Chirurgische occlusie van een distale middelste cerebrale slagader tak (MCAo) is een veel gebruikte model in de experimentele beroerte onderzoek. Dit manuscript beschrijft de basistechniek vaste MCAo, gecombineerd met het inbrengen van een laterale craniale venster, dat de mogelijkheid voor longitudinaal intravitale microscopie bij muizen heeft.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Laterale Chronische Cranial Window Voorbereiding Maakt In Vivo Observatie Na distale midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Focale cerebrale ischemie (dat wil zeggen, ischemische beroerte) kan grote hersenletsel veroorzaken, wat leidt tot een ernstig verlies van neuronale functie en bijgevolg tot een gastheer van motorische en cognitieve beperkingen. De hoge prevalentie vormt een ernstig gezondheidsprobleem last, een beroerte is een van de voornaamste oorzaken van langdurige arbeidsongeschiktheid en overlijden wereldwijd 1. Herstel van neuronale functie is in de meeste gevallen slechts gedeeltelijk. Tot nu toe zijn behandeling opties zeer beperkt, met name vanwege de smalle tijdvenster voor trombolyse 2,3. Het bepalen van methoden om herstel na een beroerte te versnellen blijft een uitstekende medische doel; Echter, dit is belemmerd door onvoldoende mechanistische inzichten in het herstelproces. Experimentele beroerte onderzoekers vaak in dienst knaagdiermodellen van focale cerebrale ischemie. Voorbij de acute fase wordt een beroerte onderzoek steeds meer gericht op de sub-acute en chronische fase na cerebrale ischemie. permanente of tran meest beroerte onderzoekers toe te passensient occlusie van de MCA bij muizen of ratten. Bij patiënten, occlusies van MCA behoren tot de meest voorkomende oorzaken van ischemische beroerte 4. Naast proximale occlusie van de MCA met het filament model, chirurgische occlusie van de MCA distaal is waarschijnlijk het meest gebruikte model experimentele beroerte onderzoek 5. Occlusie van een distale (om de vertakking van de lenticulo-gestreept slagaders) MCA tak spaart typisch het striatum en in de eerste plaats van invloed op de neocortex. Vaartuig occlusie kan permanent of van voorbijgaande aard zijn. Hoge reproduceerbaarheid van laesievolume en zeer lage sterfte ten opzichte van de lange-termijn resultaten zijn de belangrijkste voordelen van dit model. Hier laten we zien hoe je een chronische craniale venster (CW) de voorbereiding lateraal uit te voeren om de sagittale sinus, en daarna hoe ze operatief leiden tot een distale slag onder het venster met behulp van een craniotomie aanpak. Deze aanpak kan worden toegepast voor sequentiële beeldvorming van acute en chronische veranderingen na ischemie viaepi-lichtdoorlatende, confocale laser scanning, en twee-foton intravitale microscopie.
Inleiding
Beroerte behoort tot de belangrijkste oorzaken van langdurige invaliditeit en dood wereldwijd1, en komt daarmee op de tweede plaats na coronaire hartziekten. Bovendien is beroerte de belangrijkste oorzaak van langdurige invaliditeit, wat het enorme sociaaleconomische effect onderstreept6-8. Naast acute behandeling blijft het onderzoeken van nieuwe benaderingen en mechanismen om herstel na een beroerte te versnellen en verbeteren een belangrijk medisch doel7.
In de afgelopen decennia heeft gegevens uit experimenteel beroerteonderzoek aanzienlijk bijgedragen aan het begrijpen van de complexe pathofysiologische cascades die worden veroorzaakt door ischemie9,10. Excitotoxiciteit, apoptose, peri-infarct depolarisatie en ontsteking zijn geïdentificeerd als de meest relevante bemiddelaars van celdood na focale cerebrale ischemie. Bovendien zijn, met behulp van diermodellen van cerebrale ischemie, belangrijke concepten, diagnostische modaliteiten en therapeutische benaderingen ontwikkeld en gevalideerd (bijv. "penumbra" en trombolyse)11.
