Methodenartikel

Parallel Meting van de circadiane klok genexpressie en hormoon in Human primaire celculturen

DOI:

10.3791/54673

⸱

11 november 2016

 ,  ,  , 
1Department of Medical Specialties, Division of Endocrinology, Diabetes, Hypertension and Nutrition, Diabetes Center, University of Geneva Medical School, Institute of Genetics and Genomics in Geneva (iGE3), 2Population Epidemiology Unit (UEP), Community Medicine, Geneva University Hospital

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we instellingen om parallel de circadiane bioluminescentie en de secretoire activiteit van humane eilandcellen en primaire myotubes te monitoren. Hiervoor gebruikten we lentivirale genoverdracht van een luciferase kernklok reporter, gevolgd door in vitro synchronisatie en het verzamelen van uitstroommedium door continue celperfusie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Circadiane klokken zijn functioneel in alle lichtgevoelige organismen, waardoor een aanpassing aan de buitenwereld door te anticiperen op de dagelijkse veranderingen in het milieu. Aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van de nauwe verbinding tussen de circadiane klok en de meeste aspecten van de fysiologie is geboekt op het gebied van de afgelopen tien jaar. Echter, het ontrafelen van de moleculaire basis dat de functie van de circadiane oscillator mens grondslag blijft de hoogste technische uitdaging. Hier bieden we een gedetailleerde beschrijving van een experimentele benadering voor de lange termijn (2-5 dagen) bioluminescentie opname en uitstroom medium collectie in gekweekte menselijke primaire cellen. Hiervoor hebben we primaire cellen getransduceerd met een lentivirale luciferase reporter die onder besturing van een centrale klok genpromotor, waardoor de parallelle beoordeling hormoonsecretie en circadiane bioluminescentie. Verder beschrijven we de voorwaarden voor het verstoren van de circadiane klok in primary menselijke cellen door transfectie siRNA gericht KLOK. Onze resultaten op circadiane regulatie van de insuline secretie door menselijke pancreatische eilandjes en Myokine secretie door humane skeletspiercellen, worden hier gepresenteerd aan de toepassing van deze methode te illustreren. Deze instellingen kunnen worden gebruikt om de moleculaire samenstelling van menselijke perifere klokken bestuderen en de functionele gevolgen primaire cellen onder fysiologische of pathofysiologische condities analyseren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het circadiane systeem (van het Latijnse "Circa diem") is ontstaan in alle lichtgevoelige organismen, als een adaptief mechanisme om de rotatie van de Aarde. Bij zoogdieren wordt georganiseerd in een hiërarchische wijze, omvat de centrale klok, meer bepaald in de suprachiasmatische nucleus van de ventrale hypothalamus en perifere (of slave) oscillatoren die werkzaam in verschillende organen. Bovendien zijn deze cellen autonome zichzelf onderhoudende oscillatoren zijn functioneel in vrijwel elke cel van het lichaam 1. Fotische signalen vormen een dominante synchronisatie cue (Zeitgeber) voor de SCN neuronen, terwijl neurale en humorale signalen afkomstig van de SCN reset de perifere klokken. Daarnaast slaap-waak ritme, dat rijdt op zijn beurt voeden-vasten cycli, zijn verdere synchronizers voor perifere klokken 2. Volgens onze huidige kennis, wordt de moleculaire samenstelling van de kern klok op basis van transcriptie en translanele feedback loops, die zijn geconserveerd tussen organismen. Dit bestaat uit de transcriptie activatoren BMAL1 en klok, die samen de transcriptie van de negatieve core clock PER en CRY genen te activeren. Hoge niveaus van PER en CRY eiwitten zullen hun eigen transcriptie remmen door remming van de BMAL1 / KLOK complex. Een extra lus bestaat uit de nucleaire receptoren REV-Erbs en Rors, die ook de transcriptie van BMAL1 en KLOK reguleren. Bovendien posttranslationele evenementen, waaronder fosforylering, sumoylation, acetylering, O-GlcNAcylation, afbraak- en nucleaire binnenkomst van de core clock eiwitten vertegenwoordigen een bijkomende belangrijke regulerende laag bij het vaststellen van de 24 uurs oscillatie cyclus 3.

