Methodenartikel

Visualisatie van de Charcoal Agar Resazurin Assay voor Semi-kwantitatieve, Medium-throughput bepalen van het aantal mycobacteriën

DOI:

10.3791/54690

⸱

14 december 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departments of Microbiology & Immunology, Weill Cornell Medical College, 2Medicine, Weill Cornell Medical College

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kolen agar rezazurin assay (CARA) is een semi-kwantitatief, medium-doorvoer methode om de activiteit van testmiddelen te beoordelen tegen mycobacteriën die zich vermenigvuldigen, niet vermenigvuldigen of beide. De CARA maakt een snelle evaluatie mogelijk van tijd- en concentratie-afhankelijke activiteit en identificeert parameters om na te streven door kolonievormende eenheid (CFU) assays.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is een dringende behoefte om te ontdekken en de vooruitgang anti-infectiva dat de duur van tuberculose (tbc) behandeling verkorten. Mycobacterium tuberculosis, het etiologische agens van tuberculose, ongevoelig is voor snelle en duurzame chemotherapie vanwege de aanwezigheid van bacillen vertonen fenotypische geneesmiddelresistentie. De c harcoal een gar r esazurin een ssay (CARA) werd ontwikkeld als een instrument om actieve moleculen door high-throughput screening campagnes ontdekt karakteriseren tegen repliceren en non-replicating M. tuberculosis. Opneming van geactiveerde koolstof in bacteriologische agar medium die helpt het effect van verbinding versleping, en elimineert de noodzaak voor een pre-cellen te verdunnen voordat spotten op CARA microplaten. Na 7-10 dagen incubatie bij 37 ° C, de vermindering van Resazurin door mycobacteriën microkolonies groeien op het oppervlak van CARA microtiterplaat putjes maakt semikwantitatieve assessment van bacteriële nummers via fluorometrie. De CARA detecteert ongeveer 2-3 log 10 verschil in bacteriële aantallen en voorspelt een minimale bacteriedodende concentratie leidt tot ≥99% bacteriële kill (MBC ≥99). De CARA helpt bepalen of een molecuul is aangemeld bacillen die replicerend, niet-replicerend, of beide. Proefprojecten met behulp van de CARA vergemakkelijkt de identificatie van die concentratie van testmiddel en het tijdstip van de blootstelling verbinding vereist verdere evaluatie door kiemgetal (CFU) assays. Bovendien kan de CARA voorspellen of replicerende actieve bactericide of bacteriostatisch.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium tuberculosis, het etiologische agens van tuberculose, kan overleven in een gastheer in een latente toestand die ongevoelig is voor antibiotica uitroeiing. Fenotypische (niet-genetische) resistentie van M. tuberculosis tijdens infectie wordt verondersteld het gevolg te zijn, gedeeltelijk, populaties van niet-replicerende bacillen 1,2. Klasse I persisters weergeven van fenotypische resistentie tegen geneesmiddelen ontstaan via zeldzame stochastische mechanismen onder grote populaties van drugs gevoelige cellen 3,4. Klasse II persisters worden bewezen non-replicating door factoren van de immuniteit van de gastheer, met inbegrip van externe spanningen in microenvironments tegengekomen tijdens infectie. We ontwikkelden onlangs een in vitro model van klasse II niet-replicerende persistentie voorwaarden geconfronteerd met M. tuberculosis in geactiveerde macrofagen en granulomen nabootsen. Multi-stressmodel van klasse II persistentie kunnen aandoeningen die langzame groei, zoals een vetzuur koolstofbron en volledig halt groei, zoals lichte zuurgraad (pH 5,0), hypoxia (1% O2) en stikstofoxide en andere reactieve stikstof tussenproducten 5-9. Grootschalige screening gebruik deze multi-stress-model van niet-replicatie, en andere Class II non-replicating modellen, heeft diverse moleculen waarvan de activiteit is gericht tegen het niet-replicerende staat 5-7,9-18 opgeleverd. Dezelfde niet-replicerende schermen bleek ook een categorie van moleculen die activiteit bezitten tegen zowel replicerende en niet-replicerende bacillen, zogenaamde "dual actieve" 7,10,12,19,20.

Antibacteriële drug discovery in de hit-to-lead fase omvat uitgebreide karakterisering van kandidaat-moleculen om leads voor hit uitbreiding voorlopige farmacologische karakterisering, target identificatie, en de voorlopige in vivo studies kiezen. Als een vroege stap worden anti-infectiva ingedeeld volgens hun bacteriostatische of bacteriedodende werkingsmechanisme en, indien bacteriedodend, wHether bacteriële kill is tijd- en / of de concentratie-afhankelijk. Het kiemgetal (CFU) test is de klassieke, gouden standaard methode om deze vragen te beantwoorden. In de CFU assay worden bacteriën blootgesteld aan een testmiddel, waarna monsters verwijderd, serieel verdund en porties van verdunningen worden uitgespreid op vast medium en geïncubeerd bacteriologische groei van overlevende cellen mogelijk. Tenslotte worden bacteriële kolonies geteld. De CFU assay vereist grote aantallen microtiterplaten cellen en agar bevattende Petri-platen verdunnen tot overlevende kolonies sommen. De CFU test voor langzaam groeiende mycobacteriën wordt gehinderd door hun langzame generatie tijd (18-24 uur), die ongeveer 3 weken nodig heeft om kolonies te verschijnen op platen. Verder wordt incubator ruimte vaak beperkt in gespecialiseerde bioveiligheid-niveau-3-faciliteiten.

