Een muizenmodel van groep B Streptococcus Vaginale Kolonisatie

Samenvatting

Het doel van dit protocol is voor de menselijke groep B Streptococcus (GBS) vaginale kolonisatie na te bootsen in een muismodel. Deze werkwijze kan worden gebruikt om immuunreacties van de gastheer en bacteriële factoren die GBS vaginale persistentie te onderzoeken, alsmede therapeutische strategieën testen.

Samenvatting

Streptococcus agalactiae (groep B streptococcus, GBS) is een Gram-positieve, asymptomatische kolonisator van het menselijke maagdarmkanaal en vaginale kanaal van 10 - 30% van de volwassenen. In immuun-gecompromitteerde individuen, met inbegrip van pasgeborenen, zwangere vrouwen en ouderen, kan GBS overschakelen naar een invasieve ziekteverwekker die aan sepsis, artritis, longontsteking en hersenvliesontsteking. Omdat GBS is een toonaangevende bacterieel pathogeen van pasgeborenen, is de huidige profylaxe bestaat uit de late zwangerschap screening voor GBS vaginale kolonisatie en de daaropvolgende peripartum antibiotische behandeling van GBS-positieve moeders. Zware GBS vaginale last is een risicofactor voor zowel de neonatale ziekte en kolonisatie. Helaas is er weinig bekend over de gastheer en bacteriële factoren die bevorderen of toestaan ​​GBS vaginale kolonisatie. Dit protocol beschrijft een techniek voor zij hardnekkige GBS vaginale kolonisatie met één β-estradiol voorbehandeling en dagelijks bemonstering bacteriële loa bepalend. Het verdere details methoden om aanvullende therapieën of reagentia van belang te beheren en vaginale lavage vloeistof en voortplantingsorganen weefsels te verzamelen. Deze muis model zal het begrip van de GBS-gastheer interactie binnen de vaginale omgeving, die zal leiden tot een potentiële therapeutische doelen aan maternale vaginale kolonisatie controle tijdens de zwangerschap en de overdracht aan de kwetsbare pasgeboren voorkomen bevorderen. Het zal ook van belang zijn voor ons begrip van de algemene bacterie-gastheer interacties in de vrouwelijke vaginale-darmkanaal te verhogen.

Inleiding

Streptococcus agalactiae, groep B Streptococcus (GBS), een ingekapselde, Gram-positieve bacterie die vaak wordt geïsoleerd uit de darm en urogenitale tractus van gezonde volwassenen. In de jaren 1970, GBS naar voren als de belangrijkste agent van besmettelijke neonatale sterfte, met meer dan 7.000 gevallen van neonatale ziekte jaarlijks ^1. Early-onset GBS-infectie (EOD) komt in de eerste uren of dagen van het leven, ontstaat als longontsteking of ademhalingsproblemen, en vaak ontwikkelt tot sepsis, terwijl de late vorm van de ziekte (LOD) ontstaat na enkele maanden en presenteert met bacteriëmie, die vaak voorschotten aan meningitis ^2. Met ingang van 2002, de Centers for Disease Control and Prevention beveelt universele screening voor GBS vaginale kolonisatie in de late zwangerschap en de bevalling antibioticaprofylaxe (IAP) naar GBS-positieve moeders ^1. Ondanks het terugdringen van de vorm van de ziekte tot ongeveer 1000 gevallen in de Verenigde Staten jaarlijks door IAP,GBS blijft de belangrijkste oorzaak van vroege-onset neonatale sepsis, en late-onset optreden blijft onaangetast ^1. Of het nu in de baarmoeder, tijdens de bevalling, of zelfs in late-onset gevallen, neonatale blootstelling aan GBS moet overleven, transversale via een aantal host-omgevingen en barrières, het immuunsysteem fraude, en, in het geval van meningitis, kruising van de sterk gereguleerde bloed- hersenbarrière ^2. Stroomopwaarts van deze virulente interacties binnen de pasgeborene is de eerste kolonisatie van de maternale vaginale kanaal. Maternale GBS vaginale kolonisatie tarieven variëren 8-18% in de ontwikkelde landen en ontwikkelingslanden, met een geschatte gemiddelde van 12,7% ^3,4. GBS kolonisatie van de vaginale-darmkanaal tijdens de zwangerschap kan constant, intermitterend of voorbijgaande aard onder individuele vrouwen ⁵ zijn. Interessant is dat een leeftijd van de moeder> 36 jaar in verband met aanhoudende kolonisatie ^6. Tal van biologische en sociaal-economische risicofactoren voor GBS vaginale kolonisatiegeïdentificeerd. Biologische factoren omvatten gastrointestinale GBS kolonisatie en afwezigheid van Lactobacillus in de darm. Echter, etniciteit, obesitas, hygiëne en seksuele activiteit ook in verband gebracht met GBS vaginale wagen ^7.

