Zebravissen ontwikkelen zich tot een waardevol model voor de verwerking van voedingslipiden en metabole ziekten. Beschreven worden protocollen van lipide-rijke larvale voeders, live beeldvorming van voedingsfluorescente lipide-analoga en kwantificering van voedselinname. Deze technieken kunnen worden toegepast op een verscheidenheid aan screenings-, beeldvormings- en hypothesegestuurde onderzoekstechnieken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Vetrijke Feeding Paradigm voor larvale zebravis: Voeden, Live Imaging, en kwantificering van voedselinname
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zebravissen ontwikkelen zich tot een model voor de verwerking van voedingslipiden en metabole ziekten. Dit protocol beschrijft hoe larvale zebravissen een lipiderijke maaltijd kunnen worden gevoerd, die bestaat uit een emulsie van kippenlegueel-liposomen, gemaakt door het sonificeren van het eigeel in embryomedia. Gedetailleerde instructies worden gegeven om de larven te screenen op eigeelconsumptie, zodat larven die niet voeren de experimentele resultaten niet zullen verwarren. De kippenlegueel-liposomen kunnen worden verrijkt met fluorescerende lipide-analoga, inclusief vetzuren en cholesterol, waardoor zowel systemische als subcellulaire visualisatie van de verwerking van voedingslipiden mogelijk is. Er worden verschillende methoden beschreven om larven te monteren die bevorderlijk zijn voor korte- en langetermijnbeeldvorming met zowel rechtopstaande als omgekeerde objectieven bij hoge en lage vergroting. Daarnaast wordt een assay gepresenteerd om de voedselinname van larven te kwantificeren door de lipiden van larven gevoed met fluorescerende lipide-analoga te extraheren, de lipiden op een dunnelaagchromatografieplaat aan te brengen en de fluorescentie te kwantificeren. Ten slotte worden kritische aspecten van de procedures, belangrijke controles, opties voor het wijzigen van de protocollen om specifieke experimentele vragen aan te pakken en mogelijke beperkingen besproken. Deze technieken kunnen niet alleen worden toegepast op gerichte, hypothesegestuurde onderzoeken, maar ook op een verscheidenheid aan screenings- en live-imagingtechnieken om de stofwisseling van voedingslipiden en de controle van voedselinname te bestuderen.
Inleiding
De mechanismen waarmee de darm reguleert dieet lipide verwerking, de lever stuurt complex lipidesynthese en lipoproteïne metabolisme, en hoe deze organen met het centrale zenuwstelsel voedselinname zijn onvolledig begrepen. Het is van biomedische belang deze biologie verhelderen in het licht van de huidige epidemieën van zwaarlijvigheid, hart- en vaatziekten, diabetes en niet-alcoholische steatohepatitis. Studies in celcultuur en muizen hebben op voorwaarde dat de meerderheid van onze kennis van de mechanistische relaties tussen de voeding vetten en de ziekte, en de zebravis (Danio rerio) zijn in opkomst als een ideaal model om dit werk aan te vullen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze protocollen zijn goedgekeurd door het Carnegie Institution for Science Institutional Animal Care en gebruik Comite (protocol nr. 139).
1. Dierlijke Voorbereiding
- Handhaaf volwassenen en larven bij 28 ° C op een 14 uur: 10 uur licht: donker cyclus. Feed volwassenen tweemaal daags met shell gratis Artemia (decapsulated, niet uitkomen, te beginnen bij 14 DPF) en commerciële micropellets.
