Open Tracheostomie Maagzuur Aspiration muizenmodel van Acute Lung Injury Resultaten in Maximal Acute Lung Injury nonlethal

Samenvatting

Dit protocol induceert acute longschade bij een muis met een hoge nauwkeurigheid die vergelijkbaar is met de pathogenese van acide pneumonitis die bij mensen wordt waargenomen. We genereren een maximale acute niet-dodelijke lage pH-longschade en houden rekening met verschillen in de anatomische ademhalingsstructuur van knaagdieren-mensen door middel van een open tracheale opening gekoppeld aan circumferentiële drukontlasting.

Samenvatting

Pneumonitis zuur is een belangrijke oorzaak van steriele acute longbeschadiging (ALI) bij mensen. Acid longontsteking overspant de klinische spectrum van asymptomatische tot acute respiratory distress syndrome (ARDS), gekenmerkt door neutrofiele alveolitis, en schade voor zowel alveolaire epitheel en vasculaire endotheel. Klinisch, ARDS wordt bepaald door acute hypoxemie, bilaterale fragmentarisch longinfiltraten en non-cardiogene longoedeem. Menselijke studies hebben ons waardevolle informatie over de fysiologische en ontstekingsreactie in de longen veroorzaakt door ARDS, wat heeft geleid tot diverse hypotheses over de ondergeschikte mechanismen. Helaas, moeilijkheden bepalen van de oorzaak van ARDS, evenals een groot aantal pathofysiologie hebben geleid tot een gebrek aan kritische informatie die bij de ontwikkeling van therapeutische strategieën zouden zijn.

Translationele diermodellen zijn waardevol als hun pathogenese en pathofysiologie nauwkeurig voortplanea begrip bewezen in zowel in vitro en klinische settings. Hoewel grote diermodellen (bijvoorbeeld schapen) kenmerken aandeel van de anatomie van de menselijke luchtpijp-bronchiale boom, muizen modellen bieden tal van andere voordelen, waaronder: lage kosten; korte voortplantingscyclus lenen zich tot een grotere data-acquisitie; een goed begrepen immunologische systeem; en een goed gekarakteriseerd genoom leidt tot de beschikbaarheid van een verscheidenheid van gendeletie en transgene stammen. Een robuuste uitvoering van lage pH geïnduceerde ARDS is een murine ALI dat hoofdzakelijk alveolaire epitheel, secundair het vasculair endothelium, en de kleine luchtwegen die naar de alveoli doelen. Bovendien is een reproduceerbare letsel met grote verschillen tussen de verschillende schadelijke en niet-schadelijke beledigingen belangrijk is.

De muizen maagzuur aspiratie hier gepresenteerde model met zoutzuur maakt gebruik van een open tracheotomie en reconstrueert een pathogene scenario dat de lage pH pneumon reproduceertitis letsel bij mensen. Bovendien kan dit model worden gebruikt om de interactie van een lage pH belediging met andere pulmonale schadelijke entiteiten (bv, etensresten, pathogene bacteriën) te onderzoeken.

Inleiding

ARDS wordt gekenmerkt door wijdverbreide longontsteking en klinisch gezien als acute kortademigheid bij hypoxemie. Deze symptomen komen vaak minder dan 24 uur na een opzwepend gebeurtenis, zoals trauma, sepsis, bloedtransfusie gerelateerde reacties of aspiratie. Het wordt histopathologisch gekenmerkt door neutrofiele alveolitis (dwz wijdverspreide ontstekingen) gelokaliseerd alvéolaire epitheel en vasculaire endotheel leidt tot eiwitlekkage vervolgens hyaline membraanvorming. Aspiratie is gecategoriseerd als chemische longontsteking of aspiratiepneumonie. ¹ De zure component van de maag aspiratie bijdraagt aan zowel het pneumonitis voorkeur een secundaire bacteriële longontsteking. Aspiratiepneumonie is een van de belangrijkste risicofactoren voor ALI en de verdere ontwikkeling van ARDS. ²