Terwijl omslachtig, CFU assays zijn de gouden standaard voor de impact van niet-replicerende en dual-actieve moleculen op mycobacter karakteriserenIA. Non-repliceren assays zijn onderhevig aan hoge vals-positieve tarieven als velen zijn gekoppeld aan repliceren assays om cellulaire levensvatbaarheid 6-8 te beoordelen. Bijvoorbeeld, een verbinding die krachtige activiteit tegen replicerende M. tuberculosis (een "actieve replicerende") mogelijk niet doden tijdens de niet-replicerende assay, maar nog steeds doden dankzij overdracht van de niet-replicerende fase van het test om de herstelfase van de test, die onder omstandigheden die replicatie ( "repliceren voorwaarden") te ondersteunen wordt uitgevoerd. Verbinding overdracht compliceert analyse van dubbele actieve moleculen, waardoor het moeilijk te onderscheiden of activiteit replicerende, niet-replicerend of dubbel.

Om de hierboven beschreven problemen aan te pakken, ontwikkelden we de c harcoal een gar r esazurin een ssay (CARA) voor een snelle, semi-kwantitatieve opsomming van mycobacteriële soorten zoals M. tuberculosis, M. bovis BCG, M. smegmatis 7 (figuren 1 en 2). In buffer oplossingen in vitro, actieve kool snel sequesters de meeste van de standaard drugs gebruikt voor de behandeling van tuberculose 7. Actieve kool in CARA microplaten bindt verbindingen die dan kan vervoeren van een assay microplaat, en deze functie van de CARA elimineert de eis om serieel verdunnen test goed inhoud voorafgaand aan de opsomming 7,21,22. Het aantal mycobacteriële microkolonies op het agar oppervlak van CARA microplaten wordt geschat door de toevoeging van Resazurin, een blauwe kleurstof, een gereduceerde vorm, resorufine, is een rose molecule waarvan de fluorescentie wordt gemeten door spectrofotometrie 23. CARA microplaten worden gedurende 1-2 dagen voor M. smegmatis en 7-10 dagen voor langzaam groeiende mycobacteriën zoals M. tuberculosis en M. bovis BCG. De CARA heeft een smal dynamisch bereik van ~ 2-3 log 10 diffeRenče in CFU. Wanneer gebruikt in plaats van CFU-test, één CARA microplaat vervangt ongeveer vijf 96-well platen gebruikt voor seriële verdunningen en 120 tri-style agarplaten voor plateren. Interpretatie van CARA gegevens helpen begeleiden latere studies door te bepalen welke incubatietijden en samengestelde concentraties te testen in meer bewerkelijke CFU-gebaseerde testen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van CARA Microplaten

  1. Autoclaaf 900 ml Middlebrook 7H11 agar die 0,2% glycerol en 0,4% geactiveerde koolstof in een 2 L Erlenmeyer kolf, of als alternatief 450 ml in een 1 L glazen beker. Omvatten een groot autoclaveerbaar roerstaafje in de kolf of beker. Dek de opening van de kolf of bekerglas af met aluminiumfolie en hechten aan glas met autoclaaf tape.
  2. Koel om (ongeveer 55-65 ° C) te raken op een magnetische roer plaat ingesteld op een lage snelheid naar de houtskool in suspensie te houden.
  3. Voer alle volgende stappen aseptisch in een bioveiligheid kap die een magnetische roer plaat.
  4. Verwijder folie. Voeg 100 ml OADC supplement (OADC supplement, bij gebruik bij 10%, opbrengst uiteindelijke media concentraties van 0,2% dextrose, 0,5% albumine, 0,085% NaCl, 0,0005% oliezuur en 0,4 mg / ml catalase) aan de 2 L Erlenmeyer of 50 ml OADC de 1 L beker en meng.
  5. Bij gebruik van een erlenmeyer, giet ongeveer 25-40 ml 7H11-OADC-houtskool in een steriele reagensreservoir. Bij gebruik van de beker, is het niet noodzakelijk een reagensreservoir gebruiken.
  6. Vul een 96-well microplaat met 200 gl / putje 7H11-OADC-houtskool uit het reagensreservoir of beker. Werk snel om agar stollen en de introductie van luchtbellen te vermijden. Vermijd spatten vast medium buiten de putjes, als een bron van schimmel besmetting kan worden. Met behulp van een multichannel pipet, gebruikt u een set van 12 filter tips voor de overdracht van 7H11-OADC houtskool om de 8 rijen (AH) van de 96-well plaat.
    OPMERKING: Het medium stolt snel. Om te voorkomen dat verstopping pipetpunten, veranderen ze regelmatig.
  7. Als alternatief, giet CARA microplaten met behulp van een P1000 elektronische multichannel pipet met filter tips om te helpen bij de voorbereiding van een groot aantal platen.
    LET OP: Door de geringe omvang van microplaat putten, de agar in CARA microplaten stolt binnen enkele minuten van het gieten.
  8. Plaats stapels CARA microplaten in hersluitbare plastic bags om te voorkomen dat uitdrogen.
  9. WINKEL CARA microplaten bij 4 ° C.

