Methodenartikel

Methoden om te studeren Lipidenveranderingen in neutrofielen en de daaropvolgende vorming van neutrofielen Extracellulaire Traps

DOI:

10.3791/54667

⸱

29 maart 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiological Chemistry, University of Veterinary Medicine Hannover, 2Fish Disease Research Unit, University of Veterinary Medicine, 3Department of Clinical Sciences, Biomedical Center, Lund University, 4Research Center for Emerging Infections and Zoonoses (RIZ), University of Veterinary Medicine Hannover

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipiden is bekend dat ze een belangrijke rol in cellulaire functies spelen. We beschrijven een werkwijze om de lipidesamenstelling van neutrofielen te bepalen, met de nadruk op het cholesterolgehalte, door zowel HPTLC en HPLC aan een beter begrip van de onderliggende mechanismen van neutrofielen extracellulaire val vorming krijgen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipide-analyse uitgevoerd door hoge prestatie dunnelaagchromatografie (HPTLC) is een relatief eenvoudige, kosteneffectieve werkwijze voor het analyseren van een breed scala aan lipiden. De functie van lipiden (bijvoorbeeld in gastheer-pathogeen interacties of gastheer entry) is gemeld dat zij een cruciale rol in de cellulaire processen. Hier tonen wij een werkwijze voor lipidesamenstelling te bepalen, met een focus op het cholesterolgehalte primaire bloed afgeleide neutrofielen door HPTLC vergeleken met sterk scheidende vloeistofchromatografie (HPLC). Het doel was om de rol van lipiden / cholesterol veranderingen in de vorming van neutrofielen extracellulaire vallen (NET's) te onderzoeken. Nettovrijval is bekend als een afweer mechanisme om ziektekiemen te voorkomen verspreiding in de gastheer. Daarom werden bloed-afkomstige humane neutrofielen behandeld met methyl-β-cyclodextrine (MβCD) lipide veranderingen induceren in de cellen. Gebruik HPTLC en HPLC, hebben we aangetoond dat MβCD behandeling van de cellen leidt tot lipideveranderingen geassocieerd met een significante verlaging van het cholesterolgehalte van de cel. Tegelijkertijd, MβCD behandeling van neutrofielen leidde tot de vorming van NET, zoals getoond door immunofluorescentie microscopie. Kortom, hier presenteren we een gedetailleerde methode om lipide veranderingen in neutrofielen en de vorming van de netten te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipiden is aangetoond dat ze een belangrijke rol spelen in cel homeostase, celdood, gastheer-pathogeen interacties, en cytokine release 1. Na verloop van tijd, belangstelling voor en kennis over de impact van lipiden in gastheer-pathogeen interacties of ontsteking zijn toegenomen, en verschillende publicaties bevestigen de centrale rol van bepaalde lipiden, in het bijzonder de steroïde cholesterol, in cellulaire reacties. Farmacologische behandeling met statinen, die als remmers van cholesterol-biosynthese worden door blokkeren van 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym-A-reductase (HMG-CoA-reductase), kan fungeren als anti-inflammatoire middelen door verlaging van de serumspiegels van interleukine 6 en C-reactief proteïne 2. Cholesterol en glycosphingolipide verrijkte structuren kan worden gebruikt door verschillende pathogenen, zoals bacteriën en virussen, als toegangspoort tot de host 3, 4, 5,class = "xref"> 6. Sfingolipiden (zoals sfingomyeline) bleken te gebruiken door ziekteverwekkers hun pathogeniciteit 7 bevorderen. In macrofagen, mycobacteriën gebruik cholesterol-verrijkte domeinen cellen binnendringt; een uitputting van cholesterol remt mycobacteriële opname 8. Bovendien infectie van macrofagen met Francisella tularensis, een zooenoseverwekker belast tularemie (ook bekend als konijn koorts) 9, geleid tot een infectie die werd afgeschaft toen cholesterol werd ontdaan van de membranen 10. Ook de invasie van gastheercellen door Escherichia coli via lipide-rijke structuren werd aangetoond dat cholesterol-afhankelijke 4 zijn. Bovendien Salmonella typhimurium besmettingsexperimenten epitheelcellen aangetoond dat cholesterol essentieel pathogeen binnenkomst in de cellen 11. Cholesterol uitputting inhibited de opname van Salmonella 11. Bovendien, een recente studie van Gilk et al. aangetoond dat cholesterol een belangrijke rol bij de opname van Coxiella burnetii 12 speelt. Bovendien Tuong et al. bleek dat 25-hydroxycholesterol een cruciale rol in fagocytose door lipopolysaccharide (LPS) speelt gestimuleerde macrofagen 13. Fagocytose werd verminderd wanneer macrofagen farmacologisch werden getrakteerd op cholesterol 14 afbreken. Zo, cholesterol en andere lipiden lijken een belangrijke rol bij infecties en ontstekingen te spelen, omdat hun uitputting het risico op invasie van een aantal ziekteverwekkers 10, 11, 12 kan verminderen.