Accumuleren bewijsmateriaal komt voort uit studies in diermodellen en wijst op de cruciale rol van het circadiaan systeem in de coördinatie van de metabole en endocriene functies 4-5. Een aantal van de large-schaal transcriptoom analyse blijkt dat het voeden - vasten cycli een centrale rol in de synchronisatie van perifere oscillatoren 6-8 te spelen. In een overeenkomst met deze studies, metaboloom en lipidomic analyse bij knaagdieren en mensen hebben aangetoond dat een groot aantal metabolieten oscilleren in het weefsel, plasma en speeksel in een circadiane manier 9-11. Belangrijk is dat de meeste hormonen vertonen circadiane ritmes in het bloed 5,12-13. Bovendien zou circadiane klok van de overeenkomstige hormoon producerende perifere weefsels hormoon lokaal te regelen. Cel-autonome circadiane oscillatoren zijn beschreven in knaagdieren en menselijke pancreatische eilandcellen: 14-16. Deze oscillatoren spelen een essentiële rol in het reguleren van de eilandjes van Langerhans transcriptoom en functie 15,17-18. Bovendien Myokine secretie door menselijke skelet myotubes is onlangs aangetoond dat een circadiaan patroon, dat wordt gereguleerd door de cel-autonome oscillato vertonenrs werkzaam in 19 deze cellen.

Verschillende benaderingen voor het bestuderen van circadiane ritmes bij mensen in vivo zijn op grote schaal gebruikt. Zo hebben plasma melatonine of cortisol en thoracale huid oppervlaktetemperatuur (besproken in referenties 3,20) onderzocht endogene circadiane klok beoordelen. Hoewel deze methoden is het mogelijk het bestuderen systemische circadiane oscillaties in vivo, zijn ze verre van een betrouwbare beoordeling van de free-running autonome circadiane ritmes in verschillende organen en weefsels. Niettemin zouden dergelijke dissectie van de systemische regeling een onmisbaar hulpmiddel om het specifieke effect van intracellulaire moleculaire klok op de functie van deze cellen. Daarom heeft aanzienlijke inspanningen ondernomen om betrouwbare methoden voor het bestuderen van humane klokken in geïmmortaliseerde primaire of gekweekte cellen gesynchroniseerd in vitro te ontwikkelen. Belangrijker is aangetoond datklok kenmerken gemeten in gekweekte primaire huid fibroblast cellen sluiten nauw aan bij de individuele klok eigenschappen van het hele organisme 21. De ontwikkeling van fluorescente en bioluminescente circadiane verslaggevers is sterk gevorderd deze benadering 22-27. Verder bestuderen primaire cel klokken die zijn afgeleid van andere perifere organen maakt het onderzoek naar de moleculaire eigenschappen van menselijk weefsel-specifieke klokken 3,5,16,19-20,28. Zo, de beoordeling van de circadiane klok in in vitro gesynchroniseerd primaire explantaten of cellen, met behulp van bioluminescente verslaggevers, vertegenwoordigt een zeer bruikbare methode om de moleculaire samenstelling van humane perifere klokken en hun impact op orgaanfunctie te bestuderen.

In dit artikel zullen we gedetailleerde protocollen te presenteren voor de beoordeling van circadiane genexpressie in humane primaire eilandje en skeletspier cellen gesynchroniseerd in vitro, evenals de impact van de autonome cellulaire klokverstoring van de secretoire functie van deze cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethiek statement: manipulaties opgenomen in dit protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Geneva University Hospital en door de Ethische Commissie SUD EST IV (Overeenkomst 12/111) 19. Human eilandjes werden geïsoleerd uit pancreas van hersendode multi-orgaandonoren in de Islet Transplantation Centrum in het Universitair Ziekenhuis van Genève (Zwitserland), zoals beschreven door ons in referenties 16,18, of verkregen van een commerciële bron.