Maag-aspiratie is een acute gebeurtenis gedefinieerd als het inhaleren van materialen uit thij maag met of zonder orofaryngeale flora in de luchtwegen voorbij de stembanden. De inhoud aspireren kan een lage pH maag vocht, bacteriën, bloed of etensresten bevatten. Maag-aspiratie komt vaak voor bij patiënten op de Intensive Care Unit (ICU), die zijn meestal in een nuchtere toestand en dus geplaatst op een protonpompremmer om aspiratie van verzuurde maaginhoud te beperken. De incidentie van ALI in de ICU bevolking in de VS is 2,5-5 keer hoger in vergelijking met de algemene patiëntenpopulatie. ³ Helaas zijn deze predisponerende aandoeningen vaak leiden tot een toestand van bacteriële overgroei in de maag die kunnen leiden tot ernstige gevolgen in de longen na aspiratie evenement, maag streven is een onafhankelijke risicofactor voor de ontwikkeling van secundaire bacteriële longontsteking (SBP) , ALI en ARDS.

Maag aspiratie heeft twee hoofdcomponenten: zoutzuur en maaginhoud, al dan niet bacteriën bevattenof voedsel deeltjes. In het knaagdiermodel de zure component alleen van maag aspiratie levert een aanvankelijke ontstekingsreactie ten gevolge van de directe bijtende schade van lage pH op luchtwegepitheel. Dit wordt gevolgd door een neutrofiele infiltratie en een ontstekingsreactie bij 4-6 uur. ⁴ Deze twee factoren uiteindelijk leiden tot de vernietiging van pulmonale microvasculaire integriteit hetgeen leidt tot extravasatie van vocht en eiwitten in alveoli en luchtwegen. Dit pathofysiologie begrijpen en verder te onderzoeken mogelijke therapeutische ingrepen, is het belangrijk om te ontwikkelen en te karakteriseren een diermodel dat de onderliggende mechanismen belicht. Een zure aspireren mag alleen omvangrijke of met een voldoende lage pH om de buffercapaciteit van de respiratoire boom omzeilen en bereiken de alveoli zijn. Als dit niet gebeurt, slechts een voorbijgaande bovenste, geleidende luchtwegen schade optreedt die minder waarschijnlijk leiden tot ernstige gevolgen van ARDS. ^{5 <}/ Sup>

De aspiratie gebeurtenis nauwkeurig met verwonde alvéolaire epitheel bootsen, is het belangrijk om de natuurlijke afweer van het dier te omzeilen. Een muis model streven een ALI dat het maagzuur letsel bij mensen nabootst produceren, moet men rekening houden met de verschillen in de luchtpijp-bronchiale boom. De open tracheostomie techniek die deze werkwijze gebruikt omzeilt de verschillen tussen muizen en humane respiratoire bomen en modellen de schade op een wijze die ALI reproduceert zowel fysiologisch en histologisch. Historisch gezien werd intratracheale intubatie gebruikt ALI genereren, maar het is moeilijk geacht presteren in muizen zonder larynx letsel. Daarom is deze methode biedt een mogelijk alternatief dat consistente resultaten over meerdere onderzoekers met minimale procedure toegeschreven sterfte opgeleverd.

Protocol

Alle materialen en apparatuur moeten worden verzameld en adequaat georganiseerd voorafgaand aan de procedure. De procedure zal worden uitgevoerd met naadloze overgangen van de ene stap naar de volgende met het oog op consistente, reproduceerbare gegevens te verstrekken. Dit protocol volgt institutioneel beleid door de Institutional Animal Care en gebruik Comite ingesteld bij de Buffalo Veterans Affairs Medical Center.
OPMERKING: Zowel mannelijke als vrouwelijke C57BL / 6 muizen werden gebruikt voor dit protocol. Er is geen significant verschil in albumine lekkage tussen de geslachten.

1. Zoutzuur Voorbereiding

1. Maak 56,2 mM HCl _steriel door het toevoegen van 281 pi van 1 N HCl tot 4,72 ml steriele normale zoutoplossing (SNS). Titreren tot pH 1,25 met 1 N HCl (≈ 0-50 pi).
2. Maak deze verse bereiding voorafgaand aan het letsel. Al vanaf pH SNS is niet gebufferd zorgt zij voor de zoutzuur blessure belediging is van voorbijgaande aard.

