Studies van neuronale morfogenese met behulp van Drosophila larvale dendritische arborization (bis) neuronen profiteren van in situ visualisatie van neuronale en epidermale eiwitten door immunofluorescentie. We beschrijven een werkwijze die immunofluorescentie analyse van da neuronen en omliggende epidermale cellen verbetert door het verwijderen spierweefsel van de larvale lichaamswand.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Drosophila larvale dendritische arborization (bis) neuronen zijn een populair model voor het onderzoek naar de mechanismen van neuronale morfogenese. Da neuronen ontwikkelen in verbinding met de epidermale cellen ze innerveren en dus hun analyse geniet in situ visualisatie van zowel neuronaal en epidermaal expressie gebrachte proteïnen door immunofluorescentie. Traditionele werkwijzen voor het bereiden larvale filets immunofluorescentie experimenten intact spierweefsel dat de meeste lichaamswand bedekt, presenteert verscheidene uitdagingen voor neuronale en epidermale eiwitten beeldvorming. Hier beschrijven we een werkwijze voor het verwijderen spierweefsel van Drosophila larven filets. Dit protocol maakt beeldvorming van eiwitten die anderszins verduisterd door spierweefsel, verbetert de signaal-ruisverhouding, en vergemakkelijkt het gebruik van superresolutietechnieken da neuron ontwikkeling bestuderen.
Inleiding
Drosophila larven dendritische arborization (bis) neuronen een waardevol model voor het bestuderen van neuronale ontwikkeling door hun ontvankelijkheid voor genetische manipulatie en het gemak waarmee ze kunnen worden afgebeeld. Deze sensorische neuronen zijn instrumenteel in de identificatie van een groot aantal trajecten die dendriet morfogenese 1-3 controle geweest.
Vier klassen van da neuronen (klasse I - IV) innerveren het larvale epidermis. Deze neuronen liggen tussen het basale membraan en de epidermis, met hun dendrieten vormen voornamelijk tweedimensionale arrays 4,5. Van de vier klassen, klasse IV da neuronen hebben de meest sterk vertakte priëlen en, net als sensorische neuronen van andere dieren, de uitwerking van deze cilinders vereist intrinsieke factoren evenals signalen uit het naburige weefsels, met name de epidermis, voor hun ontwikkeling 6-9 .
Studies om te bepalen hoe dergelijke neuronale en extra-neuronale feitors controle dendriet morfogenese profiteren van de mogelijkheid om eiwitexpressie te detecteren in situ door immunofluorescentie. De buitenste cuticula van de larve is ondoordringbaar voor antilichamen, maar deze belemmering wordt gemakkelijk overwonnen door het opstellen van larvale filets door middel van goed gevestigde dissectie methoden 10,11. Echter, het lichaam muur spieren die net interieur ligt aan het basaal membraan presenteert een aantal uitdagingen voor visualisatie van da neuronen en epidermale cellen. Ten eerste, het spierweefsel, welke lijnen meeste lichaamswand, verduistert sterk fluorescente signalen van neuronaal of epidermaal weefsel. Dit vermindert aanzienlijk de signaal-ruisverhouding in het monster. Ten tweede kan veel relevante eiwitten tot expressie worden gebracht in het spierweefsel en in de neuronen of epidermis. Deze spier afgeleide fluorescentiesignaal waarschijnlijk verder obscure detectie van een fluorescentiesignaal van het neuron of epidermis. Tot slot, de vooruitgang in de microscopie technologieën geenw vergunning beeldvorming van monsters bij sub-diffractie resolutie en kan in het bijzonder nuttig zijn bij het onderscheiden van de lokalisatie van eiwitten die worden uitgedrukt in neuronen en omliggende opperhuidcellen 12,13 zijn. Echter, imaging via super-resolutie microscopie profiteert van een sterk signaal-ruisverhouding en de nabijheid van het monster op het dekglaasje. Naast het verminderen van de signaal-ruisverhouding, de larvale lichaamswand spier afstanden da neuronen van het dekglaasje, waardoor de verbeterde beeldresolutie die kan worden bereikt met superresolutietechnieken werkwijzen beperken. Naast de uitdagingen voor immunofluorescentie analyse, spierweefsel presenteert een belemmering voor elektrofysiologische opname van sensorische neuronen in het larvale lichaam muur. De verwijdering ervan profiteert daarom neurofysiologische manipulatie van sensorische neuronen 14.
