Tools om de rol van de Architectural eiwit HMGB1 Bestudeer in de verwerking van Helix vervormen, site-specifieke DNA InterStrand Crosslinks

Samenvatting

Gerichte DNA-schade kan worden bereikt door een DNA-beschadigend middel aan een triplex-vormend oligonucleotide (TFO) te koppelen. Met behulp van gemodificeerde TFO's kunnen DNA-schade-specifieke eiwitassociatie en DNA-topologiemodificatie in menselijke cellen worden bestudeerd door het gebruik van gemodificeerde chromatine-immunoprecipitatie-assays en DNA-superspiralisatie-assays zoals hier beschreven.

Samenvatting

Hoge mobiliteit groep box 1 (HMGB1) eiwit is een niet-histon architectonische eiwit dat betrokken is bij het reguleren van vele belangrijke functies in het genoom, zoals transcriptie, DNA-replicatie en DNA herstel. HMGB1 bindt structureel vervormde DNA met hogere affiniteit dan canonieke B-DNA. Zo vonden we dat HMGB1 bindt aan DNA InterStrand crosslinks (ICL), die covalent verbinden de twee strengen van het DNA, veroorzaakt vervorming van de helix, en als links unrepaired celdood veroorzaken. Door hun cytotoxische reactie, worden meerdere ICL-inducerende middelen momenteel gebruikt als chemotherapeutische middelen in de kliniek. Terwijl ICL-vormende middelen tonen voorkeuren voor bepaalde basensequenties (bijvoorbeeld 5'-TA-3 'is de geprefereerde verknoping site voor psoraleen), zij grotendeels veroorzaken DNA-schade op een willekeurige manier. Echter, door covalente koppeling van het ICL-inducerende middel aan een triplex-vormende oligonucleotiden (TFO), dat bindt aan DNA op een sequentie-specifiekewijze kan target DNA beschadiging worden bereikt. Hier gebruiken we een TFO covalent geconjugeerd aan het 5 'uiteinde een 4'-hydroxymethyl-4,5', 8-trimethylpsoraleen (HMT) psoraleen een plaatsspecifieke ICL genereren op een mutatie-reporterplasmide te gebruiken als hulpmiddel de architectonische modificatie, verwerking en reparatie van complexe DNA laesies bestuderen door HMGB1 in humane cellen. We beschrijven experimentele technieken om TFO gerichte ICLs voor te bereiden op de reporter plasmiden, en de associatie van HMGB1 met de TFO gerichte ICLs ondervragen in een cellulair context met behulp van chromatine immunoprecipitatie assays. Daarnaast beschrijven we DNA supercoiling assays voor specifieke architecturale modificatie van het beschadigde DNA beoordelen door het meten van de hoeveelheid superhelische windingen ingevoerd op het psoraleen-verknoopte plasmide door HMGB1. Deze technieken kunnen worden gebruikt om de rol van andere eiwitten die betrokken zijn bij de verwerking en reparatie van TFO-gerichte ICLs of andere gerichte DNA schade in een cellijn van belang bestuderen.

Inleiding

Triplex-vormende oligonucleotiden (TFOs) binden duplex DNA in een sequentie-specifieke manier via Hoogsteen-waterstofbruggen triple helix structuren ^1-5 te vormen. Triplex technologie is gebruikt om diverse biomoleculaire mechanismen, zoals transcriptie, DNA schade herstel en gene targeting (beoordeeld in referenties ^6-8) ondervragen. TFOs zijn uitgebreid gebruikt voor plaatsspecifieke schade aan reporterplasmiden ^9,10 induceren. Ons laboratorium en anderen hebben eerder gebruik gemaakt van een TFO, TL30, vastgemaakt aan een psoraleen molecuul naar site-specifieke DNA InterStrand crosslinks (ICL) in de supF gen op het plasmid....