1. Voorbereiding van de primaire cel Cultuur

  1. Human eilandjes van Langerhans Isolatie, dissociatie en Cultuur
    OPMERKING: Coat elke buis, plastic tip of pipet met Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) medium om eilandjes of eilandcellen te plakken aan het kunststof oppervlak, wat kan leiden tot een aanzienlijk verlies van celmateriaal.
    1. Eén dag voor eilandje celdissociatie voeg 1 ml van laminine-5-rijke extracellulaire matrix (afgeleid van 804G cellen described in verwijzing 29) per 3,5 cm schotel. Voordat plating cellen, zuigen de matrix en was de schotel 3 keer met steriele bi-gedestilleerd water. Laat de schaal drogen onder de laminaire stroming kast voor 5 min.
    2. In de laminaire stroming kast, distribueren verkregen eilandjes met CMRL medium in 15 ml buisje (s). Centrifugeer bij 272 xg gedurende 5 minuten.
    3. Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml van steriele Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) voorverwarmd tot 37 ° C zonder calcium en magnesium. Centrifugeer bij 272 xg gedurende 5 minuten.
    4. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 1 ml van DPBS.
    5. Het totale aantal eilandjes Pipetteer 10 ul van de 1 ml suspensie eilandje is gecombineerd met een nieuwe 3,5 cm schaaltje. Tel het aantal eilandjes in de 10 ul druppel onder de microscoop en naar het bereken het totale aantal eilandjes in de 1 ml suspensie eilandje. Voeg 14 ml DPBS en centrifugeer de celsuspensie ééntijd bij 272 xg gedurende 5 minuten.
    6. Voor eilandje cel dissociatie, zuig het supernatant en voeg 1 ml van de mobiele onthechting oplossing voor een maximum van 1.000 eilandjes equivalenten (IEQ). Plaats de buis in een waterbad bij 37 ° C en voorzichtig de eilandjes meng door en neer te pipetteren meerdere keren per minuut, gedurende 6-10 min.
      OPMERKING: Om de spijsvertering kwaliteit te controleren, pipet een 2 pl druppel schorsing op een glasplaatje en controleren onder de microscoop dat alle cellen goed gescheiden zijn, en dat er geen doubletten of cel klonten zijn gebleven.
    7. Stop de reactie door toevoeging van 14 ml koud CMRL met supplementen (10% foetaal runderserum (FBS), 1% L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 1% penicilline-streptomycine (P / S), 1% gentamycine, 1 % natriumpyruvaat). Centrifugeer bij 425 xg gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant en voeg 15 ml CMRL medium aan de cel pellet.
    8. Resuspendeer de pellet in een klein volume CMRL met supplementen. Tel het aantal cellen onder de microscoop met een hemocytometer, pas het volume CMRL teneinde een celconcentratie van ~ 650, 000 cellen / ml te verkrijgen.
    9. Pipet 3 gescheiden druppels 100 pl elk van de gedispergeerde celsuspensie verkregen in stap 1.1.8 in een 3,5 cm schaaltje vooraf gecoat met laminine.
      OPMERKING: Cellen hechten aan de schotel in ongeveer 24 uur.
    10. Incubeer cellen (Figuur 1A) in een weefselkweek incubator bij 37 ° C in een vochtige kamer. Verander het medium van de cellen daalt om de 2-3 dagen door opzuigen 100 gl uit elke druppel en vervangen door hetzelfde volume vers medium.
  2. Humane primaire myoblasten Cultuur en differentiatie in myotubes
    1. Weefsel biopsie, satelliet cel isolatie en myoblast cultuur
      Opmerking: Muscle biopten werden verkregen uit de groep van Etienne Lefai (INSERM, Lyon, Frankrijk) 19.
      1. Zuiver primaire skeletmyoblasten volgens de eerder beschreven procedure 30.
    2. Differentiatie primary menselijke myoblasten in myotubes
      1. Neem een flacon (1 x 10 6 cellen) van menselijke myoblasten opgeslagen in vloeibare stikstof en ontdooien snel cellen door de invoering van de flacon 30 sec tot 1 min in een waterbad bij 37 ° C onder roeren.
      2. Pipet cellen (1 ml) in 24 ml groeimedium samengesteld HAM F-10 gesupplementeerd met 20% FBS, 1% P / S, 0,5% gentamycine en 0,2% amfotericine B.
      3. Centrifugeer 5 minuten bij 150 x g.
      4. Verwijder het supernatant en resuspendeer cellen met 15 ml vers groeimedium per 2,5 x 10 5 cellen.
      5. Plate ten minste 2,5 x 10 5 cellen per F75 hechtende kolf. Houd de myoblasten in een cel incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
      6. Zodra cellen 60-80% confluentie bereikt, dissociëren cellen met trypsine-EDTA 0,05% gedurende 1-2 min en plaat ze in 2 ml groeimedium op adherent 3,5 cm petrischalen.
      7. Na het bereiken van samenvloeiing, verwijder het groeimedium.
      8. Start de differentiatie protocol menselijke myoblasten in myotubes door ze te kweken in 2 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) dat 1 g / l glucose, 2% FBS, 1% P / S, 0,5% gentamycine en 0,2% amfotericine B (differentiatiemedium) in een cel incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Verander het medium elke 2 tot 3 dagen.
        OPMERKING: myotubes worden gewoonlijk gevormd binnen 7-10 dagen.
      9. Raadpleeg spiercel differentiatie onder de microscoop (Figuur 2A) en houdt de fusie van myoblasten in polynucleated myotubes 19.