2. instellen repliceren en niet-replicating MIC 90 Testen

  1. Inoculeer M. tuberculosis, M. bovis BCG of M. smegmatis op een OD 580 van 0,01-0,1 en uit te breiden tot mid-log-fase (OD 580 ~ 0.5) in Middlebrook 7H9-ADN (Middlebrook 7H9 dat 0,2% glycerol, 0,2% dextrose , 0,5% albumine en 0,085% NaCl) of 7H9-OADC (Middlebrook 7H9 dat 0,2% glycerol en 10% OADC supplement).
  2. Grow M. tuberculosis en M. bovis BCG als ~ 20 ml staande culturen in celkweek flessen en M. smegmatis schudden in polypropyleen met ronde bodem (4 ml kweek) of 50 ml conische centrifugebuizen (10-20 ml cultuur). Incubeer pathogène mycobacteriën bij 37 ° C met 20% O2 en 5% CO2, en M. smegmatis bij 37 ° C met 20% O2.
  3. Het opzetten van een minimale-remmendeconcentratie (MIC 90) -achtige experiment onder replicerende en niet-replicerende omstandigheden (figuur 2).
    OPMERKING: Testmiddelen worden gewoonlijk getest in duplo of viervoud proeven 4 of 2 verbindingen respectievelijk per 96-well microplaat mogelijk. Bijvoorbeeld, in een 96-well plaat, een testagens kan worden getest in rijen AD en andere in rijen EH. De DMSO (vehikel) in de kolommen 1, 2 en 12, en het testmiddel verdunningsreeks loopt van kolom 3 (laagste concentratie) naar kolom 11 (hoogste concentratie). MIC 90 -achtige assays gebruiken typisch 2-voudige verdunningsreeks. Er zijn tal van non-replicating modellen beschikbaar voor mycobacteriën 14-16,18,24,25 en ter illustratie, maken we gebruik van een multi-stress-model van niet-replicatie 6,8,9.
    1. Voor replicating assay distribueren 200 ul cellen in 7H9-ADN bij een OD 580 van 0,01 in ieder putje van een heldere bodem, met weefselkweek behandelde plaat met 96 putjes.
    2. Voor de niet-replicerende assay, was de cellen tweemaal in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 0,02% tyloxapol en resuspendeer cellen in niet-replicerende medium (0,05% KH 2PO 4, 0,05% MgSO 4, 0,005% ferri-ammoniumcitraat , 0,0001% ZnCl2, 0,1% NH4Cl, 0,5% BSA, 0,085% NaCl, 0,02% tyloxapol, 0,05% butyraat, pH ingesteld op 5,0 met 2 N NaOH).
      1. Verdun cellen tot een OD 580 van 0,1 in niet-replicerende medium en NaNO 2 uit een vers bereide 1 M voorraadoplossing toe tot een eindconcentratie van 0,5 mM.
      2. Verdeel 200 ul cellen in een OD 580 van 0,1 in ieder putje van een heldere bodem, met weefselkweek behandelde plaat met 96 putjes.
        LET OP: Maak verbinding verdunningen als 100-voudige stockoplossingen in DMSO. Dus een typisch MIC plaat testen van het effect van een molecuul op een eindconcentratie 0,4-100 ug / ml zou voorraadoplossingen van 0,04-10 mg / ml in DMSO vereisen.
    3. Voeg 2 pl disingen van testmiddel 1 in rijen AE en 2 pl verdunningen van testmiddel 2 in rijen EH. Meng grondig.
    4. Voeg 2 ul mediumcontrole (gewoonlijk DMSO) in controleputjes, kolommen 1, 2, 12 (rijen AH). Meng grondig.
    5. Voor elk experiment werden ten minste één positieve controle zoals rifampicine 0,004-1 ug / ml (replicerend assay) en / of 0,08-20 ug / ml (niet-replicerende assay).
      Opmerking: Het gebruik van 6-broom-1H-indazool-3-amine 9 0,1 tot 25 ug / ml wordt aanbevolen als een controle verbinding, die selectief is, NaNO 2 afhankelijke activiteit in de meervoudige stress-model van niet-replicatie.
    6. Voor het repliceren assays, incubeer microtiterplaten bij 37 ° C bij 20% O2 en 5% CO2 gedurende 7 dagen (M. tuberculosis en M. bovis BCG) of 1-48 uur (M. smegmatis). Voor de meervoudige stress-model van niet-replicatie, incubeer microplaten gedurende 7 dagen bij 37 ° C bij 1% O2 en 5% CO2 ( M. tuberculose en M. bovis BCG).