2. Anesthesie en Tracheal Exposure Techniek

NOTITIE:Zorg ervoor dat de procedure schade wordt uitgevoerd in een zuurkast met houtskool filtering voor verdoving gas opruiming. Handhaven van steriele omstandigheden essentieel aangezien dit een survival operatie. Gebruik steriele handschoenen en steriliseren van alle instrumenten in een glazen kraal chirurgisch instrument sterilisator voorafgaand aan de operatie op elk dier. Het gebruik van gordijnen op de chirurgische lokatie isoleren wordt aanbevolen om steriliteit te handhaven. Gebruik isofluraan als verdovingsmiddel gas als het een relatief lage oplosbaarheid bloedgas waarbij snelle inductie van anesthesie, en snel herstel na letsel.

1. Begin door het induceren van anesthesie in een kamer met 2,75% isofluraan in zuurstof met een debiet van 2 l / min.
2. Zodra de muis op adequate wijze wordt verdoofd (reageert tot teen knijpen sterk genoeg zijn om niet breken de huid of veroorzaken diep weefselschade), op te schorten met de muis door de superieure snijtanden met een 15 cm lengte van 1-0 gevlochten zijden hechtdraad in een liggende positie op een 60 ^o helling dissectie board.
3. Zorg ervoor dat de verdoving wordt de hele operatie wordt beheerd door het leveren van isofluraan via een neuskegel. Toepassen veterinaire zalf op het oog muis tot droog voorkomen.
4. Scheer het ventrale deel van de hals met een elektrische trimmer en toepassen actueel antiseptische oplossing (dat wil zeggen, povidonjood). Verwijder overtollig antiseptische met gaas en laten drogen (~ 15-30 s).
5. Infiltreren de middellijn van de nek van het borstbeen inkeping aan inferieure deel van de kaak met 100 ul 0,5% bupivacaïne (pre-, peri- en post-operatieve analgesie).
6. Wordt 1-1,5 cm longitudinale middellijn incisie in de nek met een scalpel of gebogen fijne schaar. Doordringen fascial membraan tussen de speekselklieren door stompe dissectie met 2 gebogen getande tang om de trachea (aangeduid door de witte kraakbeenringen) bloot.
7. Nog steeds met behulp van de 2 gekartelde tang, pakt de ene kant van de paratracheale spieren en trek hem naar de kant terwijl het ontleden van tussen de muskel vezels in lengterichting naast de luchtpijp.
8. Zodra dissectie vliegtuig opgesteld, verder terugtrekken van de paratracheale spier tweede pincet wordt gewerkt onder de luchtpijp. Gebruik deze tang om een ​​15 cm streng van 1-0 gevlochten zijden hechtdraad te plaatsen in de punt van de tang en trekken door de hechtdraad achter de luchtpijp plaatst.

3. Intra-tracheale Blaasinstillatie Procedure

1. Bereid de schade instillatie injectiespuit vult een 0,5 ml spuit verbonden met een 22 G naald met 0,2 ml lucht, gevolgd door 3,6 ml / kg zoutzuur. De lucht treedt om te helpen bij dispersie van het voertuig, evenals een alveolaire rekrutering manoeuvre voor die alveoli die atelectase hebben ondergaan tijdens anesthesie toediening.
   OPMERKING: Volg de plaatselijke IACUC richtlijnen met betrekking tot post-operatieve analgesie en overleggen met uw lokale dierenarts. Wees voorzichtig met het gebruik van een pijnstillers met anti-inflammatoire eigenschappen voor diensting dit model van de steriele longschade.
2. Om de schade te beheren, de eerste stop isofluraan administratie. Sta anesthesie diepte muis rijzen ongeveer 10 - 15 s tot het begint te reageren op een forceps teen knijpen.
3. Onmiddellijk beginnen instillatie stappen van de schade. Als narcose diepte te diep het dier niet spontaan ademen na verwonding instillatie, wat vooral voor zoutzuur bevattende verwondingen.
4. Laat een helper knijp de ribbenkast aan vitale capaciteit te verdrijven.
5. Gebruik de 1-0 gevlochten zijden hechtdraad eerder geplaatst rond de luchtpijp om tractie te leveren door hem superiorly te trekken en steek naald in de luchtpijp tussen de 1 ^e en 2 ^e kraakbeen ringen onder het strottenhoofd. De naald bevel moet de chirurg en vooraf geconfronteerd totdat de schuine kant is net voorbij de luchtpijp met de naald als parallel met de luchtpijp mogelijk.
6. Laat de borst net voor bolus toediening vanzoutzuur om verspreiding en depositie verzekeren in de distale luchtwegen en alveoli. Stort de bolus in ongeveer 0,5-0,75 s. Houd de naald in de trachea tot de eerste spontane ademhaling wordt gezorgd dat de totale schade bolusvolume via inhalatie in de longen.
7. Sluiten incisie met behulp van 1-2 huid nietjes of hechtingen.