2. kleine interfererende RNA (siRNA) Transfectie

  1. siRNA Transfectie van Human Islet Cells
    LET OP: De transfectie-protocol wordt uitgevoerd in dalingen van 100 ui op de volgende dag na cel dissociatie (stappen 1.1.1-1.1.10).
    1. Aspireren 100 ul CMRL medium uit elke druppel en te vervangen door hetzelfde volume van serumvrij Minimal Essential Medium (MEM) 2 uurvoor transfectie door pipetteren.
    2. Bereid een MEM-gebaseerde mix van transfectiereagens en 50 nM van doel siRNA (siClock) of 50 nM niet-targeting siControl volgens de instructies van de fabrikant.
      1. Voor een schaal met 3 druppels bereiden twee 1,5 ml buizen met 200 ui MEM elk.
      2. Naar een van deze buizen 4 pl transfectiereagens.
      3. Voeg toe aan de tweede buis 1 pl van de passende siRNA voorraad-oplossing (20 pm).
      4. Schud beide buizen langzaam de orbitale schudder gedurende 5 min en vervolgens de inhoud van de buizen mengen en roeren gedurende nog 20 min.
    3. Verzamelbak 100 pl MEM van elke druppel en vervangen door hetzelfde volume van transfectie mengsel verkregen in de voorgaande stap door pipetteren.
    4. Vervang de transfectie oplossing CMRL medium na 4 uur incubatie bij 37 ° C. Herhaal stappen 2.1.1-2.1.3 de volgende dag celherkiezing transfectie.
  2. siRNA Transfectie van Human myotubes
    1. Voordat transfectie, vervang het medium (zie stap 1.2.2.8) met 2 ml vers medium differentiatie per 3,5 cm petrischaal.
    2. In steriele 1,5 ml buis, stelt een combinatie van 20 nM siRNA (siControl of siClock), hetgeen overeenkomt met 2,4 pi van een 20 pM oplossing siRNA en 12 pl transfectiereagens verdund in 100 pl differentiatiemedium. Incubeer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten onder zacht schudden.
    3. Transfecteren cellen met 114,4 pl van de siRNA mix per 3,5 cm petrischaaltje plaats cellen in een weefselkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur.

