crane, J., Xie, A. X. Modeling CNS microglia: the quest to identify predictive models. Drug Discov Today Dis Models. 5, 19-25 (2008).
  15. Valdearcos, M., et al. Microglia dictate the impact of saturated fat consumption on hypothalamic inflammation and neuronal function. Cell Rep. 9, 2124-2138 (2014).
  16. Perry, V. H., Holmes, C. Microglial priming in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurol. 10, 217-224 (2014).
  17. Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem Soc Trans. 35, 1127-1132 (2007).
  18. Vincenti, J. E., et al. Defining the Microglia Response during the Time Course of Chronic Neurodegeneration. J Virol. 90, 3003-3017 (2015).
  19. Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19, 504-516 (2016).
  20. Lull, M. E., Block, M. L. Microglial activation and chronic neurodegeneration. Neurotherapeutics. 7, 354-365 (2010).
  21. Oeckinghaus, A., Hayden, M. S., Ghosh, S. Crosstalk in NF-kappaB signaling pathways. Nat Immunol. 12, 695-708 (2011).
  22. Gifford, J. C., et al. Thiol-modified gold nanoparticles for the inhibition of Mycobacterium smegmatis. Chem Commun (Camb). 50, 15860-15863 (2014).
  23. Colella, M., Lobasso, S., Babudri, F., Corcelli, A. Palmitic acid is associated with halorhodopsin as a free fatty acid. Radiolabeling of halorhodopsin with 3H-palmitic acid and chemical analysis of the reaction products of purified halorhodopsin with thiols and NaBH4. Biochim Biophys Acta. 1370, 273-279 (1998).
  24. Sherry, B., Jue, D. M., Zentella, A., Cerami, A. Characterization of high molecular weight glycosylated forms of murine tumor necrosis factor. Biochem Biophys Res Commun. 173, 1072-1078 (1990).
  25. PubChem Compound Database. , National Center for Biotechnology Information. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755 (2004).
  26. Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
  27. McCarthy, R. C., et al. Characterization of a novel adult murine immortalized microglial cell line and its activation by amyloid-beta. J Neuroinflammation. 13, (2016).
  28. Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos Environ. 30, 3837-3855 (1996).
  29. Kleeman, M. J., et al. Source apportionment of fine (PM1.8) and ultrafine (PM0.1) airborne particulate matter during a severe winter pollution episode. Environ Sci Technol. 43, 272-279 (2009).
  30. Borm, P. J., et al. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC. Part Fibre Toxicol. 3, (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microglia biosensorzilvernanodeeltjesBV2 microgliacellenTNF alfa ELISAfiltratie van geconditioneerd mediumoverleving van hypothalamische cellenresazurine fluorescentie assayneuro inflammatie assaymicroglia activering

Gerelateerde artikelen