4. Recovery

1. Met behulp van een 5 ml spuit met een 26 G naald, injecteer 1 ml SNS subcutaan in scruff van de nek voor vochttoediening. Hoewel er een minimaal verlies vocht tijdens de procedure, na de operatie de muis heeft de neiging om niet te drinken en kan mogelijk uitdrogen. Als alternatief bieden SNS via een intraperitoneale injectie.
2. Plaats muis verhitte kamer bij 37 ° C geperfuseerd met 100% _O2. Zorg ervoor dat de muis op adequate wijze wordt teruggewonnen voordat ze terug in de behuizing geplaatst. Monitor dieren en niet onbeheerd achter te laten in deze tijd tot ambulante en volledig recovered.

5. bronchoalveolaire lavage en Lung Processing

1. Induceren en handhaven isofluraananesthesie zoals beschreven in stap 2.1 en Stap 2.2. Bevestig adequate vlak van anesthesie gebruikt teen knijpen methode in stap 2.2 beschreven.
2. Secure in een liggende positie op een dissectie board en gebruik een lus van 1-0 gevlochten zijden hechtdraad gehaakt de superieure snijtanden aan de nek uit te breiden. Solliciteer veterinaire zalf op de ogen om uitdroging te voorkomen.
3. Na het verwijderen van het nekvel nietjes, maak een middellijn longitudinale incisie door de huid van de onderste buikwand door de vorige nek incisie aan de onderkaak met een schaar.
4. Maak een middellijn incisie in de peritoneale musculatuur met een schaar en trek de buikorganen met sponzen naar de retroperitoneale ruimte bloot te leggen. Als bloed nodig, verzamelen van de abdominale aorta en inferior vena cava op dit punt.
5. Euthanaseren het dier via verbloeding door doorsnijden de abdomrechtelijke aorta en inferior vena cava. Met behulp van een bilaterale thoracotomie in de volgende stap een tweede bevestigingsmethode euthanasie worden menselijk voltooid zoals door IACUC richtlijnen.
6. Perforeren membraan longcollaps veroorzaken. Vervolgens met behulp van bot snijden schaar wegsnijden het membraan en doorsnijden de ribbenkast parallel aan en aan weerszijden van het borstbeen. Gebruik een vergrendelende hemostaat de sternale flap trekken vergemakkelijking injecteren van 5 ml warme (37 ° C) Hanks gebalanceerde zoutoplossing met calcium en magnesium in het rechter ventrikel aan de long vasculatuur spoelen.
   1. Terwijl het bloed uit de aorta wordt verkregen perifere cytokine niveaus vóór de in dit document beschreven methoden te beoordelen, een kleine incisie in de linker ventrikel noodzakelijk uitstroom voor bloed naar de bloedsomloop de longen vaatstelsel reactie voldoende spoelen zo niet verkregen bloed .
7. Prop de dissectie bord om een ​​60 ° helling en gebruik the procedure beschreven in stap 2.2 om te vergemakkelijken het inbrengen van een 20 G x ½ "roestvrij staal canule in de luchtpijp en veilig met een 1-0 hechtdraad.
8. Plaats de dissectie board horizontaal en uitvoeren van een bronchoalveolaire lavage (BAL).
   1. Voor het uitvoeren van de BAL hechten twee 5 ml spuiten om een ​​3-weg kraan. Vul een spuit met 5 ml van SNS en schroef in de haven van de kraan. Bevestig een lege 5 ml spuit om een ^2e haven en tenslotte hechten open poort van de kraan naar intra-tracheacanule geplaatst in stap 5.6. Inboezemen 1 ml NS in de longen en spoelen met tweede spuit.
   2. Herhaal dit voor 5 totaal 1 ml NS instillaties voorzichtig dat de tracheacanule blijft beveiligd en parallel aan de luchtpijp, zodat het niet de luchtpijp scheurt.
9. Voor histologische analyse, de trachea canule als in stap 5,7. Bevestig de longen door snuiven met 10% neutraal gebufferde formaline bij 20 cm _H2O gedurende 24 uur.
10. Verwijder elke longkwab Carefully met een schaar en pincet door doorsnijden bronchus in de buurt van de navel. Plaats elke long kwab (5 in totaal) in een histologie cassette voorafgaand aan inbedding in paraffine. Snijd 5 micrometer weefsel secties met een microtoom, en vlekken met hematoxyline en eosine met behulp van standaard histologische technieken. ⁶ Morfologie kan ook worden uitgevoerd op de histologische objectglaasjes ernst ontsteking te kwantificeren. ⁴
11. Verwerk de teruggewonnen BAL door centrifugeren bij 1500 g gedurende 3 min bij 4 ° C. Aliquot de celvrije BAL supernatanten in gelijke hoeveelheden in 2,0 ml microcentrifugebuizen voor toekomstige analyse. Bewaar bij -80 ° C.
12. Analyseer de BAL van albumine concentratie door ELISA of andere biologisch van belang. ¹¹ De gepelleteerde cellen van de BAL kan worden geteld, cytoslide specimens gegenereerd en gekleurd met Wright-Giemsa-beits van witte bloedcellen differentiële telling van de longen te evaluerenontstekingsreactie.