3. Enten van CARA Microplaten

  1. Op tijdstippen waarop het CARA worden gebruikt als uitlezing zorgvuldig mengen en de inhoud van de MIC 90 -achtige testplaat met een p200 multichannel pipet bedraagt 50-75 pl. Pipet op en neer ten minste 5-10 keer en voorzichtig wervelen de put inhoud in een cirkelvormige beweging met behulp van de pipet tips.
  2. Breng 10 pl bepalingsbuffer goed inhoud naar de CARA microplaat. Zorg ervoor dat de volgorde van de put inhoud van de assay plaat overeenkomt met de volgorde van de put inhoud van het CARA microplaat. Vermijd spatten tijdens de transfers en zorg ervoor dat de 10 ul worden gespot in het midden van de CARA microplaat putten. Bevestig de 10 ul absorbeert in de CARA microplaat.
    LET OP: Er zijn geen verdunningen vereist voor het spotten van cellen op het CARA microplaten.
  3. Bind stapels CARA microplaten met plaat en tapeplaats dan in een hersluitbare plastic zak. Incubeer CARA microplaten bij 37 ° C met 20% O 2 (M. smegmatis) of 1% O2 en 5% CO 2 (M. tuberculosis en M. bovis BCG).
  4. Voor M. tuberculosis en M. bovis BCG, repliceren assays: incubeer gedurende 7 dagen; voor M. tuberculosis en M. bovis BCG non-replicating assays, incubeer gedurende 10 dagen; M. smegmatis, repliceren assays, incubeer gedurende 1-2 dagen; M. smegmatis, niet-replicerend assays Incubeer 2-3 dagen.
    LET OP: De tijden zijn schattingen en kunnen dienovereenkomstig worden aangepast voor verschillende repliceren, non-replicating, en stress omstandigheden.

4. Ontwikkeling CARA Microplaten

  1. Ontwikkel de CARA microplaten wanneer een film van de groei van bacteriën, of groter, macroscopische kolonies, zijn zichtbaar op de negatieve (voertuig) controleputjes.
    NB: Na langdurig incubatie, CARA microplaat putten vaaklijken droog en we raden pre-wetting goed inhoud met steriele PBS. Hiermee wordt voorkomen dat de houtskool uit absorberende Resazurin, wat kan leiden tot lage fluorescentie of well-to-well variatie.
  2. Met behulp van een enkele set van 12 p200 tips met een multichannel pipet, afzien van 40 pi steriel PBS langs de kant van de putten en laat de PBS te verdelen over de bovenkant van de agar / bacteriële microkolonies.
  3. Bereid CARA ontwikkelen reagens door 5 mg resazurine (0,01% eind) en 50 ml 5% Tween80 in PBS. Vortex en steriel filter.
    Opmerking: Een alternatieve CARA ontwikkelen reagens kan worden bereid door commercieel bereid resazurin vloeibare oplossing in 1: 1 (vol / vol) met 10% Tween80 in PBS.
  4. Voeg 50 ul van vers bereide CARA ontwikkelen reagens aan elk putje van de microplaat CARA behulp van een 12-kanaals pipet. Rock platen heen en weer een paar keer om te helpen verspreiden reagens over de agar en bacteriële mat in elk putje.
  5. Leg de platen ina hersluitbare plastic zak en incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 30 min voor M. smegmatis en 45-60 min voor M. tuberculosis of M. bovis BCG.
    Opmerking: Als het voertuig controle putjes niet aan rood wordt binnen het eerste uur, de platen kunnen opnieuw worden verpakt en gedurende langere tijdsperioden.
  6. Vóór lezen fluorescentie plaatst CARA microplaten in een bio kap voor 15 min bij kamertemperatuur met de deksels verwijderd. Bij het gebruik van BSL3 spectrofotometers buiten een bioveiligheid kast, houden een optische kwaliteit PCR sticker over de plaat en sluit strak door zachtjes te drukken op de sticker met een zachte papieren handdoek.
  7. Bepaal fluorescentie via top gelezen met excitatie bij 530 nm en emissie bij 590 nm. Het is niet nodig om lege de plaat.