De beschikbaarheid van experimentele beroertemodellen, gecombineerd met niet-invasieve beeldvormingsmodaliteiten (bijv. magnetische resonantie beeldvorming (MRI), computertomografie of laser speckle contrastanalyse), stelt de onderzoeker in staat om hyperacute en chronische pathofysiologische veranderingen geïnduceerd door de ischemische aanval op een longitudinale manier te onderzoeken12. Naast het bestuderen van het ruimte-tijdprofiel van de zich ontwikkelende laesie, kunnen veranderingen die lijken op neuronale plasticiteit worden onderzocht en gecorreleerd aan functionele uitkomsten en histologische bevindingen. In de afgelopen jaren zijn verdere methodologische vooruitgang geboekt door de combinatie van cerebrale ischemiemodellen en in vivo microscopie via craniale vensters13. Deze nieuwe technieken stellen onderzoekers in staat om de neurovasculaire eenheid te analyseren op cellulair en moleculair niveau, met grote analytische kracht in de acute, subacute en chronische fasen na focale cerebrale ischemie14. Bovendien heeft in vivo microscopiebeeldvorming van microcirculatoire dynamica nieuwe aspecten van de functie en angioarchitectuur van de cerebrale microvaten onthuld, met significante pathofysiologische relevantie15-17.
In dit protocol presenteren we hoe een chronische CW-voorbereiding lateraal aan de sagittale sinus kan worden uitgevoerd en hoe een distale beroerte chirurgisch kan worden geïnduceerd onder het venster. Dit muismodel kan worden toegepast op sequentiële beeldvorming van acute, subacute en chronische veranderingen na focale cerebrale ischemie via epi-verlichting, confocale laserscanning en tweefoton intravitale microscopie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
ETHIEK STATEMENT: experimenten met proefdieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de uiteengezet door Landesamt fuer Gesundheit und Soziales, Berlijn, Duitsland (G0298 / 13) en de BEREIKT criteria richtlijnen en voorschriften, voor zover van toepassing. Voor dit onderzoek, 10- tot 12-weken oude mannelijke C57BL / 6J muizen werden gebruikt.
1. Laterale Chronische Cranial Window Voorbereiding
- Voer anesthesie met een subcutane injectie van ketamine (90 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg). Test voor adequate sedatie met een pijnprikkel.
- Steriliseer de chirurgische instrumenten en chirurgisch veld met 70% ethanol.
- Verwijder het hoofdhaar van de hals om de ogen met behulp van een knaagdier scheerapparaat.
- Bevestig het hoofd in een stereotactische frame.
- Gebruik dexpanthenol oogzalf op beide ogen om uitdroging te voorkomen.
- Maak de chirurgische gebied om alle haren te verwijderen en steriliseer het met 3 lagen van 74,1% ethanol en 10% 2-propranolol.
- Voer een middellijninsnijding van de nek naar de ogen met behulp van een scalpel.
- Overspannen de huid flap met 4 tenting hechtingen.
- Verwijder het periosteum voorzichtig op de linker hersenhelft door te schrapen met een scalpel om het punt waar de temporale spier begint.
Opmerking: Dit preparaat dient ook om een goede hechting gebied voor de tandheelkundige lijm, die dekglas lost maken. - Voer een fronto-pariëtale craniotomie met een diameter van 4 mm door verdunnen van de schedel op de rand van het bot flap met een microboor. Solliciteer zoutoplossing tijdens het boren om warmte letsel te voorkomen.
- Verhoog het bot flap met canules en verwijder hem met behulp van microforceps.
- Irrigeren zorgvuldig en uitgebreid met een zoutoplossing.
- Meng de tandheelkundige lijm tot het de juiste consistentie en is geen vloeistof (dat wil zeggen, de lijm mag niet produceren discussies meer). Plaats het op het bot rond de craniotomie.
- Leg een deksel glas met een 6-mm diameter op het voorbereide lijm en zet deze vast met the rest van de tandheelkundige lijm. Wees er zeker van dat het waterdicht is. Wacht tot de lijm wordt gedroogd en hard door deze te testen met een pincet.