Hier een werkwijze voor handmatig verwijderen van Drosophila larven spierweefsel wordt beschreven. We tonen aan dat ons protocol permits immunofluorescentie beeldvorming van eiwitten die anderszins verduisterd door spierweefsel, verbetert de signaal-ruisverhouding voor visualisatie van klasse IV da neuronen, en maakt het gebruik van superresolutietechnieken beter onderscheid ruimtelijke relaties van eiwitten en cellulaire structuren da neuronen en de epidermis.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: De procedure voor spier verwijderen (figuur 1) is een modificatie van eerder beschreven werkwijzen ter bereiding larvale filets. De stappen die voorafgaan aan en volg spier verwijdering worden beschreven kort op en de lezer wordt verwezen naar eerdere werk 10, 11 voor meer gedetailleerde beschrijvingen.
1. Dissect Larva in Cold Saline
- Bereid een werkende verdunning van koude HL3.1 zoutoplossing 15 of koude Ca 2 + -vrij HL3.1 zoutoplossing 11 (tabel 1). Plaats de larve in een siliconenelastomeer schaal met net genoeg koude zoutoplossing om de bodem van de schaal te dekken.
OPMERKING: Zie discussie over de keuze van een zoutoplossing.
| 1x HL3.1 zoutoplossing (pH 7,2) |
| 5 mM HEPES |
| 70 mM NaCl |
| 5 mM KCl |
| 1,5 mM CaCl2 (weglaten voor Ca 2 + -vrij zoutoplossing) |
| 4 mM MgCl2 |
| 10 mM NaHCO3 |
| 5 mM trehalose |
| 115 mM sucrose |
| Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C |
| Opmerking: De samenstelling bootst insect hemolymfe |
Tabel 1. Samenstelling van Cold Saline.
- Plaats de larve met de ventrale zijde naar boven. Het ventrale oppervlak van de larve kan worden geïdentificeerd door de buik- dentical riemen en de dorsale zijde van de primaire larvale tracheale buizen loopt van anterior naar posterior. Strek de larve in de anterior-posterior richting en speld de kop en staart naar eensiliconenelastomeer ontleden schaal met behulp insect pinnen. Met fijne ontleden schaar langs de ventrale middellijn te snijden, vanaf één uiteinde en verloopt naar het andere.
LET OP: Deze oriëntatie behoudt de gewoonlijk bestudeerde dorsale cluster van da neuronen. - Nadat de larve wordt opengesneden, speld de vier hoeken van het ontleden schotel alsof het openen van een boek. Gebruik een tang om de interne organen, inclusief het centrale zenuwstelsel, darmen, en de luchtpijp te pakken en te verwijderen. Pas insect pinnen, zodat de filet is strak, maar niet maximaal uitgerekt.
OPMERKING: Spieren worden verankerd aan de lichaamswand in segmentale grenzen. Hoewel spieren het grootste deel van de lichaamswand, ze afwezig zijn in een smal gebied bij de dorsale middellijn.
2. Muscle Removal
- Zoek de dorsale middellijn van de larve, waarbij spierweefsel is afwezig. Plaats één tand forceps zodat deze onder het spierweefsel in de vlakste mogelijke oriëntatie kan worden geplaatst.
- Vanafde dorsale middellijn, in de buurt van de voorste begrenzing van het segment, schuif de tang tand tussen de spier en de epidermis, zorg ervoor dat het contact tussen de tang en de opperhuid te minimaliseren.
- Trek de tang omhoog naar de verbinding van de spier de lichaamswand breken op een ankerpunt. Herhaal dit proces voor de resterende hemi-segment (s) van belang.