3. Continue lange termijn Circadiane bioluminescentie opname parallel uitgevoerd met de beoordeling van hormoon in levende menselijke primaire cellen

  1. Introductie van Circadiane Bioluminescentie Reporters in menselijke primaire cellen doorlentivirale Transductie
    LET OP: Alle procedures met lentivirale deeltjes moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidsniveau 2 mogelijkheid om extra voorzorgsmaatregelen voor het werk te nemen met middelen die een matig potentieel gevaar voor het personeel en het milieu.
    1. Bereid reporter lentivirale deeltjes door co-transfecteren van de vector van belang pLenti6.4 / R4R2 / V5-DEST / Bmal1-luc of pLV156-Per2-dLuc (genaamd Bmal1-luc en Per2-luc, respectievelijk) plasmide 31 met lentivirale vectoren pMD2G en psPAX in 293T-cellen met behulp van de polyethyleenimine methode (voor gedetailleerde procedure zie referentie 16).
    2. Titreer de verkregen lentivirale deeltjes (details over de titratie kan worden verkregen bij http://lentilab.unige.ch/). Voor verdere experimenten gebruikt lentivirussen met titers variërend 10 april - 10 mei transducerende eenheden [TU / ul].
    3. Plaats gerechten met menselijke eilandje cellen of menselijke myoblasten (bij 30-50% confluentie) in de laminaire stroming cabineet en vervang het medium met 2 ml vers aangevulde CMRL medium (zie stap 1.1.7) of groeimedium (zie stap 1.2.2.2), respectievelijk.
    4. Bereken de multipliciteit van infectie (MOI) (dwz infectieuze deeltjes (transducerende eenheden) / aantal cellen).
    5. Transduceren van de primaire celkweek pipetteren lentivirus oplossing van de schotel teneinde een MOI = 3 te verkrijgen (bijvoorbeeld voor 65.000 aangehechte cellen voeg 3 ul van de virusoplossing met de titer van 6,5 x 10 4-100 pl medium druppel).
    6. Incubeer overnacht in een weefselkweek incubator. Wijzig medium de volgende dag.
      OPMERKING: transduceren humane eilandcellen ten minste 4 dagen voor bioluminescentie opname om voldoende expressie van het construct te bereiken. Myoblasten getransduceerd tijdens de expansiefase, vervolgens gekweekt tot confluentie en vervolgens in myotubes gedifferentieerd.
  2. In Vitro Synchronisatie van humane primaire cellen
    1. 10 pM toevoegen van adenylyl cyclase activator in 2 ml medium per 3,5 cm petrischaal die de primaire cellen getransduceerd eerder in stap 3.1.5.
    2. Incubeer gedurende 60 minuten bij 37 ° C in een celkweek incubator.
    3. Verander het medium dat het adenylaatcyclase activator met 2,5 ml van het registratiemedium bevattende 100 pM luciferine.
      Opmerking: Voor humane eilandcellen gebruiken CMRL aangevuld met 10% FBS, 1% L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 1% P / S, 1% gentamycine; voor menselijk gebruik myotubes fenolrood - vrij DMEM met 1 g / l glucose aangevuld met 2% FBS, 2% L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 1% P / S, 0,5% gentamycine en 0,2% amfotericine B.