Hoewel bekend voor het veroorzaken neonatale infecties GBS veroorzaakt ook verschillende maternale infecties zowel peripartum en postpartum. GBS slede is verhoogd bij vrouwen presenteren met vaginitis ⁸ en in sommige gevallen zelfs het ziektebeeld ⁹ zijn. Bovendien kan GBS hemelvaart van de voortplantingsorganen tijdens de zwangerschap leiden tot een intra-amniotische infectie of chorioamnionitis ^10. Bovendien, tot 3,5% van de zwangerschappen, GBS verspreidt de urineblaas een urineweginfectie of asymptomatische bacteriurie ¹¹ veroorzaken. GBS bacteriurie tijdens de zwangerschap is geassocieerd met een verhoogd risico op de bevalling koorts, chorioamnionitis, vroeggeboorte en premature breken van de vliezen ^12. Samengevat, is de aanwezigheid van GBS in de vaginale kanaal houden met ontstekingen meerdere gastheerweefsels, en de mogelijkheid om GBS elimineren van deze niche is noodzakelijk voor zowel maternale en neonatale gezondheid.

Tot voor kort, de meeste werkzaamheden onderzoeken GBS interacties met de cervicovaginal tract werd alleen in vitro celmodellen ^13-15. Deze in vitro experimenten bacteriële factoren die belangrijk zijn voor hechting zijn, waaronder oppervlakte-eiwitten bleek zo'n pili en serine-rijke repeats ^17,18, evenals twee componenten regelsystemen ^15,19 en de globale transcriptionele respons van het vaginale epitheel GBS ^19. Echter, de gastheer-microbe interacties volledig helderen binnen het vaginale kanaal, een robuuste diermodel noodzakelijk. Vroeg werk aangetoond dat GBS uit de vaginale landstreek van geënte muizen ^20,21 en ratten kunnen worden hersteld ^{22 in zowel de zwangere en niet-zwangere omstandigheden. In 2005 werd op korte termijn GBS vaginale kolonisatie gemodelleerd bij muizen om de werkzaamheid van een faag lytisch enzym te onderzoeken tot vaginale GBS behandelen gedurende een periode van 24 uur 23. Enkele jaren later, werd een lange-termijn GBS vaginale kolonisatie muismodel ontwikkeld om gastheer en bacteriële factoren die GBS doorzettingsvermogen te bestuderen. Dit model heeft talrijke GBS factoren die kolonisatie, waaronder oppervlak appendages 17,18 en GBS tweecomponentensystemen 19,24 geïdentificeerd. Dit model heeft bijgedragen tot de identificatie van gastheer respons mechanismen 19,25 en werd gebruikt om verschillende therapeutische strategieën, met inbegrip van immunomodulerende peptiden 26 en probiotica 27 te testen. Dit protocol geeft de nodige begeleiding om GBS te enten in de muis vaginale-darmkanaal en vervolgens kolonisatie te volgen en het verzamelen van monsters voor verdere analyse.}

Protocol

Alle dierlijke werk werd goedgekeurd door het Bureau van Lab Animal Care in San Diego State University en uitgevoerd onder aanvaarde veterinaire normen. Vrouwelijke muizen, leeftijd 8-16 weken werden gebruikt voor de ontwikkeling van deze methode.