Onlangs waren we in staat om aan te tonen dat Lipidenveranderingen, in het bijzonder de uitputting van cholesterol uit de cel, induceren de vorming van neutrofielen extracellular vallen (NET) in menselijk bloed afgeleide neutrofielen 15. Sinds de ontdekking van NET in 2004, hebben ze aangetoond dat cruciale rol spelen in bacteriële beknelling, en dus belemmeren de verspreiding van de infectie 16, 17. NET bestaan uit een DNA skelet geassocieerd met histonen, proteasen en antimicrobiële peptiden 16. De afgifte van het NET door neutrofielen kan worden geïnduceerd door binnendringende ziekteverwekkers 18, 19 en chemicaliën zoals forbol myristaat acetaat (PMA) of statines 16, 20. Echter, de gedetailleerde cellulaire mechanismen, en in het bijzonder de rol van lipiden in dit proces, zijn nog steeds niet helemaal duidelijk. De analyse van de lipiden kan leiden tot een beter begrip van de betrokken in een breed scala van cellulaire processen en interacties, zoals de vrijlating van de netten mechanismen. CholesteRol en sfingomyeline zijn vitale bestanddelen van het celmembraan en lipide microdomeinen, waar stabiliteit toe te voegen en het clusteren van de bij eiwittransport en signaleringsgebeurtenissen 21 eiwitten bevorderen. De mechanistische rol van bepaalde lipiden, amfifiele farmacologische middelen, zoals de cyclische oligosaccharide methyl-β-cyclodextrine (MβCD) onderzoeken kunnen worden toegepast om de lipidesamenstelling van een cel veranderen en cholesterol in vitro 15 verminderen. Hier presenteren we een methode om HPTLC gebruiken om de lipide samenstelling van neutrofielen te analyseren in reactie op MβCD. HPLC werd gebruikt om het niveau van cholesterol in de neutrofielen bevolking te bevestigen. Verder beschrijven we een werkwijze voor de vorming van NET door immuunfluorescentiemicroscopie in menselijk bloed afgeleide visualiseren neutrofielen als reactie op MβCD.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De collectie van het perifere bloed in dit protocol werd goedgekeurd door de lokale human onderzoek ethische commissie. Alle proefpersonen op voorwaarde dat hun informed consent.