5. Data Analysis

  1. Plot remmerconcentratie op de X-as op een log schaal 10 en fluorescentie op de Y-as op een lineaire schaal. Gebruik een scatterplot waarbij een curve fit zoals "log remmer versus respons-variabele helling (4 parameters)". Plot datapunten als gemiddelden ± standaard fout.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CARA verwachte resultaten worden in figuur 2 weergegeven en samengevat in Tabel 1. Voor replicerende cellen, is het CARA parallel met een standaard MIC 90 assays, en voor niet-replicerende assays, de CARA is parallel met een aangepaste MIC 90 test die is gekoppeld met een uitgroei fase. De concentratie van testmiddel dat resulteert in het uitvallen van CARA-fluorescentie boven de achtergrond levels te stijgen is het CARA-MBC ≥99 (Figuur 3a). De "≥99 'subscript geeft aan dat het CARA-MBC biedt een geschatte concentratie van die agent die aanleiding geeft tot ≥2 log 10 bacteriële kill (≥99% kill).

De vloeistof bouillon MIC 90 assay niet in staat is om onderscheid te maken tussen bacteriedodende en bacteriostatische activiteit en dit onderscheid moet worden opgelost door een CFU assay. Doorconventie, de drempel die bactericide onderscheidt van bacteriostatische activiteit voor langzaam groeiende mycobacteriën is ongeveer 2-3 log 10 doden meer dan 7 dagen 7,26. Omdat het dynamisch bereik van de CARA is 2-3 log 10 doden, kan het CARA een schatting van bactericide of bacteriostatische activiteit. De CARA identificeert eenvoudig enkele actieve replicerende bacteriostatisch wijten aan het falen van deze verbindingen CARA fluorescentie achtergrondniveaus te verlagen (figuur 2). Echter, sommige verbindingen met bacteriostatische werking tegen replicatie M. tuberculosis een sterke post-antibiotische effect, hetgeen betekent dat zij niet hergroei bacteriën remmen tijdens de herstelfase, zelfs in afwezigheid van verbinding overdracht. Dit effect kan moeilijk te herkennen in de CARA assay. Verbindingen worden verdacht van het uitoefenen van een post-antibiotisch effect als ze een "vast venster" weergegeven, gedefinieerd als> 4-voudige verschuiving naar rechts tun het MIC en CARA curves (figuur 3b). De statische venster geeft aan dat een molecuul werkzaam is tegen replicerende M. tuberculosis bacteriostatische plaats van bactericide zijn. In sommige gevallen, de statische ramen pas bekend na inspectie van een geëxpandeerd Y-as voor CARA fluorescentie (figuur 3c en 3d).

CARA en MIC 90 gegevens worden meestal samen uitgezet (figuur 4). Representatieve gegevens voor replicating- en niet-replicerende-actieve moleculen getest door MIC 90 en CARA zijn weergegeven in figuur 4. Er zijn 4 belangrijke activiteit klassen voor moleculen: 1) repliceren bacteriedodende (gedemonstreerd met isoniazide, Figuur 4a); 2) repliceren bacteriostatisch (gedemonstreerd met linezolid, figuur 4b); 3) non-replicating bacteriedodende (gedemonstreerd met oxyfenbutazon, Figuur 4c); en 4) replicating-actieve (bacteriostatische of bactericide) en niet-replicerende bactericide (aangetoond PA-824, figuur 4d). Belangrijker Figuren 4a en 4b tonen dat terwijl isoniazide en linezolid lijken werkzaamheid tegen niet-replicerend bacteriën door de MIC 90 assay, de CARA stelt deze niet actief onder de geteste niet-replicerend omstandigheden. Om het nut van de CARA testen voorspellen tijds- en concentratie-afhankelijke effect van een molecuul, repliceren M. smegmatis werd blootgesteld aan toenemende concentraties rifampicine (figuren 5a - d) en op verschillende tijdstippen tussen 1-24 uur werden aliquots gespot op CARA platen. Deze gegevens gaven aan dat rifampicine uitgeoefende invloed al 1 uur (figuur 5a), in oplopende bactericide activiteit tussen 3 en 24 uur (figuren 5b-d), en gedood ≥2-3 log 10 bij ~ 10 pg / ml van 24 uur (Figuur 5d). Een soortgelijk experiment testen viervoud van een mediumcontrole en 9 geneesmiddelconcentraties en op 4 tijdstippen prohibitief zou door een standaard CFU-gebaseerde assay.