- Deze protocollen zijn geoptimaliseerd voor het gebruik van 6-7 dpf larven door natuurlijke paaien van de AB achtergrond verzameld. Protocollen kunnen worden aangepast voor de larven van andere leeftijden en achtergronden. Bieden geen exogeen vo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Bij toediening op een rocker bij 29-31 ° C, zal de meerderheid van gezonde larven (≥95%) eten op 1 uur. Na het nuttigen van het eigeel emulsie, de larvale darm donkerder van kleur. Zeer donkere darmen kan worden waargenomen bij 2 uur (figuur 1). Als larven zijn unfed of niet te voeden, de darm blijft duidelijk. Larven gevoed eiwit vertonen een opgezwollen darmlumen die niet donkerder van kleur.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven technieken kunnen onderzoekers larvale zebravis behandelen met een lipide-rijke voeding, visualiseren dieet lipide verwerking in levende larven, en te kwantificeren larvale voedselinname. Om succes te garanderen, moet speciale aandacht worden besteed aan een aantal kritische stappen. Commerciële kippeneieren variëren; mogelijke variabiliteit te minimaliseren voeren wij alle assays biologische eieren van kooi-kippen die niet zijn verrijkt voor omega-3 vetzuren. Lagere voeden tarieven kunnen worden waar.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs danken Meng-Chieh Shen voor de afbeeldingen, Jennifer Anderson voor het geven van nuttige commentaren op het manuscript, en leden van het Farber laboratorium voor hun bijdragen bij het ontwikkelen van deze technieken. Dit onderzoek werd gefinancierd door NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker en Co-PI S.A.F) en F32DK096786 (J.P.O.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van NIH. Aanvullende ondersteuning werd verstrekt door de G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation aan het labo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Anesthesie voor larven van zebravisjes |
| Chicken eggs | N/A | N/A | Organische, kooi-vrije eieren, niet verrijkt met omege-3 vetzuren |
| Ultrasonic processor 3000 sonicator | Misonix, Inc. | S-3000 | Om liposomen uit eigeel te maken |
| Sonabox acoustic enclosure | Misonix, Inc. | 432B | Om liposomen uit eigeel te maken |
| 1/8” tapered microtip | Misonix, Inc. | 419 | Om liposomen uit eigeel te maken |
| Amber vials (4 ml, glass) | National Scientific | 13-425 | Lipide opslag; inclusief flesjes, open-top doppen en dop septa |
| Incu-Shaker Mini | Benchmark | 1222U12 | Geïncubeerde shaker voor voeding |
| BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Fluorescente lipide analoog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Zuur) |
| BODIPY FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Fluorescente lipide analoog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Zuur) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Fluorescente lipide analoog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Zuur) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Fluorescente lipide analoog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid) |
| TopFluor cholesterol | Avanti Polar Lipids Inc. | 810255 | Fluorescente lipide analoog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol |
| Fatty acid-free BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G | Voor TopFluor cholesterol solubilisatie |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | Bevestigingsmedium voor live larven beeldvorming; 75 x 25 x 1 mm |
| Low melt agarose | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Bevestigingsmedium voor live larven beeldvorming; 22 x 30 |
| VWR microscope slides | VWR | 16004-422 | Larven monteren voor live beeldvorming |
| Coverslips | Cover Glass | 12-544A | Larven monteren voor live beeldvorming |
| Super glue | Loctite | LOC01-30379 | Larven monteren voor live beeldvorming |
| FluoroDish (glass bottom dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | Larven monteren voor live beeldvorming; 35 mm schaal, 23 mm glas, 0,17 mm glas dikte |
| Confocal microscope | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Microscoop voor hoge vergroting live beeldvorming |
| Stereoscope | Nikon | SM21500 | Microscoop voor lage vergroting live beeldvorming |
| Glass culture tubes | Kimble | 73500-13100 | Lipide extractie; (13 x 100 mm; 13 ml) |
| Savant SpeedVac Plus | ThermoQuest | SC210A | Lipide extractie |
| Channeled TLC plates | Whatman Scientific | WC4855-821 | Voedselinname test; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um dik; Uit productie |
| Channeled TLC plates | Analtech, Inc. | 66911 | Voedselinname test; Directe vervanging voor Whatman Scientific TLC platen |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GE Healthcare | 9410 | Fluorescente platenlezer voor voedselinname test |
| ImageQuant software | GE Healthcare | 29000605 | Analyse van voedselinname test |
| 5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets | Kimble | 63A53WT | Overbrengen van larven |
Referenties
- Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4 (4), 501(2009).
- Babin, P. J., Vernier, J. M. Plasma lipoproteins in fish. J Lipid Res. 30 (4), 467-489 (1989).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