NB: Dit protocol optimaliseert het behoud van de achterkant van elke da neuron dendriet veld. Het voorste deel van het dendriet gebied behouden, is het het beste om de tang tand invoegen aan het achterste uiteinde van elk segment. - Opnieuw aan te passen insect pinnen, zodat de larvale filet maximaal wordt uitgerekt in alle richtingen.
- Bevestig de filet, terwijl het nog steeds aan de ontleden schotel is vastgezet met koud, vers bereide 4% formaldehyde in PBS gedurende 25 min.
- Spoel 5 keer in PBS.
- Gebruik een tang om voorzichtig weg te trekken spierweefsel van de overige ankerpunten, zorg ervoor dat Conta minimaliserenct met de opperhuid.
- Losmaken en verwijder de filet uit het ontleden schotel naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voer alle daaropvolgend wassen, blokkering en immunofluorescentie kleuring stappen, zoals eerder beschreven 11.
3. Monteer de Larvale Fillet
- Verwijder eerst de kop en de staart met behulp van fijne ontleden schaar om het monster zo plat mogelijk te maken. Monteer de filet op een dekglaasje in antifade inbedmiddel met de binnenkant van de haas met uitzicht op het dekglaasje.
- Plaats een microscoop dia op het dekglaasje en druk zachtjes aan de montage medium te verspreiden. Flip de microscoop glijden over en sluit de dekglaasje op de dia met behulp van nagellak. Dia's kunnen gedurende ten minste één maand worden bewaard bij -20 ° C.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We tonen de bruikbaarheid van de spier verwijderingsprocedure voor het verbeteren signaalruisverhouding in immunofluorescentie experimenten samen te visualiseren septum junction eiwitten Coracle (Cora) en schijven-groot (Dlg) samen met klasse IV da neuronen gelabeld met het membraan marker CD4 tdTomato.
Cora is eerder gebruikt om opdrachten waarvoor da neuron dendrieten worden ingesloten door epidermale cellen en is één van de geïdentificeerde epidermale fact...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier wordt een protocol beschreven voor het handmatig verwijderen van spierweefsel van Drosophila larvale filets. Dit protocol modificeert eerder beschreven larvale dissectie technieken 10,11. Nadat de larve wordt ontleed in een siliconenelastomeer schaal wordt de dorsale middellijn bevindt. Een enkele tang tand in zijn vlakste mogelijke oriëntatie, wordt zorgvuldig ingevoegd tussen het spierweefsel en de opperhuid, in de buurt van de dorsale middellijn. De tang worden voorzichtig getrokken naar bove...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken Gary Laevsky voor nuttige discussies over microscopie. Dit werk werd gefinancierd door de NIH subsidies R01GM061107 en R01GM067758 te ERG
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 pincet | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Schaar, 8 cm, recht, 5 mm bladen, 0,1 mm punten | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 siliconen elastomeer set | Dow Corning | 3097358-1004 | voor dissecplatjes |
| Austerlitz insectenspelden, 0,1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 lichtbron | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade montagemiddel | Vector Laboratories | H-1000 | voor confocale microscopie |
| Prolong Diamond antifade montagemiddel | Life Technologies | P36970 | voor gestructureerde verlichtingsmicroscopie |
| Micro dekglaasje, 22 x 22 mm, Nr. 1,5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscoopglaasjes, 25 x 75 x 1,0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Muis anti-Coracle antilichaam | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, verdun 1:50 |
| Muis anti-Discs large antilichaam | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, verdun 1:50 |
| Konijn anti-dsRed antilichaam | Clontech | 632496 | verdun 1:1.000 |
| Geit anti-konijn antilichaam, Alexa Fluor 568 geconjugeerd | ThermoFisher Scientific | A-11011 | verdun 1:1.000 |
| Geit anti-muis antilichaam, Alexa Fluor 488 geconjugeerd | ThermoFisher Scientific | A-11001 | verdun 1:500 |
Referenties
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth. Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).
- Meltzer, S., et al. Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons. Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. (57), e3111(2011).
- Gustafsson, J. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data. Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).
- Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae. PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