4. Parallel Assessment van het circadiaans Bioluminescentie opnemen en hormoon Profiles in Synchronized Human Secretory primaire cellen

  1. Het opzetten van lange termijn Constant Perifusion en Bioluminescentie opnemen voor menselijke primaire cellen.
    LET OP: Bij het werken outside de laminaire stroming kabinet, schoon alle contactoppervlakken en de blootstelling van culturen of medium te beperken tot de lucht om besmetting te voorkomen.
    1. De perifusion medium te bereiden, voeg 100 uM luciferine aan het medium.
      Opmerking: Voor humane eilandcellen gebruiken CMRL aangevuld met 10% FBS, 1% L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 1% P / S, 1% gentamycine; voor menselijk gebruik myotubes fenolrood - vrij DMEM met 1 g / l glucose aangevuld met 2% FBS, 2% L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 1% P / S, 0,5% gentamycine en 0,2% amfotericine B.
    2. In de laminaire stroming kast openen 3,5 cm schalen met de getransduceerde getransfecteerde en gesynchroniseerde primaire celculturen (eilandjescellen of myotubili) zoals hierboven beschreven. Plaats steriele metalen doppen (ontwikkeld in eigen huis) (Figuur 1B2) in het cm gerechten 3.5 die zijn uitgerust met siliconen instroom / uitstroom verbindingsbuizen (Figuur 1B1 / B5).
    3. Leg de gerechten op de weegschaal in de 37 ° C lechts-tight incubator. Bevestig de gerechten tot het platform met behulp van een schroefbare adapter (Figuur 1B3). Plaats de instroom / uitstroom buisjes met perifusion systeem in de juiste silicone buizen van de kap (Figuur 1B1 / B5) en de snelheid van de pomp met een debiet van ~ 0,5 ml medium per 1 uur.
    4. Open het in-house ontwikkelde Drip-biolumicorder software die de signalen registreert van de fotomultiplicator buis (PMT) detector. Koos de directory waar de gegevens worden opgeslagen en start continu bioluminescentie opname van elk gerecht door te klikken op het pictogram "start".
      Opmerking: Als alternatief voor de Druppel-biolumicorder software, andere programma's (bijv LumiCycle), kan worden gebruikt om signalen van PMT-detector opnemen.
    5. Plaats steriele 6-well weefselkweek platen in de collectebus op het ijs.
    6. Open de besturingssoftware die de timing van de schakelautomaat onder opvangputten regelt. Stel de tijd window van middelgrote collectie (sec). Begin collectie van de uitstroom medium elke 4 uur (14.400 sec; ~ 2 ml per time-point) door te klikken op het pictogram "run".
    7. Transfer en meet de uitstroom medium van elke collectie goed in steriele 2 ml buizen door pipetteren. Houd buizen in een -20 ° C vriezer voordat u de volgende stap. Herhaal de stappen 4.1.5-4.1.6 elke 24 uur.
    8. Stop de bioluminescentie opname en het medium stroom door te klikken op het pictogram "stop" op de bijbehorende software. Verwijder de metalen doppen en zuig de resten van het medium van de gerechten.
    9. Om het uitgescheiden eiwit verkregen waarden in verschillende experimenten te normaliseren, hetzij extract DNA (normalisatie van genomisch DNA content myotubili 19) of voeg 1 ml lysis zuur-ethanol buffer (normalisatie van totale hormoon voor eilandcellen 18) aan de gerechten.

5. Meten Islet Hormoon en Myokine Levels in de UitstroomMedium verkregen door continu Perifusion van Human Primary Endocriene Cellen

  1. Insuline
    1. Kwantificeren basale insuline niveaus in het effluent van medium verzameld tijdstippen door een humane insuline enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) kit volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Normaliseren van gegevens naar de absolute hoeveelheid ingezamelde medium in elk putje en de totale insuline, geëxtraheerd uit zuur-ethanol behandelde cellen aan het eind van de proef (stap 4.1.9) 18.
  2. Interleukine-6 ​​(IL-6)
    1. kwantificeren basale IL-6 niveau in de uitstroom van medium verzameld tijdstippen met een humaan IL-6 ELISA-kit volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Normaliseren van gegevens naar de absolute hoeveelheid ingezamelde medium in elk putje en genomische DNA-gehalte aan het einde van de proef (stap 4.1.9).