LET OP: Een extra irrigatie versnelt het uitharden. - Verwijder de tenting hechtingen en sluit de wond met de huid hechtingen.
- Trek de huid van de flank van de muis. Plaats een naald onderhuids en voorzichtig te vervangen door 0,5 ml steriele zoutoplossing subcutaan voor de vochtbalans.
- Na de operatie, houdt de dieren in de verwarmde herstelkooi voor 90 min. Wacht tot de dieren zijn helemaal wakker voor het verlaten van hen onbeheerd achter. Wacht tot de dieren volledig worden teruggewonnen voordat ze een kooi met andere dieren terugkeren.
- Herhaal subcutaan zoutoplossing volumesubstitutie na ongeveer 12 uur, zoals beschreven in stap 1.16.
- Gelden altijd analgesie via sondevoeding of direct in de mondholte na de operatie (bijvoorbeeld paracetamol (10 mg / ml) of andere niet-steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddelen).
- Controleer de van de dieren elke dag na de operatie, en altijd fijngestampt dierlijk voedsel op de vloer in een petrischaal te eten eenvoudig maken en kritische gewichtsverlies na chirurgie te voorkomen.
OPMERKING: Intravitale microscopie kan worden uitgevoerd op de eerste dag na craniale venster bereiding. - Solliciteer isofluraananesthesie en zet het dier in een kop houder. Open de huid hechtdraad en reinig het raam met wattenstaafjes en steriele zoutoplossing. Na 24 uur moet de schedelholte weer worden gevuld met cerebrospinale vloeistof door dat tijdstip, waarop beeldvorming mogelijk maakt. Voer beeldvorming met behulp van gevestigde microscopie protocollen 18.
2. Distale MCAo
LET OP: De MCAo procedure moet worden uitgevoerd ongeveer 5 d na CW voorbereiding. Dit minimaliseert interferentie van de immune reactie veroorzaakt door het preparaat CW de slag geïnduceerde immuunreactie.
"Src =" / files / ftp_upload / 54701 / 54701fig1.jpg "/>
Figuur 1. Overzicht van de distale MCAo. A. Dit is een mooi overzicht van de schepen voor de op. B. De schepen na de eerste bipolaire contact. C. De schepen na de tweede bipolaire contact. D. Het overzicht van de schepen, die nu volledig gesloten zijn. E. Final overzicht met lagere vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Verdoven de muizen met behulp van een verdoving masker en een passende verdoving regime, in overleg met het diergeneeskundig personeel (bijvoorbeeld inductie met 1,5-2% isofluraan en onderhoud met 1,0-1,5% isofluraan in 2/3 N 2 O en O 2 1/3 via een verdamper).
- Scheer en verwijder het haar en desinfecteren van de huid en de omliggende bont met een geschikt middel (bijvoorbeeld, 70% ethyl alcohol), en droog hem daarna.
- Handhaaf de lichaamstemperatuur van de muizen bij 36,5 ° C ± 0,5 ° C tijdens de operatie. Een feedback geregelde verwarming pad, op basis van de rectale temperatuur van de muis verhit, wordt sterk aanbevolen.
- Plaats het dier in de laterale positie. Bevestig de neus in de anesthesie masker en stel de isofluraan concentratie 1,0-1,5%.
- Solliciteer natte zalf (dexpanthenol) aan beide ogen.
- Gebruik de huid incisie gemaakt voor de bereiding CW.
- Voorzichtig scheiden van de huid en het identificeren van de temporale spier eronder.
- Stel de energie van de hoogfrequente generator (5-7 W) en gebruik de bipolaire modus.
- Gebruik de electrocoagulatie tang en voorzichtig de temporale spier te verwijderen uit de schedel, het creëren van een spier flap, zonder volledig verwijderen van de spier.
- Identificeer de MCA onder de transparante schedel in de rostrale deel van de temporale gebied, dorsale de retro-orbital sinus. Als de MCA splitsing niet kunnen worden geïdentificeerd, proberen vast te stellen van het schip meest rostrale.
- Dun de schedel boven de MCA tak met een microboor onder voortdurend irrigatie hitte schade te voorkomen.