Resultaten

Pulmonale Histopathologie van het muizenmodel van Acid Aspiration Pneumonitis

Muizen werden verwond zoals hierboven beschreven en longen werden verwijderd 24 uur na lage pH insult, doorgesneden en H & E gekleurde (figuur 1). Necrotische cellen, verlies van long parenchymale architectuur, cellen en puin binnen luchtruim en significante PMN-infiltratie zijn duidelijk waargenomen. Soortgelijke klinisch aspiratie...

Discussie

Het doel was een ALI diermodel ontwikkeld middels maagzuur aspiratie die sterk lijkt op de pathofysiologie die optreedt bij mensen tijdens de ontwikkeling van zure pneumonitis en daaropvolgende ARDS. Bij het ontwikkelen van een model, kozen we voor een diersoort die high throughput data-acquisitie biedt als gevolg van de lage kosten, korte voortplantingscyclus, en een goed begrepen immuunsysteem met een overvloed aan onderzoeksinstrumenten (dwz, monoklonale antilichamen, transgene stammen).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
syringe, 1 cc	Becton Dickinson	309628
syringe, 5 cc	Becton Dickinson	309646
needle, 22 G x 1 1/2"	Becton Dickinson	305159
needle, 26 G x 1 1/2"	Becton Dickinson	305111
1-O Braided Silk Suture	Harvard Apparatus	517730
3" Curved tissue serrated forceps	Fine Science Tools	11065-07
3" Curved tissue 'toothed' forceps, 1 x 2 teeth	Fine Science Tools	11067-07
4" curved micro dissecting scissors	Fine Science Tools	14061-10
bone cutting spring scissors	Fine Science Tools	16144-13
3 1/2" curved locking hemostat	Fine Science Tools	13021-12
Disposable Skin Stapler	3M	DS-25
tracheal cannula (20 gauge x 1/2" stainless steal tubing adapter)	Becton Dickinson	408210
60-degree Incline Dissection Board
0.5% Bupivacaine
Isoflurane
Betadine en 'Q-tip' katoenen applicator