6. Circadiane Dataset Analyses voor Bioluminescentie en hormoon Profielen

  1. bioluminescentie Analyse
    1. Analyseer bioluminescentie profiel met behulp van de meegeleverde software 19.
  2. JTK-cyclus Analyse
    1. Analyseer hormoon profielen en bioluminescentie opname resultaten met behulp van de JTK_CYCLE algoritme 32.
    2. Stel de circadiane periode breedte bij 20-24 uur.
      LET OP: Voor het geval dat de experimentele condities die in parallel, kan een gepaarde statistische analyse worden uitgevoerd om de experimenten te vergelijken.
  3. CosinorJ Analyse
    1. Als alternatief, analyseren hormoon en circadiane bioluminescentie profielen met behulp van de software CosinorJ 28.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beoordeling van de Islet hormoon met Parallel Circadiane bioluminescentie Opnemen van Perifused Human Islet Cells

Na verschaffen van een eerste moleculaire karakterisatie van de circadiane klok, werkzaam in humane eilandcellen 16, we gericht op het bestuderen van het effect van de klok verstoring van eilandje functie en transcriptie 18. We zetten een efficiënte siClock transfectie protocol in ver...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier beschreven experimentele instellingen bestaan uit lentivirale levering van circadiane bioluminescentie reporters in gekweekte humane primaire cellen, gevolgd door achtereenvolgende in vitro synchronisatie en continue registratie van bioluminescentie enkele dagen en parallelle analyse van hormoon door dezelfde cellen. Zij vertegenwoordigen een efficiënte aanpak voor het verkennen van de moleculaire mechanismen en functionele aspecten van circadiane klokken in menselijke primaire cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn dankbaar dat onze collega's van de Universiteit van Genève: Jacques Philippe constructieve reacties op dit werk, Ueli Schibler voor onschatbare hulp bij de ontwikkeling van het perifusion systeem en voor de wetenschappelijke inspiratie, André Liani voor hebben bedacht ontwerp, de fabricage en inbedrijfstelling van de perfusie-systeem, Lesa-Technology LTD voor de hulp in de perifusion systeem en Drip-biolumicorder software development, George Severi voor hulp bij de perifusion experimenten, Ursula Loizides-Mangold voor het kritisch lezen van het manuscript, en Anne-Marie Makhlouf voor lentivirus bereidingen ; Etienne Lefai, Stéphanie Chanon en Hubert Vidal (INSERM, Lyon) voor het bereiden van humane primaire myoblasten; en Domenico Bosco en Thierry Berney (Human Islet Transplantation Center, Genève Universitair Ziekenhuis) voor het leveren van menselijke eilandjes. Dit werk werd gefinancierd door de Swiss National Science Foundation Grant No. 31003A_146475 / 1, de Sinergia Swiss National Science Foundation Grant No. CRSII3-154405, Fondation Romande pour la Recherche sur Diabète, Bo Hjelt Foundation, Fondation Ernst et Lucie Schmidheiny en Société Académique de Genève (CD).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Trypsin-EDTAInvitrogen25300-054Voor spierbiopsie-digestie
DPBS zonder calcium zonder magnesiumInvitrogen14190-094
HAM F-10Invitrogen41550-021Voor myoblastencultuur
FBSInvitrogen10270Aanvulling op het kweekmedium
Penicilline-StreptomycineSigmaP0781-100Aanvulling op het kweekmedium
GentamicineAxon A1492.0001Aanvulling op het kweekmedium
FungizoneInvitrogen15290-026Amphotericin B, aanvulling op het kweekmedium
DMEM 1g/L glucose + Na pyruvaat + glutamax Invitrogen21885-025Voor myotubes-kweek
DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvaat - glutamaxInvitrogen11880-028Opnamemedium voor LumiCycle
GlutamaxInvitrogen35050-028L-alanyl-L-glutamine dipeptide, aanvulling op opnamemedium
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-104Cell detachment oplossing, voor eilandceldissociatie
CMRLGibco21530-027Kweekmedium voor eilandcellen
NatriumpyruvaatGibco11360-039Aanvulling op het kweekmedium
15 ml High-Clarity Polypropylene Conical TubeFalcon352096
F75 flaconBD Falcon353136
3.5 cm Petri-schaal BD Falcon353001
FoskolinSigmaF6886Adenylyl cyclase activator, gebruikt voor synchronisatie
LuciferineProlume LTD260150Aanvulling op het opnamemedium
OptiMEM Invitrogen51985-026Serum-vrij minimaal essentieel medium (MEM) gebruikt voor transfectie van humane eilandcellen