- Til het bot met canules en verwijderen met microforceps.
- Verminderen de energie van de hoogfrequente generator 3-5 W.
- Benader de slagader van boven en zachtjes aanraken met de bipolaire tang aan beide zijden zonder de opheffing van het schip.
- Coaguleren de slagader proximaal en distaal aan het vat vertakking.
- Wacht 30 sec, en raak dan de slagader voorzichtig om ervoor te zorgen dat de bloedstroom permanent wordt onderbroken. Herhaal de electrocoagulatie als een rekanalisatie waargenomen.
- Bevestig de temporale spier met 1 of 2 steken aan de spier insertie dekking het botdefect, indien mogelijk.
- Hechtdraad de wond en plaats het dier in de verwarmde herstel doos. In het algemeen dieren herstel snel na het vluchtige anesthesia.
- Voor volumesubstitutie Breng 0,5 ml steriele zoutoplossing subcutaan zoals beschreven in stap 1.16.
- Na de operatie, zodat de dieren om te verblijven in de verwarmde herstel kooi voor 90 min. Wacht tot de dieren zijn bewust voor het verlaten van hen onbeheerd achter. Alleen hen terug te keren naar een kooi met andere dieren wanneer ze volledig zijn hersteld.
- Herhaal de volumesubstitutie Zoals in stap 1,16, na 12 uur.
- Toepassen postoperatieve analgesie via het drinkwater (bijvoorbeeld paracetamol (10 mg / ml) of andere niet-steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddelen).
- Controleer de gezondheidstoestand van de dieren elke dag na de operatie. Bieden gepureerd dierlijk voedsel in een petrischaal op de vloer te eten vereenvoudigen en postoperatieve gewichtsverlies minimaliseren.
3. Sham Treatment
- Voer alle procedures identiek aan stappen 1 en 2, zoals hierboven CW-preparaat behalve niet coaguleren blootgestelde cerebralis ar beschreventerij.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De tijdlijn en representatieve resultaten worden getoond in Figuren 2 en 3. De craniale venster preparaat, met een kleine craniaal venster lateraal van de superieure sagittale sinus (figuur 2 B, C, D) resulteert in een zeer lage mortaliteit en morbiditeit wanneer uitgevoerd door ervaren chirurgen. Alle 10 dieren overleefden en alle chronische CW kunnen worden voor hoogwaardige beelden, zelfs 28 dagen na de operatie. Er was geen probleem ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Beroerte is een van de voornaamste oorzaken van langdurige arbeidsongeschiktheid en overlijden wereldwijd 1. Beyond acute behandeling, onderzoek naar nieuwe benaderingen en mechanismen te versnellen en verbeteren van het herstel na een beroerte blijft een uitstekende medische doel 7. Experimentele beroerte onderzoekers vaak in dienst knaagdiermodellen van focale cerebrale ischemie. In feite, modellen induceren van voorbijgaande of permanente MCAo na te bootsen een van de meest voorkomende vormen va...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
VP is een deelnemer in het Charité Clinical Scientist Program, gefinancierd door de Charité - Universitätsmedizin Berlin en het Berlin Institute of Health. TB is een SNSF PostDoc Mobility fellow. De auteurs ontvangen subsidieondersteuning van EinsteinStiftung/A-2012-153 aan PV.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Binocular surgical microscope | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Light source for microscope | Zeiss | CL 6000 LED | |
| Heating pad with rectal probe | FST | 21061-10 | |
| Stereotactic frame | Kopf | Model 930 | |
| Anaesthesia system for isoflurane | Draeger | ||
| Isoflurane | Abbott | ||
| Dumont forceps #5 | FST | 11251-10 | |
| Dumont forceps #7 | FST | 11271-30 | |
| Bipolar Forceps | Erbe | 20195-501 | |
| Bipolar Forceps | Erbe | 20195-022 | |
| Microdrill | FST | 18000-17 | |
| Needle holder | FST | 12010-14 | |
| 5-0 silk suture | Feuerstein, Suprama | ||
| 7-0 silk suture | Feuerstein, Suprama | ||
| 8-0 silk suture | Feuerstein, Suprama | ||
| Veterinary Recovery Chamber | Peco Services | V1200 |
Referenties
- Mukherjee, D., Patil, C. G. Epidemiology and the global burden of stroke. World Neurosurg. 76 (6), Suppl 85-90 (2011).