1. Isolatie van Menselijk bloed afkomstige neutrofielen door dichtheidsgradiënt centrifugeren

  1. Isolatie van humaan bloed afgeleide neutrofielen
    1. Laag ~ 20 ml bloed op 20 ml natrium diatrizoaat / dextran-oplossing bij een vlam en zonder menging.
    2. Centrifugeer 30 min bij 470 xg zonder rem.
    3. Verwijder de mononucleaire cellen en het gelige plasmalaag. Breng de polymorfonucleaire cellen (PMN) fase (tweede fase met accumulatie cellen; Figuren 1 en 2) naar een nieuwe buis van 50 ml en vul tot 50 ml met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
    4. Centrifugeer 10 min bij 470 xg met rem.
    5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 5 ml steriel water for5 en de erytrocyten te lyseren.
    6. Onmiddellijk vul tot 50 ml met 1x PBS en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 470 x g.
    7. Verwijder het supernatant. De pellet moet wit zijn. Als het nog steeds rood, herhaalt u de stappen 1.1.5 en 1.1.6.
    8. Resuspendeer de pellet in 1000 pl Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium. Tel het aantal cellen met behulp van trypan blauw kleuring in een hemocytometer onder een lichtmicroscoop.
    9. Bereid een celsuspensie in RPMI bij een concentratie van 2 x 10 6 / ml. Ongeveer 2,5 x 10 7 neutrofielen kunnen worden geoogst uit 20 ml bloed.
  2. Farmacologische behandeling van neutrofielen op lipide analyses
    1. Met 5 x 10 7 cellen uit stap 1.1.9. Pas het aantal cellen in zuivere Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) medium in aanwezigheid of afwezigheid van 10 mM MβCD of 25 nM PMA in een totaal volume van 300 pl in een 1,5 ml reactiebuis.
    2. Incubeer de monsters in dereactiebuizen gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
    3. Centrifugeer 10 min bij 470 xg met rem.
    4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 300 ui HBSS.
    5. Centrifugeer 10 min bij 470 xg met rem.
    6. Resuspendeer de celpellet in 1 ml chloroform / methanol (1: 1), gehomogeniseerd met een 26 G injectienaald door zuigen het monster in en uit in een 1 ml injectiespuit 10 keer, en de monsters bewaren bij -20 ° C.
  3. Farmacologische behandeling van neutrofielen voor NET kwantificering van immunofluorescentie
    1. Bereid poly-L-lysine-gecoate 48-well platen met glazen dekglaasjes.
      1. Plaats een 8-mm glazen dekglaasje in elk putje, voeg 55 ul steriel 0,01% poly-L-lysine en incubeer gedurende ~ 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    2. Tweemaal wassen met 200 pi 1X PBS. Opslaan van de platen met 200 pi 1X PBS per putje in de koelkast totdat ze nodig.
    3. Autoefully 100 ul celsuspensie (2 x 10 5/100 ul) toe uit stap 1.1.9 per putje in het midden van elke dekglaasje.
    4. Voeg 100 ul per putje van hetzij de laatste 10 mM MβCD of de laatste 25 nM PMA.
    5. Centrifugeren gedurende 5 min bij 370 xg met rem.
    6. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
    7. Centrifugeren gedurende 5 min bij 370 xg met rem.
    8. Fixeer de cellen met 155 pl 4% PFA, wikkel ze in plastic paraffinefilm en bewaar ze overnacht bij 4 ° C of gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
      LET OP: Voor gegevens over het netto vorming geïnduceerd door MβCD, zie Neumann et al. 15.