Dus de CARA een rol in drug discovery als medium-throughput, snel mechanisme om een ​​molecuul activiteitsprofiel identificeren. CARA voorspellingen moeten rigoureus worden geëvalueerd met behulp van een standaard CFU test. De toevoeging van 0,4% geactiveerde koolstof Petri platen voor CFU analyse kan verbeteren correlatie CARA data, en kan een nauwkeurigere CFU tellingen, de grootte van de correctie in het algemeen evenredig is met de potentie van de verbinding 21,22.

figure-results-1
Figuur 1: De CARA is een voorspellend instrument in drug discovery. Deze grafiek vat de bruikbaarheid van de CARA alstussenstap tussen drug discovery (single point screening, cherry-picking, en de dosis-respons assays) en tijdrovende hit-to-lead assays (CFU assays en target identificatie). [Aangepast met toestemming van Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Schema van de bouillon MIC 90 assay en CARA met verwachte resultaten. Zowel MIC 90 en CARA resultaten worden gepresenteerd voor 8 mogelijke activiteiten. De kleurcodering voor MIC 90 microtiterplaat wells is wit (geen groei) en bruin (groei), en voor het CARA microplaten is zwart (geen fluorescentie) en roze (resorufine fluorescentie). Gegevens zijn hypothetisch. [Aangepast met toestemming van Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Gespecialiseerde CARA termen en definities. De minimale bactericide concentratie van een molecuul leidt tot achtergrondniveaus van CARA fluorescentie het CARA-MBC ≥99 (a). Onder omstandigheden repliceren, een ≥4-voudige verschuiving van de CARA-MBC ≥99 rechts van de MIC 90 geeft vaak bacteriostatische werking en een "vast venster" (b) genoemd. Voor moleculen met een sterke post-antibiotisch effect kan statisch ramen moeilijk te observeren (c) en vereisenuitbreiding van de Y-as (CARA fluorescentie) te visualiseren (d). Gegevens zijn hypothetisch. [Aangepast met toestemming van Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Illustratieve MIC 90 en CARA resultaten voor geselecteerde verbindingen. Gegevens voor MIC 90 (rood) en CARA (blauw) worden aangetoond voor (a) isoniazide (INH), (b) linezolid, (c) oxyfenbutazon, en (d) PA-824. Wildtype M. tuberculosis H37Rv werd blootgesteld aan verbindingen voor 7 dagen onder standaard omstandigheden replicerende of meervoudige stress-model van niet-replicatie 7-9. MIC 90 assays en CARA werden uitgevoerd zoals getoond in figuur 2. [Aangepast met toestemming van Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: dosis- en tijdsafhankelijke activiteit van rifampicine. De niet-pathogene, snelgroeiende M. smegmatis werd blootgesteld aan toenemende concentraties rifampicine repliceren onder omstandigheden en hoeveelheden werden bemonsterd voor CARA 1 (a), 3 (b), 6 (c) en 24 (d) hr. [Aangepast met toestemming van Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7].com / files / ftp_upload / 54690 / 54690fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Tabel 1: Samenvatting van de verwachte resultaten in figuur 2. [Aangepast met toestemming van Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het CARA werd oorspronkelijk ontwikkeld om een knelpunt in vordert niet-replicerende of dual-actieve moleculen 7 te verlichten. De CARA dient als tussenstap tussen concentratie-respons Bevestiging van primaire screening hits en CFU assays (figuur 1). Aangezien een enkele CARA plaat tal van microtiterplaten nodig om seriële verdunningen te bereiden en-agar dat Petri platen gebruikt om overlevende bacteriën te sommen kan vervangen, de CARA biedt een eenvoudig middel om de activiteit van een molecuul snel te beoordelen en te testen meerdere variabelen in een keer, met inbegrip van samengestelde concentratie en de tijd van blootstelling aan de verbinding.

In CFU assay, naast seriële verdunningen die vaak bereik tot 10 6-voudige, de agarplaat verdunt typisch moleculen met een extra ~ 800-voudig (10 ui op 8 ml in een tri-stijl Petri plaat). Onze twee-fase, multi-stress-screening test voor verbindingen die actief zijn op non-replicating M. tuberculosis een overdracht factor 5-voudig, dat wil zeggen een verbinding in de niet-replicerende fase van de bepaling die bij een vijfde van de oorspronkelijke concentratie in de uitgroei (replicerend) fase van de test is 6-9. De CARA matigt carry-over-effecten door sekwestreren kleine moleculen met actieve kool. De meeste tuberculosedrugs en klinische kandidaten binden snel en volledig actieve kool, met uitzondering van de aminoglycoside streptomycine 7. Opneming van geactiveerde koolstof in agar platen voor CFU assays voorkomen bacteriële groeiremming of bacteriën doden door overgedragen TMC207 en PA-824 7,21,22. Dus op grond van het opnemen van actieve kool in de bacteriologische agar, het CARA niet afhankelijk van seriële verdunningen van cellen en testmiddel.

De CARA kan helpen bacteriostatische of bacteriedodende effect van het repliceren van actieven en bacteriedodende effect van niet-actieven repliceren voorspellen. in glgemene, het CARA wordt gebruikt in parallel met standaard MIC 90 assays. De voorspellende kracht van het CARA komt van vergelijking van MIC 90 en CARA resultaten (Figuur 2 en Tabel 1). Bij gebruik van anti-mycobacteriële middelen te bestuderen, kan de CARA voorspellen activiteit die repliceert bactericide (figuur 4a), repliceren bacteriostatisch (figuur 4b), niet-replicerende bactericide (Figuur 4c) of dubbele actieve (figuur 4d). De CARA maakt ook eenvoudige evaluatie van de activiteit van een verbinding in zowel de dosis en tijd. CFU assays alleen vereist veel inspanning en materiaal om de activiteit van een verbinding over een groot bereik van doseringen en tijden evalueren, maar de taak wordt beheersbaar wanneer CARA verfijnen het traject van omstandigheden die waarin de verbinding aantoonbaar actief (Figuur 5 ).