- Ebinger, M., Prüss, H., et al. Effect of the use of ambulance-based thrombolysis on time to thrombolysis in acute ischemic stroke: a randomized clinical trial. JAMA. 311 (16), 1622-1631 (2014).
- Ebinger, M., Lindenlaub, S., et al. Prehospital thrombolysis: a manual from Berlin. J vis Exp. (81), e50534(2013).
- Bogousslavsky, J., Van Melle, G., Regli, F. The Lausanne Stroke Registry: analysis of 1,000 consecutive patients with first stroke. Stroke. 19 (9), 1083-1092 (1988).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
- Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
- Meairs, S., Wahlgren, N., et al. Stroke research priorities for the next decade--A representative view of the European scientific community. Cerebrovasc Dis. 22 (2-3), 75-82 (2006).
- Rosamond, W., Flegal, K., et al. Heart disease and stroke statistics--2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69-171 (2007).
- Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci. 22 (9), 391-397 (1999).
- Dirnagl, U., Endres, M. Found in Translation: Preclinical Stroke Research Predicts Human Pathophysiology, Clinical Phenotypes, and Therapeutic Outcomes. Stroke. , (2014).
- Prinz, V., Hetzer, A. -M., et al. MRI heralds secondary nigral lesion after brain ischemia in mice: a secondary time window for neuroprotection. J Cereb Blood Flow Metab. , (2015).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. (61), (2012).
- Holtmaat, A., Bonhoeffer, T., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Iadecola, C., Dirnagl, U. The microcircualtion--fantastic voyage: introduction. Stroke. 44 (6), Suppl 1 83(2013).
- Blinder, P., Tsai, P. S., Kaufhold, J. P., Knutsen, P. M., Suhl, H., Kleinfeld, D. The cortical angiome: an interconnected vascular network with noncolumnar patterns of blood flow. Nat Neurosc. 16 (7), 889-897 (2013).
- Shih, A. Y., Driscoll, J. D., Drew, P. J., Nishimura, N., Schaffer, C. B., Kleinfeld, D. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Cabrales, P., Carvalho, L. J. M. Intravital microscopy of the mouse brain microcirculation using a closed cranial window. J Vis Exp. (45), (2010).
- Rosell, A., Agin, V., et al. Distal occlusion of the middle cerebral artery in mice: are we ready to assess long-term functional outcome. Transl Stroke Res. 4 (3), 297-307 (2013).
- Dorand, R. D., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. Y. Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex. Intravital. 3 (2), (2014).
- Balkaya, M., et al. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
- Balkaya, M., Kröber, J., Gertz, K., Peruzzaro, S., Endres, M. Characterization of long-term functional outcome in a murine model of mild brain ischemia. J Neurosci Methods. 213 (2), 179-187 (2013).
- Freret, T., Bouet, V., et al. Behavioral deficits after distal focal cerebral ischemia in mice: Usefulness of adhesive removal test. Beh Neurosci. 123 (1), 224-230 (2009).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. RODENT STROKE MODEL GUIDELINES FOR PRECLINICAL STROKE TRIALS (1ST EDITION). J Exp Stroke Trans Med. 2 (2), 2-27 (2009).
- Florian, B., Vintilescu, R., et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neurosci Lett. 438 (2), 180-185 (2008).
- Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
- Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke. 35 (7), 1720-1725 (2004).
- Shin, H. K., Nishimura, M., et al. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39 (5), 1548-1555 (2008).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
- Gertz, K., Priller, J., et al. Physical activity improves long-term stroke outcome via endothelial nitric oxide synthase-dependent augmentation of neovascularization and cerebral blood flow. Circ Res. 99 (10), 1132-1140 (2006).
- Dirnagl, U. Bench to bedside: the quest for quality in experimental stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (12), 1465-1478 (2006).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
