Studies van neuronale morfogenese met behulp van Drosophila larvale dendritische arborization (bis) neuronen profiteren van in situ visualisatie van neuronale en epidermale eiwitten door immunofluorescentie. We beschrijven een werkwijze die immunofluorescentie analyse van da neuronen en omliggende epidermale cellen verbetert door het verwijderen spierweefsel van de larvale lichaamswand.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Drosophila larvale dendritische arborization (bis) neuronen zijn een populair model voor het onderzoek naar de mechanismen van neuronale morfogenese. Da neuronen ontwikkelen in verbinding met de epidermale cellen ze innerveren en dus hun analyse geniet in situ visualisatie van zowel neuronaal en epidermaal expressie gebrachte proteïnen door immunofluorescentie. Traditionele werkwijzen voor het bereiden larvale filets immunofluorescentie experimenten intact spierweefsel dat de meeste lichaamswand bedekt, presenteert verscheidene uitdagingen voor neuronale en epidermale eiwitten beeldvorming. Hier beschrijven we een werkwijze voor het verwijderen spierweefsel van Drosophila larven filets. Dit protocol maakt beeldvorming van eiwitten die anderszins verduisterd door spierweefsel, verbetert de signaal-ruisverhouding, en vergemakkelijkt het gebruik van superresolutietechnieken da neuron ontwikkeling bestuderen.
Inleiding
Drosophila larven dendritische arborization (bis) neuronen een waardevol model voor het bestuderen van neuronale ontwikkeling door hun ontvankelijkheid voor genetische manipulatie en het gemak waarmee ze kunnen worden afgebeeld. Deze sensorische neuronen zijn instrumenteel in de identificatie van een groot aantal trajecten die dendriet morfogenese 1-3 controle geweest.
Vier klassen van da neuronen (klasse I - IV) innerveren het larvale epidermis. Deze neuronen liggen tussen het basale membraan en de epidermis, met hun dendrieten vormen voornamelijk tweedimensionale arrays 4,5. Van de vier klassen, klasse IV ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: De procedure voor spier verwijderen (figuur 1) is een modificatie van eerder beschreven werkwijzen ter bereiding larvale filets. De stappen die voorafgaan aan en volg spier verwijdering worden beschreven kort op en de lezer wordt verwezen naar eerdere werk 10, 11 voor meer gedetailleerde beschrijvingen.
1. Dissect Larva in Cold Saline
- Bereid een werkende verdunning van koude HL3.1 zoutoplossing 15 of koude Ca 2 + -vrij HL3.1 zoutoplossing 11 (tabel 1). Plaats de larve in een siliconenelastomeer schaal met net genoeg koude zoutoplossing om d....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We tonen de bruikbaarheid van de spier verwijderingsprocedure voor het verbeteren signaalruisverhouding in immunofluorescentie experimenten samen te visualiseren septum junction eiwitten Coracle (Cora) en schijven-groot (Dlg) samen met klasse IV da neuronen gelabeld met het membraan marker CD4 tdTomato.
Cora is eerder gebruikt om opdrachten waarvoor da neuron dendrieten worden ingesloten door epidermale cellen en is één van de geïdentificeerde epidermale fact.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier wordt een protocol beschreven voor het handmatig verwijderen van spierweefsel van Drosophila larvale filets. Dit protocol modificeert eerder beschreven larvale dissectie technieken 10,11. Nadat de larve wordt ontleed in een siliconenelastomeer schaal wordt de dorsale middellijn bevindt. Een enkele tang tand in zijn vlakste mogelijke oriëntatie, wordt zorgvuldig ingevoegd tussen het spierweefsel en de opperhuid, in de buurt van de dorsale middellijn. De tang worden voorzichtig getrokken naar bove.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken Gary Laevsky voor nuttige discussies over microscopie. Dit werk werd gefinancierd door de NIH subsidies R01GM061107 en R01GM067758 te ERG
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 pincet | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Schaar, 8 cm, recht, 5 mm bladen, 0,1 mm punten | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 siliconen elastomeer set | Dow Corning | 3097358-1004 | voor dissecplatjes |
| Austerlitz insectenspelden, 0,1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 lichtbron | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade montagemiddel | Vector Laboratories | H-1000 | voor confocale microscopie |
| Prolong Diamond antifade montagemiddel | Life Technologies | P36970 | voor gestructureerde verlichtingsmicroscopie |
| Micro dekglaasje, 22 x 22 mm, Nr. 1,5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscoopglaasjes, 25 x 75 x 1,0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Muis anti-Coracle antilichaam | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, verdun 1:50 |
| Muis anti-Discs large antilichaam | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, verdun 1:50 |
| Konijn anti-dsRed antilichaam | Clontech | 632496 | verdun 1:1.000 |
| Geit anti-konijn antilichaam, Alexa Fluor 568 geconjugeerd | ThermoFisher Scientific | A-11011 | verdun 1:1.000 |
| Geit anti-muis antilichaam, Alexa Fluor 488 geconjugeerd | ThermoFisher Scientific | A-11001 | verdun 1:500 |
Referenties
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