2. Lipide Isolatie en analyse van menselijk bloed afgeleide Neutrofielen

  1. Isoleer de lipiden van menselijk perifeer bloed neutrofielen afgeleide gebaseerd op Bligh en Dyer 22 en Brogden et al. 23
    1. Neem neutrofielen uit stap 1.2.6 en leg ze op ijs.
    2. Op ijs, pipet de neutrofielen (aanwezig in methanol en chloroform oplossing) aan een 15 ml glazen buis met schroefdop met een polytetrafluorethyleen (PTFE) afdichting en homogeniseer ze door gedurende 1 min. Met glazen buizen om te voorkomen dat de lipiden binden aan kunststof oppervlakken. Met PTFE caps om verontreiniging van rubber / kunststof te voorkomen.
    3. Voeg 2 ml methanol, gevolgd door 1 min later 1 ml chloroform. Weer schudden gedurende 1 min.
    4. Roteer de glazen buizen bij kamertemperatuur en 50 rpm gedurende 30 minuten.
    5. Pellet de eiwitfractie door centrifugeren van de oplossing bij 7 ° C en 1952 x g gedurende 10 min.
    6. Voorzichtig decanteren van het supernatans in een nieuwe 15 ml glazen buis met schroefdop, waarbij de proteïne bevattende pellet achteren. Bewaar de pellet bij -20 ° C voor toekomstig kwantificering.
    7. Voeg 1 ml chloroform, wacht 1 min, voeg 1 ml dubbel gedestilleerd water, en keren de glazen schroefdop buis met het monster gedurende 30 s.
    8. Centrifugeer bij 7 ° C en 1952 x g gedurende 10 min en gooi de bovenste fase, tot aan, maar niet inclusief, de troebele laag.
    9. Eventueel uitvoeren van een eventuele verdere zuiveringsstap door het herhalen van stap 2.1.8.
    10. De monsters in een vacuümconcentrator bij 60 ° C en bewaar ze bij -20 ° C totdat ze nodig waren.
  2. Hoge prestatie dunnelaagchromatografie (HPTLC) semi-kwantificeren van de hoeveelheid verschillende lipiden, zoals cholesterol, fosfolipiden en sfingomyeline
    1. Bereid de volgende vier lopende oplossingen en kleuroplossing.
      1. Oplossing 1: Meng ethylacetaat (26,6%), 1-propanol (26,6%), chloroform (26,6%), methanol (26,6%) en kaliumchloride (9,6%). KCl bereid door het oplossen van 0,25 g KCl in 100 ml HPLC kwaliteit water.
      2. Oplossing 2: Mix n-hexaan (73%), diethylether (23%) en citroenzuur (2%).
      3. Oplossing 3: 100% n-hexaan.
      4. Bereid de kleuroplossing doormengen gedestilleerd water (90 ml) met 7,5 g kopersulfaat en voeg 10 ml fosforzuur.
    2. Vult tot 5 mm van elke oplossing in een afzonderlijke glazen kamer. Voeg eventueel soort filter papier om de loopsnelheid in elke kamer te verhogen.
    3. Pre-incubeer 20 x 10 cm HPTLC silicagel 60 glasplaat eerste running oplossing tot de oplossing running de bovenkant van de plaat bereikt. droog het vervolgens gedurende 10 minuten bij 110 ° C.
      Opmerking: Deze platen kunnen worden opgeslagen voor toekomstig gebruik in aluminiumfolie en gedurende 10 minuten bij 110 ° C voorafgaand aan gebruik.
    4. Los de lipide pellet verkregen uit stap 2.1.10 in 200 pl chloroform / methanol (1: 1) oplossing en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C op te lossen.
    5. Gebruik een liniaal en een viltstift om de belasting plekken voor het gewenste aantal monsters markeren, vermeerderd met ten minste één standaard. Markeer de afgelegde afstand bij benadering 4 cm en 6 cm voor de eerste en tweede lopende oplossing resp.
    6. De samples, was de 10 pi injectiespuit 3 maal in chloroform / methanol (1: 1) voorafgaande aan het laden van elk nieuw monster. Belasting 10 pi van elk monster druppelsgewijze en probeerde de monster zo klein mogelijk gebied te concentreren. De monsters moeten worden geladen ten minste in duplo.
    7. Plaats de plaat verticaal in de eerste kamer met stromend oplossing 1 (stap 2.2.1.1). Zorgen dat de plaat parallel aan de wand van de glazen kamer van een gelijkmatige migratie snelheid te bereiken.
    8. Zodra de oplosmiddelleiding de eerste markering heeft bereikt, verwijder de plaat, drogen en plaats deze in de tweede oplossing. Herhaal soortgelijke stappen voor de tweede en de derde lopende oplossingen; Laat de plaat in de oplossing tot het oplosmiddel voor de bovenkant van de plaat bereikt, verwijder en drogen bij KT gedurende 1 minuut.
    9. Plaats plaat kopersulfaatoplossing 7 s. Verwijderen van de plaat, het grondig te drogen en bakken in een oven gedurende 7 minuten bij 170 ° C. Wacht tot de plaat af te koelen.
    10. Using dunnelaagchromatografie en gel analyse software, en een beeldverwerkingssoftware, scannen en analyseren zoals eerder beschreven door Brogden et al. 23.
  3. Hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) om de hoeveelheid cholesterol kwantificeren
    1. Bevestig een 100 x 4,6 mm kolom tot 5 um / 4,6 mm guard cartridge en verwarm tot 32 ° C. Met methanol als de mobiele fase bij een stroomsnelheid van 1 ml / min bij 65 bar en een UV-detector bij 202 nm meet de hoeveelheid cholesterol in elk monster te kwantificeren.
    2. Was de HPLC machine grondig vóór analyse van de monsters, de volgende stappen: het reinigen van de pomp, het wassen van de naald, het spoelen van de pot, spoelen de spuit, en wassen van de pomp spoeling. Was alle met water. Tenslotte voeren een systeem spoelen met methanol bij een debiet van 5 ml / min gedurende 5 min.
    3. Een cholesterol standaardkromme vast, bereiden ten minste 4 concentraties0,05 mg / ml tot 2 mg / ml cholesterol in chloroform / methanol (1: 1) 24.
    4. Resuspendeer de verkregen uit stap 2.1.10 in 500 pl chloroform / methanol monsters (1: 1) in amberkleurige 1,5 ml glazen flesjes met schroefdop rode PTFE / wit silicone deksels.
    5. Kwantificeren cholesterol door gebruikmaking van de standaard bereid in stap 2.3.3.
      OPMERKING: Vul het bemonsteringsprotocol, uitgaande van ten minste één standaard en één negatieve controle, gevolgd door de monsters.
    6. De resultaten worden uitgedrukt als het oppervlak onder de curve en vergelijken tussen de nodige monsters met behulp van een statistische software.
      Opmerking: De resultaten kunnen ook worden gekwantificeerd tegen een standaardcurve en kan worden weergegeven als de totale hoeveelheid cholesterol per ml, g of aantal cellen. De standaardkromme vergelijking worden berekend met de waarden verkregen bij stap 2.3.3.