Terwijl het CARA heeft bruikbaarheid bij het bestuderen van de werking van eennti-infectiva op mycobacteriën, de test heeft beperkingen. De CARA heeft een smal dynamisch bereik (2-3 log 10) en mogen niet geschikt zijn voor de omstandigheden waarin men anticipeert er mag niet meer dan 2 tot 3 log 10 bacteriële doden zijn. CARA voorspellingen verder bestudeerd met een strengere en nauwkeurige methode voor bacteriële aantallen, zoals CFU assay sommen. De post-antibiotische effect van sommige anti-infectiva, zoals PAS, kan het CARA verwarren als een voorspellend instrument om onderscheid te maken tussen verbindingen met bacteriedodende en bacteriostatische activiteit tegen het repliceren van M. tuberculosis 7.

Er zijn twee aanbevelingen om de kwaliteit van de CARA verbeteren. Ten eerste moet men CARA pour microplaten snel voordat de agar stolt, met behoud volumetrische nauwkeurigheid en het vermijden van spatten buiten microputjes. Ongeacht het aantal platen nodig is, raden wij aan het maken van 0,5 tot 1 L batches van medium te helpen handhaven van de medium in vloeibare vorm voor de duur van de tijd die nodig is om platen gieten. Het veranderen van tips vaak tijdens het vullen van microplaten met medium vermijdt het gebruik van gedeeltelijk verstopt tips. Ten tweede moet men artifactual variatie in fluorescentie tussen herhalingen minimaliseren. Mycobacteriële microkolonies, met name pathogène mycobacteriën zoals M. tuberculosis, vaak onregelmatig groeien. Bijvoorbeeld kan microkolonies groeien op het agar oppervlak variëren in grootte, vorm, lengte, of kunnen zich uitstrekken tot de inwendige wanden van putjes microplaat. Een uitdaging is om alle bacillen gelijkmatig te bedekken met de ontwikkelingslanden reagens. Andere hindernis is dat na verlengde incubatie bij 37 ° C, het vaste bacteriologische medium van de CARA microplaten kan droog en gevoelig voor het absorberen van de ontwikkelende reagens wordt. Omdat actieve kool kan binden resazurin en doven fluorescentie 7, kan er well-to-well variatie te wijten zijn aan droge putten opvangen van de resazurin ontwikkelen oplossing en de geactiveerde Charcoal blussen resazurin fluorescentie. Vooraf bevochtigen van het oppervlak van CARA microplaat putjes met PBS onmiddellijk vóór het toevoegen van de ontwikkelende reagens vermindert beide problemen - de ontwikkeling van reagens alle mycobacteriële kolonies even bereiken en de resazurine blijft veilig boven de actieve kool. Het CARA kunnen aanvragen bij het identificeren en karakteriseren van fenotypes van mycobacteriële mutanten, of in medium-throughput drug discovery assays voor andere bacteriële soorten hebben.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn dankbaar voor Kristin Burns-Huang voor expert review van het manuscript en J. David Warren (Weill Cornell Medical College) voor scheikunde hulp bij de ontwikkeling van het CARA. Dit werk werd ondersteund door de TB Drug Accelerator-programma van de Bill en Melinda Gates Foundation, de Abby en Howard P. Milstein Program in Translational Medicine, en een NIH TB Research Unit (U19 AI111143). Het Departement Microbiologie en Immunologie wordt ondersteund door de William Randolph Hearst Foundation. SSK werd ondersteund door NIH-subsidie ​​K08AI108799.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Middlebrook 7H9Beckton Dickinson271310
Middlebrook 7H11Beckton Dickinson298810
Middlebrook OADCBeckton Dickinson212351
BSA, heat shockRoche3118958001
geactiveerde koolSigmaC5510
PBS, Dulbecco's Ca2+ en Mg2+ vrijLife Technologies / Invitrogen14190-144
tween 80SigmaP8074
tyloxapolSigmaT8761
natriumnitrietSigma2252
rifampicineSigmaR3501
6-bromo-1H-indazol-3-amineAlfa AesarH34095
kaliumfosfaat monobasic  SigmaP0662
magnesiumsulfaat, heptahydraat SigmaM1880
ferric ammoniumcitraat SigmaF5879
zinksulfaat, heptahydraatSigmaZ0251
ammoniumchloride SigmaA9434
boterzuur, vloeibaarSigmaB103500
resazurin poederSigmaR7017
natriumchloride J.T. Baker4058-01 
bereid resazurin oplossing InvitrogenDAL1100
PCR stickersDenvilleB1212-5
spectrofotometerMolecular DevicesM5
96-well, tissue culture treated microplatesCorning3595
reagent reservoirsVWR 89094-678
hersluitbare plastic zakkenVWR 395-94602
14 ml Polypropyleen buisjes met ronde bodemCorning 352059
50 ml conische centrifugeerbuisCorning352070
75 cm2 Celcultuur flesCorning431464U
heldere, platte bodem tissue culture treated 96-well microplateCostar3595
Prism 6 voor OS XGraphPadhttp://www.graphpad.com/scientific-software/prism/