1. Voorbereiding en intraperitoneale injectie van β-estradiol

1. Meet β-estradiol (0,5 mg / muis) op weeg papier, terwijl het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM). LET OP: β-oestradiol kan worden geabsorbeerd door de huid en slijmvliezen.
2. Transfer β-estradiol een 15-ml conische buis en vortex totdat alle klonten worden verwijderd en de β-estradiol is een fijn poeder. Het opstellen van sesamolie (100 pl / muis) in een 10-ml spuit. Spuit-filter sesamolie in de 15 ml conische buis met het β-estradiol met een 0,45 urn filter. Vortex de 15-ml conische buis dienovereenkomstig β-estradiol is een homogene suspensie in de sesamolie.
3. Het opstellen van de β-estradiol suspensie in een nieuwe 10-ml spuit. Met een 18 G, 1-in. naald, monster 100 ul van de suspensie in de 1-ml tuberculine injectiespuiten. Bereid een spuit voor elke muis. Plaats een nieuwe, steriele 26 G, ½-in. naald op elk tuberculine spuit.
4. Dien 0,5 mg van het β-estradiol gesuspendeerd in 100 ui sesamolie (5 mg / ml) aan elke muis 24 uur vóór bacteriële inoculatie. Injecteer elke muis in de buikholte, in de onderbuik kwadranten, net rechts of links van de middellijn, zoals eerder beschreven ^28.
   OPMERKING: Geen schoonmaak of knippen van de plaats van injectie nodig is.

2. Vaginale Inenting met GBS

1. Eén dag voor enting, groeien een 5-ml overnacht vloeibare cultuur van een GBS-stam van belang, zoals de A909 (serotype Ia), in Todd Hewitt bouillon (THB) bij 37 ° C.
2. Subcultuur de GBS overnacht cultuur op een 01:10 volume in de frisse mensenhandel en incubeer bij 37 ° C. groeien debacterie tot mid-log-fase (OD ₆₀₀ = 0,4-0,5). LET OP: Dit zal meestal duren 2-3 uur, afhankelijk van de stam van de GBS.
3. Breng de subcultuur een steriele 15 ml conische buis en pellet bacteriën bij 3000 xg gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant. Resuspendeer de bacteriële pellet in 200 ui steriel fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
4. Met de geresuspendeerde pellet, breng 3-5 ml PBS (1 ml per 10 muizen) precies OD ₆₀₀ = 0,4 in een nieuwe cultuurbuis 5 ml. Dit zal een concentratie van 1 x 10 ~ ⁸ kolonievormende eenheden (CFU) / ml. Transfer naar een nieuwe 15 ml conische buis en opnieuw pellet de bacteriën bij 3000 x g gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant.
5. Resuspendeer de pellet in PBS bij 1/10 van het oorspronkelijke volume. Wanneer bijvoorbeeld 3 ml OD ₆₀₀ = 0,4 werd gepelleteerd, opnieuw in suspensie vervolgens in 300 gl PBS. Opmerking: Dit is de laatste bacteriesuspensie (~ 1 × 10 ⁹ CFU / ml) gebruikt voor dierlijke inoculatie.
6. Reserve 50 ul van deze suspensie voor seriële verdunning en uitplaten op mensenhandel agar om de exacte entstof te bepalen.
7. Inoculeren elke muis met 10 ul van de uiteindelijke bacteriesuspensie zodat 1 x 10 ⁷ CFU wordt toegediend aan elke muis.
   1. Om te enten, handmatig beperken de muis door het veiligstellen van de losse huid aan het nekvel tussen duim van de handler en wijsvinger en vervolgens het immobiliseren van de staart, zoals eerder ²⁸ beschreven.
   2. Opstellen 10 ul van de GBS bereid in stap 2.6 in een 200-ul gel laden pipetpunt. Breng de punt 5 tot 10 mm in het vaginale lumen en verdeel de 10 pl inoculum.
      OPMERKING: Gel plaatsen Tips voorkeur boven standaard 200-ul tips om het risico van trauma of letsel orgaan minimaliseren, vooral bij jonge muizen of kleiner.
   3. Onmiddellijk na inenting, laat de nekvel en verheffen het achterste einde van de muis, het opheffen van de muis bij de staart en walking de voorpoten op een harde ondergrond voor ~ 1 min.
   4. Inspecteer de vaginale opening voor eventuele terugstroom van entstof. Als terugstroom wordt waargenomen, kan een frisse pipettip worden gebruikt om te manipuleren of te vergroten de vaginale opening, het vergemakkelijken van de opname van het terugstromen in het lumen. Bovendien kan terugstroming worden afgezogen via een pipet en opnieuw geïnoculeerd.
      LET OP: Als het toedienen van lokale agenten, probiotische organismen, of eiwitten van belang, een volume tot 20 pi in een fysiologische buffer kan worden gegeven in de vaginale-darmkanaal.

3. het schoonvegen van de Vaginale Lumen om GBS Load kwantificeren

1. Bereid een 1,5-ml micro-centrifugebuis per muis door toevoeging van 100 pi PBS. Net voor zwabberen, pre-nat het staafje in PBS.
2. Beperken de muis zoals beschreven in stap 2.7.1 en plaats het staafje 10 mm in de vaginale lumen. Voorzichtig draai de swab 4 keer met de klok mee en 4 keer tegen de klok in, onder lichte druk om de vaginawand.
3. Breng het wattenstaafje om de 1,5-ml microcentrifuge buis met 100 ui PBS. Vóór plating, vortex de microcentrifugebuis van ~ 15 seconden om de bacteriën los te maken van het staafje. Serieel verdund elk monster in PBS en de plaat 20 pl verdunningen 1:10 tot 1: 10.000 voor de differentiële medium agarplaten bereid volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 24 uur. GBS kolonies zal ofwel fel roze of paars van kleur verschijnen. Andere endogene flora wordt geremd, of zal verschijnen als blauw, wit of grijs kolonies.

4. Het verzamelen van vaginale wasvloeistof

1. Restrain de muis zoals beschreven in stap 2.7.1. Met behulp van een 200-gl gel-lading pipetpunt Pipetteer 20 ul PBS in de vaginale lumen. Voorzichtig pipet het volledige volume omhoog en omlaag 4 keer in het lumen, en vervolgens het gehele volume in dezelfde pipet tip in te trekken. OPMERKING: Als de spoelvloeistof is dik met slijm, een standaard 200 ul pipetpuntkan worden gebruikt om de uiteindelijke spoelvloeistof verzamelen.
2. Als het opslaan van lavage vloeistof voor cytokine analyse of CFU kwantificering, afzien in een 0,7 ml microcentrifugebuis. Indien het bepalen van het stadium van estrus afzien tenminste 5 ul lavage vloeistof op een glasplaatje en observeer de cellen onder 100x vergroting op een lichtmicroscoop. LET OP: Voor voorbeelden van estrous etappes, zie figuur 1.

5. Tissue Dissection en homogenisering

1. Voor elke muis bereiden drie 2-ml schroefdopbuisjes (één voor elk weefsel: vagina, baarmoederhals en baarmoeder). Vul elke buis met voldoende (0,4-0,5 g) 1,0 mm zirkoniumoxide kralen om de kegelvormige bodem van de buis te dekken.
2. Autoclaaf de bereide buisjes voorafgaand aan het verzamelen van weefsel voor 30 min bij 121 ° C, vooral als kwantificeren bacteriële verontreiniging. Voeg 500 pl steriel PBS aan elke buis. Weeg elke buis na een autoclaaf en record voor toekomstig gebruik te vorderen weefsel gewicht te berekenen.
3. Sacrifice de muis met behulp van goedgekeurde institutionele methoden zoals CO ₂ stikken en cervicale dislocatie. Spuit langs de ventrale buik met 70% EtOH. Met een steriele schaar, open de abdominopelvic holte, til de rug huid en de buikspieren, en verdringen de darmen, zodat de voortplantingsorganen wordt blootgesteld.
4. Steriliseer de schaar met 70% EtOH, schoon te vegen indien nodig, en snijd beide baarmoederhoorns mid-lengte tussen de baarmoeder lichaam en eierstokken. Met een schaar en een tang, aparte visceraal vet, membranen, en de urineblaas weg van de voortplantingsorganen, bewegende caudaal.
5. Steriliseren schaar zoals beschreven in stap 5.4. Dwars doorgesneden de vagina zo dicht mogelijk bij de vulva mogelijk het voortplantingskanaal te scheiden van het lichaam. Til en verwijder de intacte voortplantingsorganen en plaats deze in een steriele petrischaal.
6. Met een nieuw scheermesje, scheiden de baarmoeder van de cervix in een dwarse snede. Steriliseer de scheermesje met 70%EtOH en vervolgens scheiden van de baarmoederhals van de vagina in een dwarse snede. NB: Er zal een minimale hoeveelheid van de baarmoeder weefsel nog aan de baarmoederhals worden. Er is een minimale hoeveelheid vaginaal weefsel nog aan de cervix is.
7. Met steriele tang, overdracht elk van de weefsels in hun respectievelijke 2-ml buisjes met PBS en homogeniseren kralen. Reinig de tang met 70% EtOH in tussen de behandeling van elk weefsel.
8. Weeg elk 2 ml schroefdop tube en aftrekken van het oorspronkelijke gewicht van de buis aan het weefsel gewicht te bepalen. Tissue gewichten meestal variëren tussen 20-100 mg. Goed af de schroefdopbuisjes en homogeniseer de weefsels gedurende 1 minuut bij maximale snelheid in een weefsel homogenisator.
9. Om bacteriële verontreiniging te kwantificeren, serieel verdunnen 25 pi van weefsel homogenaat en plaat verdunningen 01:10 door middel van 1: 10.000 op differentiële medium agarplaten. Incubeer de platen zoals beschreven in stap 3.3. Monsters voor cytokine kwantificering opslaan, bevriezen weefsel homogenaten bij -20 ° C.

Resultaten

Bij de ontwikkeling van dit model zijn verschillende opmerkingen over factoren die de duur van GBS vaginale kolonisatie beïnvloeden. Om te bepalen hoe estrous stadium bij enting gevolgen GBS bacteriële persistentie werden muizen gehouden op de dag van de inenting via vaginale lavage vloeistof. Figuur 1 illustreert de vier fasen van de muis loopsheid, zoals bepaald door middel van nat-mount vaginale lavage vloeistof, een bekende methode ^29. Muizen werden verdee...

Discussie

Om de voortgang van het begrijpen van GBS interactie met zowel de gastheer en andere microben in het kader van de gastheer te bevorderen, wordt een diermodel vereist. Dit werk beschrijft de technische aspecten van de oprichting van GBS vaginale kolonisatie in muizen. Dit protocol realiseert> 90% kolonisatie van muizen zonder het gebruik van anesthetica bacteriën enten of swabmonsters, immuun-onderdrukkende verzamelen om kolonisatie mogelijk, vaginale voorwassen of additieven voor het inoculum verdikken. Bovendien is ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Sesame oil	Sigma Aldrich	S3547-250ML
β-Estradiol	Sigma Aldrich	E8875-1G	VOORZORG: Draag geschikte PPE. β-estradiol kan worden opgenomen via de huid en slijmvliezen.
200 μl gel loading pipette tips	USA Scientific	1252-0610
Urethro-genitaal, steriel, calcium alginate swabs	Puritan	25-801 A 50
CHROMagar StrepB	DRG International	SB282
Todd Hewitt Broth	Hardy Diagnostics	7161C
18 G, 1,5 inch naalden	BD	305199
26 G, 0,5 inch naalden	BD	305111
10 ml spuiten	BD	309604
1 ml spuiten	BD	309659
0,45 μm PVDF spuitfilters	Whatman	6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x	Corning	21-031-CV