Lipofectamine RNAiMAX reagensInvitrogen13778-150Transfectiereagens
HiPerFect reagensQiagen301705Transfectiereagens
ON-TARGET plus siCLOCK smartpool DharmaconL-008212-00
ON-TARGET plus niet-richtend siRNA #1 (siControl)DharmaconD-001810-01
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen69504Voor DNA-extractie van myotubes
RNeasy Plus Mini kit Qiagen74104Voor RNA-extractie van myotubes
QIAshredder Qiagen79654Voor RNA-extractie van myotubes
2 ml opvangbuisjesAxygen311-10-051Om het medium te verzamelen met de perifusie
Weefselkweekplaat, 6 WellBD Falcon 353046Om het medium te verzamelen met de perifusie
RNeasy Plus Micro kit Qiagen74034Voor eiland-RNA-extractie
Human IL-6 Instant ELISA kit eBioscience88-7066-22
Human Insulin Kit MercodiaMercodia10-1113-01
Zoutzuur, min, 37%, p.a.Acros organics124630010Gebruikt voor bereiding van lysebuffer (375 ml Ethanol + 7,5% HCl + 117,5% H2O)
Ethanol (>99,8%)Fluka Analytical02860-1LGebruikt voor bereiding van lysebuffer (375 ml Ethanol + 7,5% HCl + 117,5% H2O)
Human Islets voor onderzoekProdo Laboratories
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Apparatuur:
CentrifugeHeraeusMegafuge 1.0R
WaterbadVWR1112A bij 37 °C
Weefselkweek-afzuigkapFaster SafeFastElite
WeefselkweekincubatorHeraeusHeraCell 1505% CO2 bij 37 °C, geen water vanwege de LumiCycle-installatie
WeefselkweekincubatorHeraeusHeraCell 1505% CO2 bij 37 °C, geen water vanwege de LumiCycle-installatie
WeefselkweekincubatorThermo ScientificHera Cell 150i5% CO2 bij 37 °C
SchudderHeidolph InstrumentsUnimax 1010Voor agitatie van het siRNA-mengsel
LumiCycleActimetrics
LumiCycle-softwareActimetrics
CosinorJ-softwareEPFLVrij beschikbaar op: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/
Rheodyne titan MX ERC GmbHControlesoftware die het timing van de geautomatiseerde schakelaar regelt
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
  2. Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
  3. Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
  4. Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
  5. Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
  6. Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
  7. McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
  8. Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
  9. Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
  10. Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
  11. Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
  12. Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
  13. Hastings, M., O'Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
  14. Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
  15. Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
  16. Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
  17. Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
  18. Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
  19. Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
  20. Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95(2015).
  21. Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
  22. Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
  23. Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
  24. Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
  25. Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
  26. Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
  27. Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
  28. Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
  29. Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
  30. Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049(2015).
  31. Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023(2008).
  32. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  33. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
  34. Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
  35. Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
  36. Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376(2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Bioluminescentie registratieLentivirale TransductiesiRNA transfectieInsulinesecretieMyokine secretieActivering van AdenylylcyclaseCollectie van Uitstroommedium

Gerelateerde artikelen