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nathan, C. Fresh approaches to anti-infective therapies. Sci. Transl. Medicine. 4 (140), 140-142 (2012).
  2. Gomez, J. E., McKinney, J. D. M. tuberculosis persistence, latency, and drug tolerance. Tuberculosis (Edinb). 84, 29-44 (2004).
  3. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
  4. Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. Lancet. , 497-500 (1944).
  5. Bryk, R., et al. Selective killing of nonreplicating mycobacteria. Cell Host Microbe. 3, 137-145 (2008).
  6. Gold, B., et al. Nonsteroidal anti-inflammatory drug sensitizes Mycobacterium tuberculosis to endogenous and exogenous antimicrobials. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 16004-16011 (2012).
  7. Gold, B., et al. Rapid, semi-quantitative assay to discriminate among compounds with activity against replicating or non-replicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 59, 6521-6538 (2015).
  8. Gold, B., Warrier, T., Nathan, C. Mycobacteria Protocols, Methods in Molecular Biology. Parish, T., Roberts, D. 1285, Springer. 293-315 (2015).
  9. Warrier, T., et al. Identification of Novel Anti-mycobacterial Compounds by Screening a Pharmaceutical Small-Molecule Library against Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Infect. Dis. , 580-585 (2015).
  10. Zheng, P., et al. Synthetic Calanolides with Bactericidal Activity Against Replicating and Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Chem. Chem, J. .M. ed. , (2014).
  11. Darby, C. M., et al. Whole cell screen for inhibitors of pH homeostasis in Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 8, e68942(2013).
  12. Darby, C. M., Nathan, C. F. Killing of non-replicating Mycobacterium tuberculosis by 8-hydroxyquinoline. J. Antimicrob. Chemother. 65, 1424-1427 (2010).
  13. de Carvalho, L. P., Darby, C. M., Rhee, K., Nathan, C. Nitazoxanide Disrupts Membrane Potential and Intrabacterial pH Homeostasis of Mycobacterium tuberculosis. ACS Med. Chem. Lett. 2, 849-854 (2011).
  14. Xie, Z., Siddiqi, N., Rubin, E. J. Differential antibiotic susceptibilities of starved Mycobacterium tuberculosis isolates. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4778-4780 (2005).
  15. Grant, S. S., et al. Identification of novel inhibitors of nonreplicating Mycobacterium tuberculosis using a carbon starvation model. ACS Chem. Biol. 8, 2224-2234 (2013).
  16. Zhang, M., et al. Streptomycin-starved Mycobacterium tuberculosis 18b, a drug discovery tool for latent tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 56, 5782-5789 (2012).
  17. Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem. Biol. 7, 1190-1197 (2012).
  18. Cho, S. H., et al. Low-oxygen-recovery assay for high-throughput screening of compounds against nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 51, 1380-1385 (2007).
  19. Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 92, 453-488 (2012).
  20. Rebollo-Lopez, M. J., et al. Release of 50 new, drug-like compounds and their computational target predictions for open source anti-tubercular drug discovery. PLoS One. 10, e0142293(2015).
  21. Tasneen, R., et al. Contribution of the nitroimidazoles PA-824 and TBA-354 to the activity of novel regimens in murine models of tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 59, 129-135 (2015).
  22. Grosset, J. H., et al. Assessment of clofazimine activity in a second-line regimen for tuberculosis in mice. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 188, 608-612 (2013).
  23. Shiloh, M. U., Ruan, J., Nathan, C. Evaluation of bacterial survival and phagocyte function with a fluorescence-based microplate assay. Infect. Immun. 65, 3193-3198 (1997).
  24. Wang, F., et al. Identification of a small molecule with activity against drug-resistant and persistent tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E2510-E2517 (2013).
  25. Wayne, L. G., Hayes, L. G. An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence. Infect. Immun. 64, 2062-2069 (1996).
  26. Barry, A. L., et al. Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents: approved guideline. 19, National Committee for Clinical Laboratory Standards. (1999).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Enumeratie van mycobacteri nsemi kwantitatieve beoordelingscreening met gemiddelde doorvoersnelheidgeactiveerd houtskoolagarresazurine reductiefluorometrische uitlezingMBC groter dan 99replicerende niet replicerendeCFU surrogaatmethode

Gerelateerde artikelen