3. visualisatie en kwantificering van NET

  1. Visualization van NET
    LET OP: De visualisatie van de netten is gebaseerd op eerder gepubliceerd werk van Neumann et al. 15.
    1. Was de vaste monsters uit stap 1.3.8 3 maal met 200 pi 1X PBS.
    2. Blok en permeabilize met 100 pl 2% BSA, 0,2% Triton X-100 in PBS per putje gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Voeg 100 ul van primaire antilichamen: monoklonaal anti-DNA-histone 1-antilichaam (verdund de bouillon met 2,2 mg / ml 1: 5000 in PBS met 2% BSA en 0,2% Triton X-100) of polyklonaal antilichaam tegen myeloperoxidase (MPO; konijn anti-MPO, verdund 1: 300 in PBS met 2% BSA en 0,2% Triton X-100). Incubeer overnacht bij 4 ° C.
    4. Was 3 maal met 200 pi 1X PBS.
    5. Voeg 100 ul van het secundaire antilichaam (fluorescentie-gemerkt geit-anti-muis, 1: 1000 in BSA-PBS-Triton X-100 en geit anti-konijn, 1: 1000 BSA-PBS-Triton X-100) gedurende 1 uur bij RT in het donker.
    6. Was 3 maal met 200 & #181, l 1 x PBS.
    7. Dekglaasjes verwijderd met een pincet en leg ze neer met 3 ul van montage medium met DAPI op glasplaatjes.
    8. Onderzoek de monsters met behulp van een confocale omgekeerde base fluorescentiemicroscoop uitgerust met een HCX PL APO 40X 0,75-1,25 olie immersie objectief 15.
  2. Kwantificering van de-NET vrijgeven kernen
    1. Open een image processing software (bijvoorbeeld ImageJ) en sleep foto van belang in de werkbalk.
    2. Klik op "Plugins", "analyseren" en "Cell teller."
    3. Druk op de knop "Initialize" in de teller venster en kies een teller type (bijvoorbeeld, klik op 7 in rood voor-NET het vrijgeven van cellen en 8 in het geel voor niet-vrijgeven van cellen, zoals weergegeven in figuur 6B-i en ii).
      LET OP: De criteria voor NET-positieve cellen: positief kleurden groen kern + een minder dicht nucleus (verlies van lobvorming) of een verlies van de ronde vorm van de kern + een toegenomen omvang van de kern of het optreden van een afzonderlijke extracellulair uitloper.
    4. Klik op elke cel vast te houden aan de bovengenoemde criteria en schrijf het getelde aantal cellen in een data sheet van een analyse software.
    5. Bereken het percentage-NET het vrijgeven van cellen met behulp van het getelde aantal cellen van NET-vrijgeven en niet-vrijgeven van cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Humaan bloed afgeleide neutrofielen werden geïsoleerd door dichtheidsgradiënt centrifugatie (figuur 2). Om het effect van Lipidenveranderingen op neutrofielen te onderzoeken, werden de cellen behandeld met 10 mM MβCD die cholesterol put uit de cel. Vervolgens werden de lipiden geïsoleerd uit monsters van Bligh en Dyer (figuur 1, linker paneel), zoals beschreven door Brogden et al. 23. De bereide lipide monsters werden op ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier beschreven werkwijzen kunnen worden gebruikt om specifieke lipiden, zoals cholesterol, door HPTLC of HPLC analyseren en de effecten van farmacologische Lipidenveranderingen op de vorming van NET onderzoeken (zie Neumann et al. 15).