Protocol

1. Bereiding van TFO gerichte ICLs op Plasmid Substrates

1. Incubeer equimolaire hoeveelheden plasmide pSupFG1 ^10,11 DNA (5 ug plasmide-DNA is een goed uitgangspunt) met psoraleen geconjugeerd TFO AG30 in 8 gl triplex bindingsbuffer [50% glycerol, 10 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgClz _2] en dH ₂ O tot een eindvolume van 40 ul in een amber buisje. Meng goed door en neer te pipetteren. Incubeer de reactie bij 37 ° C waterbad gedurende 12 uur.
2. Warmen de UVA lamp op volle vermogen te garanderen. Plaats de triplex reactie op film paraffine en plaats de paraffine film op ijs onder het UVA (365 nm) lamp. Plaats een Mylar filter ....

Resultaten

Vorming van het TFO-gerichte ICL essentieel is voor het plasmide-gebaseerde testen die worden gebruikt om de rol van eiwitten in architecturale ICL verwerking ondervragen menselijke cellen. Denaturerende agarose gelelektroforese is een gemakkelijke manier om de efficiëntie van TFO-gerichte ICL formatie te bepalen. De plasmiden TFO gerichte ICLs migreren met een langzamere mobiliteit door de agarose gelmatrix (Figuur 1A, laan 3) vergeleken met de niet-verknoopte controle .......

Discussie

De efficiënte vorming van TFO-gerichte ICL is afhankelijk van twee belangrijke factoren: Ten eerste, goede buffercomponenten (bijv MgCl ₂₎ en de incubatietijd van de TFO met een doel-DNA-substraat (afhankelijk van de bindingsaffiniteit van de TFO zijn doelstelling duplex, en de gebruikte concentraties); en ten tweede de juiste dosis UVA (365 nm) bestraling psoraleen verknopingen efficiënt vormen. Optimale triplex vorming kan worden bereikt door HPLC of gel gezuiverd TFOs. Onzuiverheden verontreinigin.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
5'HMT Psoralen-AG30	Midland Certified Reagent Co., Midland, TX	Op bestelling	HPLC (of gel) gezuiverd
Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit	Cell signaling Inc.	9003	De door de fabrikant aanbevolen protocol is geoptimaliseerd voor chromatine IP en niet voor plasmide IP. De controle IgG en H3 antilichamen evenals de Protein G kralen en micrococcische nuclease worden geleverd door de fabrikant.
GoTaq Green	Promega	M7122	PCR master mix
HMGB1 antilichaam	Abcam	Ab18256
Wizard Gel and PCR cleanup kit	Promega	A9281
Chloroquine-difosfaat zout	Sigma	C6628-50G	Voor tweedimensionale agarose gel elektroforese
EcoRI	New England BioLabs	R0101S
GenePORTER transfectie reagens	Genlantis	T201015
Vaccinia Topoisomerase I	Invitrogen	38042-024
Blak-Ray lange golf ultraviolette lamp	Upland, CA	B 100 AP	UVA lamp
EpiSonic Multi-Functionele Bioprocessor 1100	Epigentek	EQC-1100	Waterbad sonicator
Mylar filter	GE Healthcare Life Sciences	80112939
Agarose	Sigma-Aldrich	A6111
BIO-RAD Chemidoc	BIO-RAD	XRS+ systeem	DNA beeldvormingssysteem
Glycine	Fisher Scientific	BP381-500
37% Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775-25ML	Gebaten voor crosslinking
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
DMEM	ThermoFisher	11965092	Celcultuur media
PBS	ThermoFisher	70013073	Celcultuur
Trypsin-EDTA	ThermoFisher	25200056	Celcultuur
Bromocresol groen	Sigma-Aldrich	114-359	DNA ladings kleurstof
Siliconised buizen	Fisher Scientific	02-681-320	Microfuge buis met lage retentie
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1
Boorzuur	Fisher Scientific	A74-1
EDTA	Fisher Scientific	BP24731
Fotometer	InternationalLight Technologies	ILT1400-A	UVA dosis meting
Cel lijnen
Human U2OS osteosarcoom	ATCC	ATCC HTB-96	Gekweekt volgens de aanbeveling van de leverancier
Human cervix adenocarcinoom HeLa	ATCC	ATCC-CCL-2	Gekweekt volgens de aanbeveling van de leverancier
Proximale voorwaartse primer	5'-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Proximale omgekeerde primer	5'-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Distale voorwaartse primer	5'-aat acc gcg cca cat agc ag
Distale omgekeerde primer	5'-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc