Ontwikkeling van stamcel-afgeleide Antigeen-specifieke regulatoire T-cellen tegen auto-immuniteit

Samenvatting

We presenteren hier een methode om functionele antigeen (Ag)-specifieke regulatoire T-cellen (Tregs) te ontwikkelen uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) voor immunotherapie van auto-immuun artritis in een muismodel.

Samenvatting

Auto-immuunziekten worden veroorzaakt door het verlies van immunologische zelftolerantie. Regulatoire T-cellen (Tregs) zijn belangrijke mediatoren van immunologische zelf-tolerantie. Tregs voor ongeveer 5-10% van de volwassen CD4 ⁺ T-cel subpopulaties in muis en mens, met ongeveer 1-2% van de Tregs circuleren in het perifere bloed. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) kunnen worden gedifferentieerd in functionele Tregs, die een potentieel om te worden gebruikt voor celtherapie van auto-immuunziekten. Hier presenteren we een methode voor antigeen (Ag) -specifieke Tregs van iPSCs (dwz iPSC-Tregs) ontwikkelen. De werkwijze is gebaseerd op het opnemen van de transcriptiefactor Foxp3 en een Ag-specifieke T-celreceptor (TCR) in iPSCs en vervolgens differentiëren naar OP9 stromale cellen die Notch liganden delta-achtige (DL) en 1 DL4. Naar aanleiding van in vitro differentiatie, de iPSC-Tregs uiten CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3 en Ag-specifieke TCR en zijn in staat om te reageren op Ag stimulatie.Deze werkwijze is met succes toegepast op cellen gebaseerde behandeling van autoimmune artritis in een muizenmodel. Adoptieve overdracht van deze Ag-specifieke iPSC-Tregs in Ag-geïnduceerde artritis (AIA) dragende muizen heeft het vermogen om gewrichtsontsteking te verminderen en zwelling en botverlies voorkomen.

Inleiding

Auto-immuun artritis is een systemische ziekte die wordt gekenmerkt door hyperplasie van synoviaal weefsel en progressieve vernietiging van gewrichtskraakbeen, bot en ligamenten¹. De defecte generatie of functie van Tregs bij auto-immuun artritis draagt bij aan chronische ontsteking en weefselschade, omdat Tregs een cruciale rol spelen bij het voorkomen van de ontwikkeling van auto-reactieve immuuncellen.

Manipulatie van Tregs is een ideale strategie voor de ontwikkeling van therapieën om ontsteking op een Ag-afhankelijke manier te onderdrukken. Voor Treg-gebaseerde immunotherapie is de specificiteit van de overgedragen Tregs belangrijk voor de behandeling van lopende auto-immuniteit². Om de onderdrukkende activiteit te vertonen, moeten Tregs migreren en worden vastgehouden in het getroffen gebied, wat kan worden gericht door de specificiteit van de TCR voor het Ag op die locatie³. Hoewel polyklonale Tregs een kleine populatie kunnen bevatten met deze Ag-specificiteit vanuit hun TCRs, zijn de aantallen van deze Ag-specifieke Tregs meestal laag. Bijgevolg vereisen cel-gebaseerde therapieën die polyklonale Tregs tegen auto-immuunstoornissen gebruiken adoptieve overdrachten van een groot aantal Tregs^4,5. Omdat pluripotente stamcellen (PSCs) de mogelijkheid hebben zich tot elk type cel te ontwikkelen, kunnen Ag-specifieke PSC-Tregs goede kandidaten zijn voor Treg-gebaseerde immunotherapie. Eerdere studies hebben de succesvolle ontwikkeling van PSC-afgeleide T-cellen, inclusief Tregs, aangetoond^6-8.

Hier beschrijven we een protocol om Ag-specifieke iPSC-Tregs te ontwikkelen. We beschrijven verder een cel-gebaseerde therapie van auto-immuun artritis in een muismodel met behulp van dergelijke Tregs. Deze methode is gebaseerd op het genetisch modificeren van muis-iPSCs met Ag-specifieke TCRs en het transcriptiefactor FoxP3. De gemanipuleerde iPSCs differentiëren vervolgens tot Ag-specifieke Tregs op de OP9-stromacellen die Notch-liganden DL1, DL4 en MHC-II (I-A^b) moleculen tot expressie brengen in aanwezigheid van cytokines mFlt3L en mIL-7. Deze Ag-specifieke iPSC-Tregs kunnen onderdrukkende cytokinen produceren, zoals TGF-β en IL-10, wanneer gestimuleerd met het Ag, en adoptieve overdracht van dergelijke Tregs heeft de mogelijkheid om de ontwikkeling van AIA in een muismodel te onderdrukken. Het beschreven protocol kan worden gebruikt om stamcel-afgeleide Ag-specifieke Tregs te ontwikkelen voor potentiële therapeutische interventies.

Protocol

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Pennsylvania State University College of Medicine Animal Care Committee (IACUC protocol # 45470) en worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Vereniging voor de evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care.

1. Stem Cell Culture

1. Incubeer een 10 cm schaal met 10 ml 0,1% gelatine gedurende tenminste 30 minuten bij 37 ° C (incubator) teneinde het bekleden van de plaat.
2. Gelatine verwijderen uit het schaaltje en de plaat 3 x 10 ⁶ bestraalde SNL76 / 7 cellen en incubeer gedurende één dag bij 37 ° C (incubator) middels 10% DMEM medium (10% FBS en 1% penicilline streptomycine).
3. Verwijder het medium uit de plaat en cultuur ontdooid iPSCs via SNL76 / 7 cell voedingslaag behulp iPSC media (DMEM medium dat 15% foetaal kalfsserum, 0,1 mmol / l niet-essentiële aminozuren, 1 mmol / L L-glutamine, en 0,1 mmol / l β-mercaptoethanol) ^9. De muis iPS-MEF-Ng-20D-17 cell Line, die werd opgewekt uit muis embryonale fibroblasten door retro virale transfectie van Oct3 / 4, Sox2, Klf4, en c-Myc, werd verkregen van Dr. Shinya Yamanaka (Institute for Frontier Medische Wetenschappen, Universiteit van Kyoto, Kyoto, Japan).
4. Wijzig de media op dag 3 met verse media en observeren iPSC kolonies onder de microscoop.
   LET OP: Deze kolonies zijn klein, glanzend clusters of rond cellen met een duidelijke afbakening zien GFP expressie onder een fluorescentiemicroscoop.

2. In vitro differentiatie van Ag-specifieke iPSC-Tregs

1. Het genereren van retrovirale constructen transductie te gebruiken door sub-kloneren van de OT-II en TCR genen Foxp3 in de MIDR plasmide ¹⁰ verbonden met zelf-splitsende peptide 2A de MIDR-TCRα-2A-TcR-2A-FoxP3 construct maken.
2. Voer retrovirale transductie ⁹ van iPSCs gebruik Plat E cellen als de verpakking cellijn.
3. Op dag 0, zaad OP9-DL1-DL4 ^IA-B-cellen eenta minimale dichtheid van 10 ⁴ cellen / ^cm2 met OP-9 media (α-MEM medium dat 20% FCS en 2,2 g / l natriumbicarbonaat. Plaat 1 x 10 ⁶ cellen per 10 cm schaal.
4. Op dag 3, toen OP9-DL1-DL4-IA ^b cellen 80-90% confluent, verwijder de media en zaden 0,5-1 x 10 ⁵ iPSCs dan OP9-DL1-DL4 - IA ^B-cellen in OP-9 media.
   LET OP: Dit stelt de co-cultuur van iPSCs op OP9-DL1-DL4-IA ^B-cellen en wordt beschouwd als dag 0 van de differentiatie ⁹ zijn.
5. Op dag 5, verwijder de media uit de 10 cm schotel door aspiratie, was de cellen met 10 ml 1x PBS en zuig het PBS. Voeg 4 ml van 0,25% trypsine en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Voeg nog 8 ml iPSC medium aan de cellen resuspendeer hen en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   1. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml iPSC media. Incubeer Deze opnieuw gesuspendeerde cellen op een nieuwe 10 cm schaalen terug naar de incubator gedurende 30 minuten.
      LET OP: Verwijder de OP9-DL1-DL4-IA ^b feeder cellen en houdt de differentiërende iPSCs drijvend in de media. 90% samenvloeiing voor verdere co-cultuur - te behouden OP9-DL1-DL4-IA ^B-cellen continu tot 80 te bereiken.
   2. Na 30 min, laat het drijvende cellen, filteren door een 70 um cel zeef en tel de cellen met een hemocytometer.
6. Zaad 5 x 10 ⁵ van iPSCs om een frisse 80 - 90% samenvloeiing van OP9-DL1-DL4-IA ^B-cellen in OP9 media. Vullen de media mFlt-3L in een eindconcentratie van 5 ng / ml.
7. Op dag 8, het verzamelen van gedeeltelijk gedifferentieerde iPSCs door het wassen van de plaat met de media uit de schotel zelf met behulp van een 10 ml pipet. Met nog 5 ml OP-9 media in de schaal voorzichtig wassen semi-hechtende cellen door voorzichtig krachtig pipetteren om te voorkomen dat het breken OP9 monolaag op de bodem van de schaal. Herhaal het wassen met 10 ml PBS om alle semi-ad oogstenherent differentiërende cellen.
   1. Combineer wast, centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, resuspendeer in 10 ml OP9 medium dat mFlt-3L (5 ng / ml) en mIL-7 (1 ng / ml) en filtreer door een 70 um cel zeef.
8. Overdracht van de cellen in een 6-well cultuur plaat met 80-90% confluent OP9-DL1-DL4-IA ^B-cellen, zoals in stap 1.1. Transfer cellen geoogst van een 10 cm schaal in één putje van de 6-well plaat.
9. Op dag 10, veranderen de helft van de inhoud van cellen in open OP9 media waaraan mFlt-3L (5 ng / ml) en mIL-7 (1 ng / ml). Herhaal deze stap om de twee dagen.
10. Elke 4-6 dagen, afhankelijk van de groei, re-zaad de differentiërende iPSCs op platen met een verse laag OP9-DL1-DL4 ^IA-B-cellen, zoals beschreven in stap 1.1.

3. Evaluatie van In Vitro Treg differentiatie en rijping

1. Morfologische veranderingen differentiëren iPSCs.
   1. MoNitor de co-cultuur van iPSC met OP9-DL1-DL4 ^IA-B-cellen elke dag door het observeren van levende cellen onder een conventionele helderveld microscoop (20X). Per dag 5, observeert de kolonies met mesoderm-achtige kenmerken, zoals afgeplatte cellen. Per dag 8, acht kleine, ronde clusters van cellen, die differentiërende cellen vertegenwoordigen.
   2. Gebruik de trypanblauwexclusie Methode om de cellen te tellen om het aantal en percentage levende cellen te detecteren. Bereken cellevensvatbaarheid het aantal levensvatbare cellen gedeeld door het totale aantal cellen in de vier rasters op de hemocytometer. Als cellen nemen trypan blauw, overwegen ze dood of niet-levensvatbaar. Noteer het aantal levende cellen geoogst uit de kweek.
2. Flowcytometrieanalyse differentiëren iPSCs.
   1. Op dag 5, 7, 11, 15, 19, 21 en 28 van co-cultuur verwijderen van de cellen met 0,25% trypsine zoals in stap 25.
   2. Voorafgaand aan het oppervlak kleuring met verschillende fluorochroom geconjugeerde antilichamen incubate 1 x 10 ⁶ cellen met 100 pl Fc blokker 2.4G2 verdund in PBS (eindconcentratie 10 ug / ml) bij 4 ° C gedurende 20 minuten om de binding van antilichaam voorkomen dat de Fc receptor op het celoppervlak.
   3. Op dag 5, 7, 11, 15, 19, 21 en 28, gebruik 1 x 10 ⁶ cellen voor flowcytometrie met verschillende fluorochroom geconjugeerde antilichamen aan het celoppervlak markers, zoals CD3, TcR, CD4, CD8, CD25 te detecteren, en CTLA4.
   4. Na Fc blok, wassen cellen met 10 ml PBS en vlekken met verschillende fluorochroom geconjugeerde antilichamen gedurende 20 minuten bij 4 ° C, en vervolgens de flowcytometrische analyse met de 15-kleuren flowcytometer. Met 0,200 ug antilichaam per 10 ⁶ cellen verdund in 100 pl PBS.
   5. Op dag 28, analyseren de cellen door flowcytometrie ¹¹ en poort op CD4 ⁺ CD8 ⁺ cellen middels CD4 en CD8 fluorochroom-geconjugeerd kleuring; analyse voor de expressie van TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA-4, En FoxP3 (figuur 1). Voor FoxP3 kleuring, bevestig de cellen en permealize hen en voer vervolgens antilichaam kleuring ^11.
3. In vitro stimulatie van antigeen iPSCs.
   1. Op dag 28 van co-cultuur, oogst iPSC-Tregs uit culturen door het verzamelen van de drijvende cellen. Trypsinize de rest van de cellen met 0,25% trypsine (zoals in stap 2,5) en resuspendeer de cellen in 8 ml iPSC media. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 xg bij kamertemperatuur, zuig de media, en opnieuw resuspendeer de cellen in 10 ml medium.
      1. Incubeer de opnieuw gesuspendeerde cellen op een nieuwe 10 cm schaal bij 37 ° C gedurende 30 minuten en verzamel de drijvende cellen. Was de cellen met koude PBS.
   2. Incubeer 3 x 10 ⁶ splenocyten uit milt van C57BL / 6 RAG1 - / - muizen met 5 uM ovalbumine peptide in 200 ul medium (OVA _323-339) bij 4 ° C gedurende 30 min in een 96 wells plaat ^11.
   3. Meng Tregs met OVA _323-339 -pulsed splenocyten bij een 1: 4 verhouding (gebruik 0,75 x 10 ⁶ Tregs). Incubeer bij 37 ° C in een _CO2 incubator gedurende 40 uur. In de afgelopen 4 uur, voeg 4 ul van verdund Brefeldine A in de cultuur (feitelijke concentratie 1000x, verdund in 1x cultuur media).
   4. Oogst cellen met 0,25% trypsine (zoals in stap 2,5), was met 10% _NaN3 en 0,5 M EDTA-oplossing (FACS-buffer), blok met 100 pl verdund (eindconcentratie 10 gg / ml) Fc blokker 2.4G2, en vlek voor oppervlaktemerkers, CD4, CD8, TCRVα2 en TCRVβ5 zoals in stappen 3.2.3-3.2.4.
   5. Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde oplossing in PBS en doorlaatbaar met 100 pl 1x permeabilisatie buffer na celoppervlak kleuring. Opgelet! Paraformaldehyde is allergeen, carcinogeen en toxisch.
   6. Vlekken op de cellen met fluorochroom geconjugeerde TGF-β en IL-10 gedurende 20 minuten in het donker. Gebruik 0,200 ug antilichaam / 10 ⁶ cellen diluted in 100 pl PBS. Detecteren intracellulaire productie van TGF-β en IL-10 met de 15-color flow cytometer (figuur 2).
   7. Was de cellen drie maal met koude FACS-buffer vóór de flowcytometrische analyse ^11.
4. In vivo persistentie van Ag-specifieke iPSC-Tregs.
   1. Na 8 dagen van de co-cultuur op de OP9-DL1-DL4-IA ^B-cellen, transfer iPSC-afgeleide pre-Tregs (Thy1.2) als in stap 3.3.1 in Uw 1.1 congenic muizen (4-6 weken oud) via een staartader injectie zonder verdoving. Voor het uitvoeren van de staartader injectie, verwijden de staartader onder toepassing van een infraroodlamp gedurende 5 min. Na staartader dilatatie, plaatst u de muis in een restrainer en adoptief-overdracht 3 x 10 ⁶ cellen opnieuw gesuspendeerd in 200 pl PBS door het injecteren via de staartader.
   2. Zes weken na de Treg overdracht, euthanaseren muizen door CO ₂ stikken, gevolgd door cervicale dislocatie. Zorg ervoor dat de mice worden niet ademen. Open de peritoneale holte door het snijden van de buitenhuid van het peritoneum met een schaar en forceps en zachtjes trekken naar de binnenlaag langs de buikholte bloot. Isoleer de milt en perifere lymfeknopen geïnjecteerd Thy 1,1 congene muizen.
   3. Verzamel de cellen van de milt en lymfeknopen mechanisch breken van een enkele celsuspensie werd verkregen. Incubeer de cellen met 5 ml ACK lysisbuffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om rode bloedcellen te lyseren. Verzamelen en wassen resterende splenocyten of lymfocyten met 10 ml koude FACS-buffer.
   4. Na het wassen, behandelen cellen met Fc blokker 2.4G2 bij 4 ° C gedurende 20 min volgens stap 3.2.2 en vlek met 100 gl verdunde fluorochroom-geconjugeerd anti-Thy 1,2 antilichamen.
   5. Was de cellen met 10 ml FACS buffer en ga verder met cytometrische analyse ¹¹ stromen.

4. In vivo rijping en onderdrukking van auto-immune artritis

1. Genereren van de constructen volgens stap 2,1.
2. Voer retrovirale transductie ⁹ zoals in stap 2.2.
3. In vivo differentiatie en inductie van artritis bij muizen.
   1. Differentiëren OT-II TCR /-FoxP3 getransduceerde iPSCs (OT-II-FoxP3 / iPSCs)-FoxP3 getransduceerde iPSCs en DsRed getransduceerd iPSCs de OP9-DL1-DL4-IA ^b stromale cellen in de aanwezigheid van cytokinen mFlt-3L en mIL-7 voor 8 dagen overeenkomstig stappen 2,1-2,6.
   2. Trypisinize alle drie soorten cellen van de 10 cm plaat en hersuspenderen cellen van elke plaat van 10 cm in 10 ml vers medium. Voeg de cellen een nieuwe 10 cm plaat en opnieuw incubator gedurende 30 minuten. Na 30 min, verzamel drijvende cellen.
   3. Passeren cellen door een 70 um cel zeef naar cel clusters te verwijderen en te tellen met behulp van een hemocytometer. Stel de cellen tot een concentratie van 1,5 x 10 ⁷ cellen / ml in koude PBS en opnieuw filtreren als nodig. Houd cellen op ijs tot adoptieve cel overdracht in muizen.
   4. Injecteer 200 ui van de celsuspensie (3 x 10 ⁶ cellen) in drie verschillende groepen van 4-6 weken oude vrouwelijke C57BL / 6-muizen door de staartader zoals beschreven in 3.4.1
   5. Op dag 10 na de celoverdracht, injecteren muizen met 100 ug MBSA geëmulgeerd in volledig Freund adjuvans bij de basis van de staart met behulp van een 1 ml spuit.
   6. Op dag 17, verdoven muizen met een isofluraan vaporizer (volgens richtlijnen IACUC). Maak gebruik van 4-5% isofluraan voor de inductie en 1-2% voor onderhoud. Induceren arthritis door intra-articulaire injectie van 20 gg MBSA in 10 ul PBS in de linker kniegewricht en 20 ug en 100 ug MBSA hele OVA in 10 ul PBS in de rechter kniegewricht. Eten en een gelpack kan op de aanwezige vloer worden geplaatst nadat artritis heeft ontwikkeld. Muizen zullen worden gedood: Body Condition Score (BCS) van 2/5 of stervende, ernstige cachexia en / of aanhoudende decubitus (een periode van 24 uur), en ernst score 4. score4, erythema en ernstige zwelling omvatten de enkel, voet en cijfers, of ankyloses van de ledemaat.
4. Karakterisering van de OT-II TCR /-FoxP3 getransduceerde iPSCs.
   1. Gebruik een fluorescentiemicroscoop (20X) aan gefixeerde live-DsRed ⁺ GFP ⁺ cellen te visualiseren.
   2. Onderzoek gen-integratie en expressie door zowel Western blot en flowcytometrie ^11.
5. Treg ontwikkeling en rijping.
   1. In week 2, 4 en 6 na de celoverdracht, euthanaseren de muizen. Om euthanasie, in elke kooi gebruiken 1-2 L van CO ₂ in de eerste fase. Zodra het dier het bewustzijn heeft verloren, verhoging van de stroomsnelheid van _CO2 4 - 5 l / min. Euthanaseren muizen door CO ₂ inhalatie. Isoleer de milt en tap de lymfeknopen door het snijden van de buitenhuid van het peritoneum met een schaar en forceps en zachtjes trekken naar de binnenlaag langs de buikholte bloot.
   2. Verzamel de enkele celsuspensie from de milt en lymfeknopen door een mechanisch defect met behulp van een cel zeef en een 1 ml spuit in 1% iPSC media. Centrifugeer de conische buis met het medium bij 400 g gedurende 5 minuten. Resuspendeer de celpellet in 5 ml ACK lysisbuffer om rode bloedcellen te lyseren. Re-centrifuge bij 1000 rpm gedurende 5 min. Resuspendeer de cel pellet en was de resterende splenocyten of lymfocyten met koud FACS buffer. Volg de stappen 3.4.4 - 3.4.5 en ga verder met cytometrische analyse stromen.
6. Intracellulaire kleuring.
   1. Op dag 50 na de uitdaging, isoleer de milt en afvoer van de lymfeknopen van de muizen (als in stap 4.5.1) na euthanization door CO ₂ inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie.
   2. Verzamel de enkele celsuspensie van de milt en lymfeknopen door mechanische analyse met behulp van een cel zeef en een 1 ml injectiespuit. Incubeer de splenocyten bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten met 5 ml ACK lysisbuffer om rode bloedcellen te lyseren. Verzamel en was de resterende splenocytes of lymfocyten met koud FACS buffer. Volg de stappen 3.2.3 - 3.2.4, maar vlek met oppervlak merkers CD4, CD8, CD25 en TCRVβ5.
   3. Overgaan tot cellen vast voor intracellulaire kleuring zoals beschreven in 3.3.5 - 3.3.7 en analyseren intracellulaire cytokine productie (TGF-β en IL-10) van iPSC-afgeleide Tregs en poort voor levende CD4 ⁺ CD25 ⁺ cellen.
7. Infiltratie van Ag-specifieke Tregs in de knieën en onderdrukking van artritis.
   1. Volgende stappen (4.3 - 4.3.6) op dag 7-14 na de inductie van artritis, euthanaseren muizen door CO ₂ inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie (volgens IACUC richtlijnen). Verwijder haar van de knieën met een elektrische tondeuse en accijnzen de knieën door de chirurgische ingreep.
   2. Verwijder het vel van de benen door een incisie in de achterpoot met stompe uiteinden schaar en snijd de huid in de dij en naar de enkel. Haal voorzichtig de huid over het been en voet naar de spier bloot te leggen. Verwijderende spieren van het been voorzichtig zonder beschadiging het kniegewricht.
      1. Snijd het achterbeen net boven het bekken / heupgewricht en snijd de tibia met behulp van scherpe ontleden schaar.
   3. Bevestig de knieën in 4% formaline voor 48 uur. Ontkalken knieën met 2,5 M mierezuur; driemaal spoelen in xyleen gedurende 3 minuten, spoel tweemaal in 100% ethanol, tweemaal spoelen in 95% ethanol, tweemaal spoelen met gedemineraliseerd water gedurende 2 min, en ontkalkt in 1 mM EDTA. Behandel een sub-kookpunt (90 ° C) gedurende 20 min.
   4. Koel het vaste weefsel voor 30 min. Spoel het met 1x PBS gedurende 4 min en insluiten in paraffine. Dehydrateer de weefsels door een reeks ethanol baden het water verplaatsen en vervolgens te infiltreren met was. Dan insluiten het geïnfiltreerde weefsels in wax blokken. Voeren zowel verticale als horizontale snijden voor kleuring. Bereid 4 micrometer secties met een sledemicrotoom.
   5. Voer immunofluorescentiekleuring op de onderdelen na standaardprocedures van deparaffinisatie en rehydratie met xyleen en ethanol ^12.
   6. Endogene peroxidase activiteit te blokkeren door onderdompeling van de schuif in een voldoende hoeveelheid van 3% waterstofperoxideoplossing 3 minuten na Ag ophalen. Blok dia voor niet-specifieke binding in 3% BSA in PBS bij kamertemperatuur in een vochtige kamer gedurende 60 minuten.
   7. Vlek secties met 200 pi fluorochroom-geconjugeerd TCRVβ5 antilichaam verdund 1: 100 in blokkeeroplossing. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in een 75-100% bevochtigde kamer, en was 5 keer in 1x PBS gedurende 5 minuten.
   8. Tegenkleuring dia nucleaire kleuring met DAPI reagens dat antifade. Voeg ongeveer 300 ul van de verdunde DAPI kleuroplossing (300 nM in 1 x PBS) aan de dekglaasje door te controleren gehele dekglaasje bedekt. Bewaar de objectglaasjes in het donker bij 4 ° C tot analyse onder een fluorescentiemicroscoop (figuur 3).
8. Artritis onderdrukking assay
   1. Meet de zwelling van de knieën van muizen vóór inductie van artritis door een dial gauge remklauw op een uitgangswaarde.
   2. Volg de stappen (4.3 - 4.3.6) voor artritis inductie en Treg-overdracht. Meet muis knieën met een dial-gauge remklauw post-Treg overdracht.
   3. Bereken de procentuele stijging in de knie diameter: procent stijging = (Knee diameter op dag 1 - Knee diameter op dag 0) / Knie diameter op dag 0.
9. Meting van gewrichtsvernietiging en infiltratie van ontstekingscellen in de knieën door histologie (figuur 4).
   1. Op dag 7 na de inductie van artritis, euthanaseren de muizen zoals eerder beschreven en Accijnzen de knieën door de chirurgische ingreep. Zie stap 4.7.1 - 4.7.2.
   2. Bevestig de knieën in 4% formaline, ontkalken in EDTA en insluiten in paraffine. Zie stap 4.7.3
   3. Verwijder beide knieën, vast te stellen in 10% formaline en verkalken in Formical-4. Insluiten de weefsels in paraffine, paragraaf 4 urn en vlek met hematoxylin en eosine (H & E) kleuring of safranine O (volgens stap 4.7.7) en waarnemen onder een microscoop.
   4. Met H & E kleuring boterosie evalueren met een semi-kwantitatieve scoringssysteem (0: geen erosie; 4: uitgebreide erosies en botafbraak). Gebruik Safranine O kleuring om het verlies van proteoglycanen evalueren en te scoren met een semi-kwantitatieve scoringssysteem (0: geen verlies van proteoglycanen; 3: volledig verlies van kleuring voor proteoglycanen).
      1. Gebruik een semi-kwantitatieve scoringssysteem om te scoren infiltratie van ontstekingscellen op H & E gekleurde dia's (0: geen cel infiltratie; 4: overvloedig cel infiltratie). Evalueer scores door het onderzoeken van beide knieën in een geblindeerde wijze.

5. Meting van botverlies in de knieën met de hoge-resolutie Micro-computertomografie (micro-CT) System

1. Op dag 10 na de inductie van artritis, verdoven muizen met 2% isofluraan en voor te bereiden voor de beeldvorming.
2. positie mice met de knieën naar boven in de kamer.
3. Met een hoge-resolutie micro-CT-systeem te verwerven in vivo beeldvorming van het bot architectuur rond de knieën van de muizen.
4. Voer micro-CT scans met een lengte van 2,2 mm, zoals muis kniegewrichten met de volgende parameters: 10,5 um voxelafmeting bij 55 kv, 145 uA 200 ms integratietijd, 211 beelden.
5. Import micro-CT-beelden en vastleggen frontale vlak beelden na verdere beeldverwerking (volume rendering en transformatie) (Figuur 5).

Resultaten

Zoals hier getoond, op dag 28, Ag-specifieke Tregs zakelijk weergegeven CD3 en Ag-specifieke TCR, twee T-cel markers. De CD3 ⁺ TCRVβ5 ⁺ populatie CD4 tot expressie. De meeste van de CD3 ⁺ CD4 ⁺ TCRVβ5 ⁺ cellen ook tot expressie CD25, CD127, en CTLA-4, die typisch bij verhoogde hoeveelheden worden uitgedrukt in natuurlijk voorkomende T _regs (nTregs) en T-cellen die ectopisch Foxp3. Foxp3 expressie in iPSC-afgeleide cellen b...

Discussie

In dit protocol, een cruciale stap is in vitro differentiatie van TCR / Foxp3-gen getransduceerd iPSCs. In vitro Notch signalering induceert ontwikkeling is in de T-cellijn. Om iPSCs differentiëren in CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs, gebruikten we de OP9-DL1 / DL4 / IA ^B-cellen, die zeer express MHC II (IA ^b) moleculen. De meeste iPSCs differentiëren in CD4 ⁺ cellen. Na de oppervlak TCR-expressie vele gedifferentieerde pre-T-cellen verliezen het vermogen om te...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
C57BL/6j muizen	Jackson Laboratory	664
B6.129S7 Rag1tm1Mom/J	Jackson Laboratory	2216
Anti-CD3 (2C11) antilichaam	BD Pharmingen	553058
Anti-CD28 (37.51) antilichaam	BD Pharmingen	553295
Anti-CD4 (GK1.5) antilichaam	Biolegend	100417
Anti-CD8 (53–6.7) antilichaam	Biolegend	100714
Anti-CD25 (3C7) antilichaam	Biolegend	101912
Anti-TCR-β (H57597) antilichaam	Biolegend	109220
Anti-IL10	Biolegend	505010
Anti-TGFβ	Biolegend	141402
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
FBS	Hyclone	SH3007.01
Brefeldin A	Sigma	B7651
Polybrene	Sigma	107689
Genejammer	Integrated science	204130
ACK Lysis buffer	Lonza	10-548E
mFlt-3L	peprotech	250-31L
mIL-7	peprotech	217-17
Gelatine	Sigma	G9391
Paraformaldehyde	Sigma	P6148-500G	Let op: Allergeen, kankerverwekkend, giftig
Permeabilisatie buffer	Biolegend	421002
mBSA	Sigma	A7906
Ova albumine	Avantor	0440-01
CFA	Difco	2017014
Tailveiner begrenzer	Braintree scientific	RTV 150-STD