HPTLC is een relatief kosteneffectief en eenvoudige methode om een ​​groot aantal lipiden analyseren van een groot aantal monsters. Deze werkwijze is gebruikt in vele onderzoeksgebieden, waaronder antibiotica kwantificering...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een beurs van de Akademie für Tiergesundheit (HvH) en een beurs van het promotietraject, "Animal and zoönotische infecties," van de Universiteit van Diergeneeskunde, Hannover, Duitsland, verstrekt aan Ariane Neumann.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Neutrophil isolation, NET staining and quantification
Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgGInvitrogenA-21070
Anti-MPOα antibodyDakoA0398
BSASigma-Aldrich3912-100G
Marienfeld-Neubauer improved counting chamberCeleromicsMF-0640010
Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scannerLeicaDMI6000CS
Dulbecco´s PBS 10xSigma-AldrichP5493-1LDilute 1:10 in water for 1x working solution
Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbedThermo Fisher Scientific35503
ExcelMicrosoft2010
DNA/Histone 1 antibodyMilliporeMAB3864
ImageJNIH1.8http://imagej.nih.gov/ij/
Light microscopeVWR630-1554
Methyl-β-cyclodextrinSigma-AldrichC4555-1G
PFACarl Roth0335.3dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1 N NaOH to clear solution
PMASigma-AldrichP8139-1MGStock 16 µM, dissolved in 1x PBS
Poly-L-lysineSigma-AldrichP4707
PolymorphprepAXIS-SHIELDAN1114683
ProLong Gold antifade reagent with DAPIInvitrogenP7481
Quant-iT PicoGreen dsDNA ReagentInvitrogenP7581
RPMI1640PAAE 15-848
HBSS with CaCl and MgSigmaH6648
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50ml
TrypanblueInvitrogen15250-0610.4% solution
WaterCarl Roth3255.1endotoxin-free
NameCompanyCatalog Number Comments
Lipid isolation and analysis
1-propanolSigma-Aldrich33538
10 µL syringeHamilton701 NR 10 µl
Diethyl etherSigma-Aldrich346136
Ethyl acetateCarl Roth7336.2
Canullla 26 GBraun4657683
Copper(II)sulphatepentahydrateMerck1027805000
ChloroformCarl Roth7331.1
CP ATLAS softwareLazarsoftware2.0
Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm columnMerck152022
High Performance Liquid Chromatograph ChromasterHitachiHITA 892-0080-30YParamaters are dependent on individual HPLC machine
HPLC UV DetectorHitachi5410
HPLC Column OvenHitachi5310
HPLC Auto SamplerHitachi5260
HPLC PumpHitachi5160
MethanolCarl Roth7342.1
n-HexaneCarl Roth7339.1
Phosphoric acidSigma-Aldrich30417
Potassium chlorideMerck49,361,000
PottersLAT Garbsen5 ml
SDSCarl RothCN30.3
HPTLC silica gel 60Merck105553
Vacufuge plus basic deviceEppendorf22820001
Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottomSigmaCLS3548
CoverslipThermo Fisher Scientific1198882
Glass slideCarl Roth1879
BD Tuberculin Syringe Only 1 mLBD Bioscience309659

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
  2. Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962(2015).
  3. Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
  4. Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright,, J,, Abraham, S. N. The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
  5. Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
  6. Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
  7. Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
  8. Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
  9. Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. Dermatology 2-Volume Set. , St. Louis: Mosby. (2007).
  10. Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), Baltimore, Md. 8262-8271 (2008).
  11. Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
  12. Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107(2013).
  13. Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
  14. Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
  15. Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
  16. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  17. von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
  18. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
  19. Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
  20. Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
  21. Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
  22. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
  23. Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
  24. Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
  25. Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
  26. Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
  27. Correia, M., et al. Helicobacter pylori's cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
  28. Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
  29. Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity - A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
  30. Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
  31. Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
  32. Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
  33. Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
  34. Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
  35. Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses? Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
  36. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
  37. Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
  38. Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
  39. Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
  40. McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

LipidanalyseHPTLC methodeHPLC analysecholesterolmetingisolatie van neutrofielenNET vormingbloedafgeleide neutrofielendunlaagschromatografie

Gerelateerde artikelen